TW201619194A - 特異性結合至人類vasa蛋白質的抗體、抗體製劑、經分離核酸分子、細胞及分離表現vasa蛋白質的細胞的方法 - Google Patents

特異性結合至人類vasa蛋白質的抗體、抗體製劑、經分離核酸分子、細胞及分離表現vasa蛋白質的細胞的方法 Download PDF

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Abstract

本發明揭露以高親和力特異性結合至VASA的抗VASA抗體（mAb），具體而言為人類化mAb。提供這些抗VASA mAb的輕鏈及重鏈的CDR的胺基酸序列，以及這些CDR的共同序列。本發明亦提供編碼所述抗VASA mAb的核酸分子、表現載體、宿主細胞、製造所述抗VASA mAb的方法以及表現所述抗VASA mAb的方法。最後，揭露使用所述抗VASA mAb分離及/或純化表現VASA的細胞的方法。

Description

抗VASA抗體、及其製造方法與應用
本申請案主張2014年9月16日申請的美國臨時申請案第62/051,130號及2014年12月8日申請的美國臨時申請案第62/089,054號的優先權益，所述申請案的全部內容以全文引用的方式併入本文中。
本發明大體上關於抗體、其製造以及應用。特定言之，本發明關於特異性結合至人類VASA蛋白質的抗體，製造所述抗體的方法，以及使用所述抗體的診斷、治療以及臨床方法。
VASA蛋白質在果蠅（Drosophila ）中鑑別為編碼DEAD家族ATP依賴性RNA解旋酶的生殖質的組分（梁（Liang）等人(1994),發展 （Development ）, 120:1201-11；拉斯科（Lasko）等人(1988), 自然（Nature ） 335:611-17）。VASA的分子功能針對結合參與生殖細胞建立、卵子生成以及轉譯開始的標靶mRNA（加維斯（Gavis）等人 (1996),發展 110:521-28）。VASA為極細胞（pole cell）形成所需且在整個產生中僅僅限於生殖細胞系。
已經在多種動物物種中分離Vasa 同源基因，且VASA可在大多數動物物種中用作生殖細胞系的分子標記（諾斯（Noce）等人 (2001),細胞結構及功能 （Cell Structure and Function ） 26:131-36）。卡斯特里隆（Castrillon）等人 (2000),美國國家科學院院刊 （Proc. Natl. Acad. Sci. ）(USA) 97(17):958590-9590，例如論證人類Vasa 基因在卵巢及睪丸中表現但在體細胞組織中不可偵測。
哺乳動物卵巢的體細胞組織中哺乳動物雌性生殖系幹細胞，亦稱為卵原幹細胞或卵巢幹細胞（OSC）或卵前驅體細胞的存在最初描述於強森（Johnson）等人 (2004),自然 428:145-50中，且現在已經其他研究組確認（例如鄒（Zou）等人 (2009),自然細胞生物學 （Nature Cell Biology ）, 線上公開DOI: 10.1038/ncb1869；特爾弗（Telfer）及阿爾韋蒂（Albertini） (2012),自然醫學 （Nature Medicine ） 18(3):353-4）。OSC製造用於人工繁殖技術（artificial reproduction technology；ART），包含活體外受精（IVF）的卵母細胞，或作為用於粒線體轉移至卵母細胞的高度功能性粒線體的來源的潛在應用，以及OSC治療多種更年期症狀的應用已經描述於科學及專利文獻中（例如蒂莉（Tilly）及特爾弗 (2009),分子人類生殖學 （Mol. Hum. Repro. ） 15(7):393-8；鄒等人 (2009), 前述；特爾弗及阿爾韋蒂 (2012), 前述；懷特（White）等人 (2012),自然醫學 18(3):413-21；WO 2005/121321；美國專利第7,955,846號；美國專利第8,652,840號；WO2012/142500；美國專利第8,642,329號以及美國專利第8,647,869號）。
當OSC最初藉由強森等人 (2004), 前述表徵時，論證表現VASA蛋白質的細胞及針對VASA蛋白質的抗體已經用於自卵巢組織勻漿分離OSC（例如鄒等人 (2009), 前述；懷特等人 (2012), 前述）。此外，懷特等人 (2012), 前述論證針對VASA的N端域的抗體不能用於分離有活力的表現VASA的OSC，而針對C端域的抗體可有效分離細胞，表明C端域而非N端域為細胞外且因此可接近抗體。
抗VASA多株抗體的製造最初描述於卡斯特里隆等人 (2000), 前述及WO01/36445中。針對人類VASA蛋白質的C端部分的多株抗體可購自抗體劍橋公共有限公司（英國劍橋（Cambridge, UK）；產品碼AB13840），及R&D系統公司（明尼蘇達州明尼阿波利斯（Minneapolis, MN）；目錄號AF2030），且針對人類VASA的N端部分的單株抗體亦可購自R&D系統公司（明尼蘇達州明尼阿波利斯；目錄號AF2030），
然而，仍需要針對VASA的C端細胞外域的用於鑑別（例如藉由免疫組織化學或標記抗體）及分離（例如藉由磁性或螢光激活細胞分選（fluorescence activated cell sorting））表現VASA的細胞（包含（但不限於）OSC）的高親和力抗體。
本發明揭露抗VASA抗體（mAb），尤其以高親和力特異性結合至VASA的人類化mAb。提供這些抗VASA mAb的輕鏈及重鏈的CDR的胺基酸序列，以及這些CDR的共同序列。本發明亦提供編碼所述抗VASA mAb的核酸分子、表現載體、宿主細胞，製造所述抗VASA mAb的方法，以及表現所述抗VASA mAb的方法。最後，揭露使用所述抗VASA mAb分離及/或純化表現VASA的細胞的方法。
下文說明且描述本發明的這些及其他態樣及實施例。在檢查以下圖式及具體實施方式後，其他系統、方法以及特徵對於所屬領域中具通常知識者將變得顯而易見。意圖所有此類額外系統、方法以及特徵包含在本說明書內、在本發明的範疇內，且受隨附申請專利範圍保護。
本發明關於經分離抗體（Ab），尤其以高親和力特異性地結合至VASA的Ab。在某些實施例中，抗VASA Ab衍生自特定重鏈及輕鏈序列及/或包括特定結構特徵，諸如包括特定胺基酸序列的CDR區。本發明提供經分離抗VASA Ab，製造所述抗VASA Ab的方法，包括所述抗VASA Ab的免疫結合物及雙特異性分子，以及表現所述抗VASA Ab的方法。本發明亦關於使用抗VASA Ab分離及/或純化表現VASA的細胞，包含哺乳動物雌性生殖系幹細胞或卵原幹細胞（oogonial stem cell；OSC）或卵前驅體細胞以及其祖細胞（progenitor cell）的方法。
為了使本發明可更容易理解，對某些術語進行定義。在整個實施方式中，闡述其他定義。定義
如本文所用，術語「抗體」或縮寫「Ab」包含有或無天然糖基化的整個抗體及其任何抗原結合片段（亦即「抗原結合部分」）或單鏈。完整「抗體」指包括藉由雙硫鍵互連的至少兩個重（H）鏈及兩個輕（L）鏈的醣蛋白或其抗原結合部分。各重鏈包含重鏈可變區(VH )及重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個域（domain）CH1 、CH2 以及CH3 。各輕鏈包含輕鏈可變區（VL ）及具有一個域CL 的輕鏈恆定區。VH 及VL 區可進一步再分成互補決定區（complementarity determining region；CDR）及構架區（framework region；FR）。VH 及VL 區各包含三個與抗原（例如VASA）相互作用的CDR，稱為CDR1、CDR2以及CDR3。
如本文所用，術語抗體的「抗原結合部分」指保留特異性結合至抗原（例如VASA）的能力的抗體的一或多個片段。涵蓋在術語抗體的「抗原結合部分」內的結合片段的實例包含Fab片段、F(ab')2 片段、Fab'片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段、dAb片段以及經分離CDR。
如本文所用，術語「單株抗體」或「單株抗體製劑」指主要由具有單一重鏈胺基酸序列及單一輕鏈胺基酸序列的抗體（但其可具有異質糖基化）組成的抗體分子的製劑。
如本文所用，術語「人類化抗體」包含恆定區及可變區構架區（FR）衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列但CDR並非如此的抗體。
如本文所用，術語「重組抗體」包含藉由重組方式製備、表現、產生或分離的所有抗體。在某些實施例中，重組抗體自經轉型以表現抗體的宿主細胞（例如自轉染瘤）分離。在其他實施例中，重組抗體自重組組合抗體庫，諸如噬菌體呈現庫分離。重組抗體亦可藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式製備、表現、產生或分離。
如本文所用，術語「同型」指藉由恆定區基因編碼的重鏈類（例如對於人類抗體，IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM）或輕鏈類（例如在人類中κ或λ）。術語「亞型」指亞型內的子類（例如在人類中IgA1 、IgA2 、IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 ）。
短語對特定抗原「具有特異性的抗體」在本文中可與短語與特定抗原「特異性結合的抗體」互換使用。如本文所用，術語「Ka 」指締合速率且術語「Kd 」指特定抗體-抗原複合物的解離速率。術語「KD 」指解離常數，其獲自Kd 與Ka 的比且表示為莫耳濃度（M）。根據一些實施例，「特異性結合至人類VASA」的抗體意圖指以5 × 10-8 M或小於5 × 10-8 M，更佳1 × 10-8 M或小於1 × 10-8 M的KD 結合至人類VASA的抗體。
除非另外定義，否則本文中所用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域中具通常知識者通常所理解相同的含義。儘管類似或等效於本文所述的那些方法及材料的方法及材料可用於實踐或測試本發明，但下文描述適合方法及材料。所有公開案、專利申請案、專利以及提及的其他參考案以全文引用的方式併入本文中。在衝突的情況下，本說明書（包含定義）將占主導。此外，材料、方法以及實例僅為說明性的且並不欲限制。抗 VASA 抗體
本發明提供多種針對人類VASA蛋白質，尤其C端區具有高親和力的新穎抗體。抗體可包括本文中揭露的完整VH及VL區，或可僅包括本文中揭露的CDR序列。此外，基於本文中揭露的CDR序列，提供CDR序列的序列基元（sequence motif），且抗體可包括由基元定義的CDR序列。
本發明的CDR序列（包含圖11及圖12中所揭露的CDR及由本文中揭露的序列基元定義的CDR兩者）可根據所屬技術領域中熟知的方法與其他免疫球蛋白序列組合以製造具有藉由本發明的CDR決定的抗原結合特異性的免疫球蛋白分子。
在一些實施例中，本發明的CDR與來自其他抗體的構架區（FR）及恆定域（CH或CL）序列組合。舉例而言，儘管本文中揭露的CDR中的一些衍生自鼠融合瘤且具有鼠FR及恆定域序列，其可與人類或其他哺乳動物FR及恆定域序列重組以製造人類化或其他重組抗體。所述重組抗體的製造為於本領域具有通常知識者眾所周知且僅需要常規實驗。
包含於所述重組抗體中的恆定區的類型可根據其預期應用選擇。舉例而言，若抗體意欲用於靶向表現VASA的細胞以便破壞的治療應用，則可使用IgG亞型的重鏈恆定域（亦即Fc區）。若抗體僅意欲作為標記細胞的試劑（例如用於螢光激活細胞分選（FACS）），則完整抗體、抗原結合片段（Fab）、單鏈可變片段（Fsc）、單域抗體（sdAb）或甚至非抗體免疫球蛋白分子（例如MHC受體細胞外域）可與本發明的CDR一起使用。
本發明的CDR可獨立地選擇以使得給定可變輕（VL）鏈或可變重（VH）鏈的CDR1、CDR2以及CDR3序列可選自不同原始VL及VH鏈、不同VL及VH CDR基元或所揭露CDR與基元的組合。然而，輕鏈CDR的序列應選自所揭露的VL CDR或VL CDR基元，且重鏈CDR的序列應選自所揭露的VH CDR或VH CDR基元。類似地，對於VL或VH鏈按需要，CDR1區的序列應選自所揭露的CDR1或CDR1基元序列，CDR2區的序列應選自所揭露的CDR2或CDR2基元序列，且CDR3區的序列應選自所揭露的CDR3或CDR3基元序列。使用抗 VASA 抗體偵測或分離細胞的方法
本發明的抗VASA抗體可用於免疫親和力純化、免疫組織化學以及免疫療法的標準方法，但特定應用於表現VASA蛋白質的細胞及組織。
舉例而言，本發明的抗VASA抗體可用於自僅包含一部分表現VASA的細胞的混合細胞群體分離表現VASA的細胞。舉例而言，已經發現雌性生殖系幹細胞或卵原幹細胞或其前驅體以極低比例存在於卵巢組織中。卵巢組織（例如卵巢表面上皮及/或皮質）可經切除，解離成個別細胞，以及經受諸如使用螢光標記抗VASA抗體的FACs或使用固定抗VASA抗體的免疫親和力純化的技術。經分離的表現VASA的細胞在輔助繁殖技術中具有多種效用，如上文所描述。
或者，可使用本發明的抗VASA抗體進行免疫組織化學以鑑別表現VASA的細胞或組織及/或將所述細胞中的VASA表現定量。
此外，本發明的抗VASA抗體可在治療上用於靶向表現VASA的細胞以便藉由抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）或包括結合至輻射或化療毒性部分的本發明的抗VASA抗體的免疫毒素破壞。亦可使用本發明的抗VASA抗體的抗體-藥物結合物來將治療藥物遞送至表現VASA的細胞。編碼抗 VASA 抗體的核酸分子
本發明亦提供編碼本發明的抗VASA抗體的核酸分子。所述核酸可使用通用基因密碼的標準表選擇將編碼所需胺基酸序列的密碼子設計，或可使用反映不同有機體的密碼子偏倚特徵的專門密碼子表。因此，例如，為了優化本發明的抗VASA抗體在CHO細胞中的表現，可使用針對CHO細胞優化的密碼子表設計編碼所需抗體的核酸。
編碼本發明的抗VASA抗體的核酸可包含於所屬領域中已知的廣泛多種載體中，包含選殖載體（例如細菌或哺乳動物選殖載體）、轉型載體（例如同源重組、病毒整合或自主複製載體）以及表現載體（例如高複本數、誘導性或組成性哺乳動物表現載體）。表現抗 VASA 抗體的細胞
亦提供表現編碼本發明的抗VASA抗體的異源序列的宿主細胞。所述宿主細胞可適用於本發明的抗VASA抗體的商業製造，且可藉由用上文所描述的表現載體轉型合適宿主細胞製造。
在一些實施例中，本發明提供表現本發明的抗VASA抗體的哺乳動物細胞，包含CHO細胞。然而，於本領域具有通常知識者可在多種宿主細胞，包含細菌、酵母、昆蟲以及哺乳動物系統中表現抗體。參見例如維爾馬等人 (1998), 免疫法期刊（J. Immunol. Methods ） 216(1-2):165-81，其以全文引用的方式併入本文中。實例 免疫原性 肽
以下肽用作免疫原以產生針對人類VASA的C端域的抗體且以篩選以高親和力與VASA結合的抗體： VASA-1（V1）免疫原：SQAPNPVDDE（SEQ ID NO:1殘基712-721） VASA-2（V2）免疫原：GKSTLNTAGF（SEQ ID NO:1殘基700-709）
如圖3中所示，這些免疫原包括來自VASA的C端域的在人類VASA蛋白質與小鼠VASA同源物之間高度保守的胺基酸序列。融合瘤 產生
融合瘤在單獨實驗中用VASA肽免疫原V1及V2（如上文所述）形成。肽藉由標準方法結合至載體蛋白。使用結合肽來對小鼠進行免疫接種，及經由用結合肽增強來增加免疫反應。在血清中的抗體效價增加一定時段之後，處死動物且移除脾臟。脾臟B細胞融合至小鼠融合搭配物細胞株（mouse fusion partner cell line）（SP2-0）以便分離及選殖。融合瘤藉由在限制稀釋下生長形成，且純系（clone）藉由選殖滴定實驗產生。藉由ELISA分析檢查VASA反應性抗體的存在。融合瘤藉由在限制稀釋細胞選殖下接種的細胞的生長及穩定化衍生。
將在VASA/DDX4多肽的C端域的區域中VASA反應性抗體的結合與結合對照抗體（AB13840，英國劍橋抗體劍橋公共有限公司）相比以描繪結合抗原決定基的類似性。例示性結果顯示於圖4中。融合瘤 的分析
將融合瘤腹膜內注射至小鼠中且在允許生長一定時段之後，收集腹水且純化（均使用標準程序），且隨後藉由ELISA分析。
腹水衍生的抗體與VASA、VASA-1以及VASA-2多肽的結合用於選擇抗體作進一步分析。舉例而言，如圖7中所示，將四種抗VASA融合瘤抗體（2M1/1K3、2M1/1K23、2M1/1L5以及2M1/2K4）的結合與不為VASA特異性的兩個陰性對照（2M1/1F5及2M1/1H5）及/或與1E9-λ抗體（下文描述）相比。重組庫汰選
作為融合瘤技術的替代方案，使用噬菌體呈現技術進行針對人類VASA/DDX4的胺基酸殘基700-724的抗體的產生。噬菌體呈現庫由來自約40名供血者的正常B細胞的池（pool）形成。噬菌體用於呈現抗體的scFv鏈。
針對VASA/DDX4 700-724肽汰選人類原始scFv庫的結果如下表1中所示： 表1
在3及4個選擇回合之後鑑別的單一群落的ELISA結果顯示於以下表2至表4中。兩個純系值得重視：「1A12」（板1，A行，12列）及「1E9」（板1，E行，9列）。 表2 表3 表4
在5個選擇回合之後鑑別的單一群落的ELISA結果顯示於以下表5至表7中。值得重視的純系包含1A11、1B4、1B7、1D4、1D5、1E2、1E3、1F7、1G3、1G12、2B8、2C7、2E11、2F1、2G8、2G10、2H9、3B2、3B5、3B7、3D11、3E5、3E12、3F6以及3H11。 表5 表6 表7
以粗體形式顯示的純系經PCR擴增。轉化成 scFv-Fc 融合體及在哺乳動物細胞中表現
在5個汰選回合之後，DNA消化圖樣顯示來自第5汰選回合的許多純系相同，指示不需要額外選擇及ELISA分析回合。
選擇兩個獨特純系（1A12、1E9）來轉化成scFv-Fc融合體以便在哺乳動物細胞中表現且以用於ELISA及FACS分析。圖5A顯示劑量反應結合曲線，其指示1E9的EC50為0.02779 nM且1A12的EC50為0.2156 nM。此外，圖5B顯示用V1及V2 VASA肽的ELISA分析的結果，其表明1E9結合與市售兔多株抗體（AB13840，英國劍橋抗體劍橋公共有限公司）相同的抗原決定基。
比較兩種不同形式的1E9抗體：IgG及scFv-Fc。如圖6A中所示，1E9 IgG的EC50為0.08919 nM且1E9 scFv-Fc的EC50為0.3072 nM。此外，如圖B中所示，兩種形式均對VASA-1抗原決定基具有特異性。合成抗體基因製造
採用以下步驟製造合成抗體基因：
（ 1 ）融合瘤抗體的亞型測定 。 使用市售套組根據製造商的方案（例如小鼠單株抗體同種分型套組（Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit），目錄號MMT1，英國基德靈頓AbD塞奧泰克（AbDSerotech, Kidlington, UK））測定融合瘤抗體的IgG亞型。圖8顯示來自八種融合瘤的抗VASA抗體（2M1/1L20、2M1/1J20、1M1/1C9、2M1/1N3、2M1/1K23、1M1/1L5以及2M1/2K4）的亞分型分析的結果。所有抗體為IgG1、IgG2a或IgG2b。
（ 2 ）簡併引子 合成。 基於所測試的八種融合瘤抗體的亞型信息，使用來自小鼠IgG資料庫（亦即國際免疫遺傳學資訊系統®（International Immunogenetics Information System®）或IMGT資料庫；參見勒弗朗（Lefranc）等人 (2003),白血病 （Leukemia ） 17:260-266，及阿拉姆亞（Alamyar）等人 (2012),分子生物學方法 （Methods Mol. Biol. ） 2012; 882:569-604）的序列資訊設計小鼠IgG VH及VL的簡併引子。十個簡併正向引子經設計且合成用於VH鏈且十個用於VL鏈（9個用於κ且一個用於λ鏈）。此外，設計及合成兩個簡併反向引子用於VH鏈（一個用於IgG1及IgG2b亞型，且一個用於IgG2a亞型）及五個用於VL鏈（四個用於κ且一個用於λ鏈）。
（ 3 ） RNA 提取、擴增、選殖以及定序。 藉由標準技術自融合瘤細胞提取RNA，第一股cDNA合成藉由標準技術使用基因特異性及寡聚(dT)引子進行，且cDNA使用基因特異性引子擴增。擴增DNA隨後接合至市售細菌選殖載體（pMD18-T，中國北京義翹神州生物技術有限公司（Sino Biological, Inc., Beijing, China））。進行標準方法以將接合產物轉型成大腸桿菌（E. coli ）DH5a，及將陽性純系定序。抗體序列分析
製造潛在適用抗Vasa抗體的純系經DNA定序且推斷對應胺基酸序列。揭露八種衍生自上文所描述的融合瘤的抗體（亦即1N23、1K23、2K4、1C9、1J20、1L20、1K3、1L5）、四種衍生自在收縮下製造的融合瘤的額外抗體（亦即CTA4/5、CTB4/11、CTC2/6、CTD2/6）以及兩種衍生自噬菌體呈現的抗體（亦即1A12及1E9）的序列。可變輕鏈序列
1N23 的 VL. 將來自1N23融合瘤的陽性VL純系定序且發現六個編碼功能VL鏈。此六個純系稱為1N23VL5-5、1N23VL5-8_0816、1N23VL1-8、1N23VL1-2_0820、1N23VL1-4_0820以及1N23VL1-2。
1K23 的 VL. 將來自1K23融合瘤的陽性VL純系定序且發現四個編碼功能VL鏈。此四個純系稱為1K23VL2-5、1K23VL2-6、1K23VL2-8_0822以及1K23VL2-3_0829。
2K4 的 VL. 將來自2K4融合瘤的陽性VL純系定序且發現八個編碼功能VL鏈。此八個純系稱為2K4VL1-3_0820、2K4VL1-4、2K4VL1-1、2K4VL1-6_0820、2K4VL2-5_0816、2K4VL2-4、2K4VL2-6_0816以及2K4VL2-5。
1C9 的 VL. 將來自1C9融合瘤的陽性VL純系定序且發現三個編碼功能VL鏈。此三個純系稱為1C9VL2-4、1C9VL2-6以及1C9VL2-3_0816。
1J20 的 VL. 將來自1J20融合瘤的陽性VL純系定序且發現三個編碼功能VL鏈。此三個純系稱為1J20VL5-2_0907、1J20VL5-6_0907以及1J20VL4-3_0907。
1L20 的 VL. 將來自1L20融合瘤的陽性VL純系定序且發現一個編碼功能VL鏈。彼純系稱為1L20VL5-0912_091。
1K3 的 VL. 將來自1K3融合瘤的陽性VL純系定序且發現四個編碼功能VL鏈。此四個純系稱為1K3VL2-5、1K3VL2-5、1K3VL2-3以及1K3VL2-4。
1L5 的 VL. 將來自1L5融合瘤的陽性VL純系定序且發現兩個編碼功能VL鏈。此兩個純系稱為1L5VL2-4及1L5VL3-1。
額外 VL. 獲得四個額外融合瘤抗體的VL序列，稱為CTA4_VL、CTB4_VL、CTC6_VL、CTD6_VL。
VL 序列比對 . 上文所描述的所有VL序列的比對顯示於圖9中。圖指示三個CDR區的大致位置（粗體，底線）及對應於各序列的SEQ ID NO。
獨特 VL CDR 序列 . 圖9的VL的獨特CDR序列的比對顯示於圖11中。在34個VL序列中，僅存在5個獨特CDR1序列、6個獨特CDR2序列以及8個獨特CDR3序列，如圖11中所示。
VL CDR 共同序列 . 基於圖11中所揭露的序列，以及天然存在的胺基酸的結構/功能特徵，可確定VL CDR的共同序列。
一個共同序列為VL CDR1基元1： X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 （SEQ ID NO:132） 其中X1 為Q、N、K、R、S或T；X2 為S、T、C、N或Q；X3 為I、L、V、M或A；X4 為V、L、I、M、A或不存在；X5 為H、K、R或不存在；X6 為S、T、C或不存在；X7 為N、Q或不存在；X8 為G、A或不存在；X9 為N或Q；X10 為T、S、C、N或Q；以及X11 為Y、F或W。在一些實施例中，X1 限於Q、K或S；及/或X2 限於S或N；及/或X3 限於I或L；及/或X4 限於V、L或不存在；及/或X5 限於H或不存在；及/或X6 限於S或不存在；及/或X7 限於N或不存在；及/或X8 限於G或不存在；及/或X9 限於N；及/或X10 限於T、S或N；及/或X11 限於Y或F。在一些實施例中，子序列X1 X2 X3 限於Q N I；在一些實施例中，子序列X1 X2 X3 限於Q S L；且在一些實施例中，子序列X1 X2 X3 限於K S L。此外，在一些實施例中，當X1 X2 X3 為Q S L或Q N I時，則X4 為V；而在其他實施例中，當X1 X2 X3 為K S L時，則X4 為L。在一些實施例中，當X9 X10 為N T時，則X11 為Y。
尤其注意SEQ ID NO: 86-88的VL CDR1序列與圖11中的其他者非常不同，替代共同序列為VL CDR1基元2： X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 （SEQ ID NO:133） 其中X1 為Q、N、K或R；X2 為S、T、C、N或Q；X3 為I、L、V、M或A；X4 為V、L、I、M或A；X5 為H、K或R；X6 為S、T或C；X7 為N或Q；X8 為G或A；X9 為N或Q；X10 為T、S或C；以及X11 為Y、F或W。在一些實施例中，X1 限於Q或K；及/或X2 限於S或N；及/或X3 限於I或L；及/或X4 限於V或L；及/或X5 限於H；及/或X6 限於S；及/或X7 限於N；及/或X8 限於G；及/或X9 限於N；及/或X10 限於T；及/或X11 限於Y。在一些實施例中，子序列X1 X2 X3 限於Q N I；在一些實施例中，子序列X1 X2 X3 限於Q S L；且在一些實施例中，子序列X1 X2 X3 限於K S L。此外，在一些實施例中，當X1 X2 X3 為Q S L或Q N I時，則X4 為V；而在其他實施例中，當X1 X2 X3 為K S L時，則X4 為L。在一些實施例中，當X9 X10 為N T時，則X11 為Y。
對於VL CDR2，一個共同序列為VL CDR2基元1： Y1 Y2 Y3 （SEQ ID NO: 134） 其中Y1 為K、R或H；Y2 為V、I、L、M、A、T、S或C；以及Y3 為S、T、C、N或Q。在一些實施例中，Y2 限於V、I、M或T；及/或Y3 限於S或N。
尤其注意SEQ ID NO: 94的VL CDR2序列與圖11中的其他者非常不同，替代共同序列為VL CDR2基元2： Y1 Y2 Y3 （SEQ ID NO: 135） 其中Y1 為D或E；Y2 為N或Q；以及Y3 為N或Q。在一些實施例中，Y1 限於D；及/或Y2 限於N；及/或Y3 限於N。
類似地，注意SEQ ID NO: 95的VL CDR2序列與圖11中的其他者非常不同，替代共同序列為VL CDR2基元3： Y1 Y2 Y3 （SEQ ID NO: 136） 其中Y1 為Q或N；Y2 為D或E；以及Y3 為K、R或H。在一些實施例中，Y1 限於Q；及/或Y2 限於D；及/或Y3 限於K。
對於VL CDR3，一個共同序列為VL CDR3基元1： Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 Z7 Z8 Z9 Z10 （SEQ ID NO: 137） 其中Z1 為S、T、C、F、Y、M、L、V、I或A；Z2 為Q、N、S、T或C；Z3 為S、T、C、G、A、H、K、R、Q、N、Y、F或W；Z4 為A、G、S、T、C、L、I、V、M、D或E；Z5 為H、K、R、E、D、S、T或C；Z6 為V、L、I、M、A、Y、F、W、S、T或C；Z7 為P、S、T、C或不存在；Z8 為S、T、C或不存在；Z9 為W、P、L、I、V、M、A、F或Y；以及Z10 為T、S、C、V、L、I、M、A。在一些實施例中，Z1 限於S、F、M或L；及/或Z2 限於Q或S；及/或Z3 限於S、G、H、Q或Y；及/或Z4 限於A、S、T、L或D；及/或Z5 限於H、E、D或S；及/或Z6 限於V、Y、F或S；及/或Z7 限於P、S或不存在；及/或Z8 限於S或不存在；及/或Z9 限於W、P、L或F；及/或Z10 限於T或V。
尤其注意SEQ ID NO: 96-98的VL CDR3序列在位置Z5 處具有正電荷，而圖11中的其他者不具有，替代共同序列為VL CDR3基元2： Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 Z7 Z8 Z9 Z10 （SEQ ID NO:138） 其中Z1 為S、T、C、F或Y；Z2 為Q或N；Z3 為S、T、C、G或A；Z4 為A、G、S、T或C；Z5 為H、K或R；Z6 為V、L、I、M或A；Z7 為P或不存在；Z8 不存在；Z9 為W、P、L、I、V、M、A、F或Y；以及Z10 為T、S或C。在一些實施例中，Z1 限於S或F；及/或Z2 限於Q；及/或Z3 限於S或G；及/或Z4 限於A、S或T；及/或Z5 限於H；及/或Z6 限於V；及/或Z7 限於P或不存在；及/或Z8 限於不存在；及/或Z9 限於W、P、L或F；及/或Z10 限於T。
尤其注意SEQ ID NO: 99-102的VL CDR3序列在位置Z5 處具有負電荷，而圖11中的其他者不具有，替代共同序列為VL CDR3基元3： Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 Z7 Z8 Z9 Z10 （SEQ ID NO:139） 其中Z1 為M、C、L、I、V、A；Z2 為Q或N；Z3 為H、K、R、Q、N、G、A、Y或F；Z4 為L、I、V、M、A、D或E；Z5 為E或D；Z6 為Y或F；Z7 為P；Z8 不存在；Z9 為W、P、L、I、V、M、A、F或Y；以及Z10 為T、S或C。在一些實施例中，Z1 限於M或L；及/或Z2 限於Q；及/或Z3 限於H、Q、G或Y；及/或Z4 限於L或D；及/或Z5 限於E或D；及/或Z6 限於Y或F；及/或Z7 限於P；及/或Z8 限於不存在；及/或Z9 限於W、P、L或F；及/或Z10 限於T。
尤其注意SEQ ID NO: 103的VL CDR3序列與圖11中的其他者非常不同，替代共同序列為VL CDR3基元4： Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 Z7 Z8 Z9 Z10 （SEQ ID NO:140） 其中Z1 為S、T或C；Z2 為S、T或C；Z3 為Y或F；Z4 為T、S或C；Z5 為S、T或C；Z6 為S、T或C；Z7 為S、T或C；Z8 為S、T或C；Z9 為W、P、F或Y；以及Z10 為V、L、I、M、A、T、S或C。在一些實施例中，Z1 限於S或T；及/或Z2 限於S或T；及/或Z3 限於Y；及/或Z4 限於T或S；及/或Z5 限於S或T；及/或Z6 限於S或T；及/或Z7 限於S或T；及/或Z8 限於S或T；及/或Z9 限於W、P或F；及/或Z10 限於V、L、I、T或S。在一些實施例中，Z1 限於S；及/或Z2 限於S；及/或Z3 限於Y；及/或Z4 限於T；及/或Z5 限於S；及/或Z6 限於S；及/或Z7 限於S；及/或Z8 限於S；及/或Z9 限於W；及/或Z10 限於V。
最後，尤其注意SEQ ID NO: 104的VL CDR3序列與圖11中的其他者非常不同，替代共同序列為VL CDR3基元5： Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 Z7 Z8 Z9 Z10 （SEQ ID NO:141） 其中Z1 為Q或N；Z2 為A或G；Z3 為W、Y或F；Z4 為D或E；Z5 為S、T或C；Z6 為R、K或H；Z7 為T、S或C；Z8 為V、I、L、M或A；Z9 為V、I、L、M或A；以及Z10 為I、L、V、M或A。在一些實施例中，Z1 限於Q；及/或Z2 限於A；及/或Z3 限於W；及/或Z4 限於D；Z5 限於S；及/或Z6 限於R；及/或Z7 限於T；及/或Z8 限於V；及/或Z9 限於V；及/或Z10 限於I。可變重鏈序列
1N23 的 VH. 將來自1N23融合瘤的陽性VH純系定序且發現所有四個編碼功能VH鏈。此四個純系稱為1N23VH3-5、1N23VH3-7、1N23VH2-1以及1N23VH1-5。
1K23 的 VH. 將來自1K23融合瘤的陽性VH純系定序且發現六個編碼功能VH鏈。此六個純系稱為1K23VH2-1_0910、1K23VH1-4_0907、1K23VH1-10_0907、1K23VH8-4_0907、1K23VH8-5_0907以及1K23VH8-9_0907。
2K4 的 VH. 將來自2K4融合瘤的陽性VH純系定序且發現四個編碼功能VH鏈。此四個純系稱為2K4VH3-8、2K4VH2-8、2K4VH1-1以及2K4VH1-4。
1C9 的 VH. 將來自1C9融合瘤的陽性VH純系定序且發現八個編碼功能VL鏈。此八個純系包含四個獨特序列，其稱為1C9VH2-404-8_1024、1C9VH2-405-12_1024、1C9VH2-411-1_1024以及1C9VH2-406-4_1024。
1J20 的 VH. 將來自1J20融合瘤的陽性VH純系定序且發現兩個編碼功能VH鏈。此兩個純系稱為1J20VH1-7_0910及1J20VH1-1-6_0829。
1L20 的 VH. 將來自1L20融合瘤的陽性VH純系定序且發現三個編碼功能VH鏈。此三個純系稱為1L20VH2-3_0903、1L20VH2-1_0907以及1L20VH2-3_0910。
1K3 的 VH. 將來自1K3融合瘤的陽性VH純系定序且發現五個編碼功能VH鏈。此五個純系稱為1K3VH6-7、1K3VH6-8_0816、1K3VH3-4、1K3VH3-4以及1K3VH3-3_0816。
1L5 的 VH. 將來自1L5融合瘤的陽性VH純系定序且發現九個編碼功能VH鏈。此九個純系稱為1L5VH003-5-8_0907、1L5VH003-6-3_0907、1L5VH001-7-6_0907、1L5VH001-6-5_0907、1L5VH001-6-11_0907、1L5VH003-6-2_0910、1L5VH001-6-12_0907、1L5VH003-3-4_0907以及1L5VH003-3-8_0907。
額外 VH. 獲得四個額外融合瘤抗體的VH序列，稱為CTA5_VH、CTB11_VH、CTC2_VH、CTD2_VH。
VH 序列比對 . 上文所描述的所有VH序列的比對顯示於圖10中。圖指示三個CDR區的大致位置（粗體，底線）及對應於各序列的SEQ ID NO。
獨特 VH CDR 序列 . 圖10的VH的獨特CDR序列的比對顯示於圖12中。在43個VH序列中，僅存在8個獨特CDR1序列、9個獨特CDR2序列以及10個獨特CDR3序列，如圖12中所示。
VH CDR 共同序列 . 基於圖12中所揭露的序列，以及天然存在的胺基酸的結構/功能特徵，可確定VH CDR的共同序列。
對於VH CDR1，一個共同序列為VH CDR1基元1： X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 （SEQ ID NO:142） 其中X1 為G或A；X2 為Y、F、W、D或E；X3 為T、S、C或M；X4 為F、Y、W、V、L、I、M或A；X5 為T、S、C、N或Q；X6 為S、T、C、A或G；X7 為Y、F、W、N、Q、G或A；以及X8 為W、A、G、Y或F。在一些實施例中，X1 限於G；及/或X2 限於Y、F或D；及/或X3 限於T或S；及/或X4 限於F或V；及/或X5 限於T、S或N；及/或X6 限於S、T或A；及/或X7 限於Y、F、N或G；及/或X8 限於W、A或Y。在一些實施例中，子序列X1 X2 X3 限於G Y T；且在一些實施例中，子序列X1 X2 X3 限於G F T。此外，在一些實施例中，子序列X1 X7 X8 限於S Y W。
尤其注意SEQ ID NO: 109-110及112的VH CDR1序列與圖12中的其他者非常不同，替代共同序列為VH CDR1基元2： X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 （SEQ ID NO: 143） 其中X1 為G或A；X2 為Y、F或W；X3 為T、S、C或M；X4 為F、Y或W；X5 為T、S或C；X6 為S、T或C；X7 為Y、F或W；以及X8 為W。在一些實施例中，X1 限於G；及/或X2 限於Y或F；及/或X3 限於T或S；及/或X4 限於F；及/或X5 限於T或S；及/或X6 限於S或T；及/或X7 限於Y或F；及/或X8 限於W。在一些實施例中，子序列X1 X2 X3 限於G Y T；且在一些實施例中，子序列X1 X2 X3 限於G F T。此外，在一些實施例中，子序列X1 X7 X8 限於S Y W。
對於VH CDR2，一個共同序列為VH CDR2基元1： Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 Y10 （SEQ ID NO: 144） 其中Y1 為I、L、V、M或A；Y2 為Y、F、H、R、K、S或T；Y3 為P、S、T、Y、F、R、K或H；Y4 為G、A、S、T、K、R、H、D或E；Y5 為T、S或不存在；Y6 為R、K、H或不存在；Y7 為N、Q、D、E、G、A或不存在；Y8 為G、A、S、T、Y或F；Y9 為D、E、A、G、N或Q；以及Y10 為T、S、I、L、V、M、A、K、R或H。在一些實施例中，Y1 限於I；及/或Y2 限於Y、H、R、K或S；及/或Y3 限於P、S、Y或R；及/或Y4 限於G、S、K或D；及/或Y5 限於T或不存在；及/或Y6 限於R或不存在；及/或Y7 限於N、D、G或不存在；及/或Y8 限於G、A、S或Y；及/或Y9 限於D、E、A或N；及/或Y10 限於T、I或K。
尤其注意SEQ ID NO: 120-121的VH CDR2序列與圖12中的其他者非常不同，替代共同序列為VH CDR2基元2： Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 Y10 （SEQ ID NO:145） 其中Y1 為I、L、V、M或A；Y2 為Y、F、H、R、K、S或T；Y3 為P、S、T、Y或F；Y4 為G、A、S、T、K、R或H；Y5 為T、S或不存在；Y6 為R、K、H或不存在；Y7 為N、Q、D、E或不存在；Y8 為G、A、S、T、Y或F；Y9 為D、E、A、G、N或Q；以及Y10 為T、S、I、L、V、M或A。在一些實施例中，Y1 限於I；及/或Y2 限於Y、H、R或S；及/或Y3 限於P、S或Y；及/或Y4 限於G、S或K；及/或Y5 限於T或不存在；及/或Y6 限於R或不存在；及/或Y7 限於N、D或不存在；及/或Y8 限於G、A、S或Y；及/或Y9 限於D、E、A或N；及/或Y10 限於T或I。
對於VH CDR3，一個共同序列為VH CDR3基元1： Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 Z7 Z8 Z9 Z10 Z11 Z12 Z13 Z14 Z15 （SEQ ID NO:146） 其中Z1 為A、G、V、L、I或M；Z2 為R、K、H、C或M；Z3 為G、A、R、K、H、S、T、Y、F、W、D、E或不存在；Z4 為Y、F、W、N、Q、G、A、R、K、H或不存在；Z5 為S、T、N、Q、E、D或不存在；Z6 為D、E或不存在；Z7 為L、I、V、M、A、S、T或不存在；Z8 為L、I、V、M、A或不存在；Z9 為G、A、R、K、H或不存在；Z10 為I、L、V、M、A、N、Q、R、K、H或不存在；Z11 為A、M、F、Y、W、S、T、G或不存在；Z12 為W、Y、F、A、G或不存在；Z13 為F、Y、W、G、A、M或C；Z14 為A、G、M、D、E、W、Y或F；以及Z15 為Y、F、W、G、A或V。在一些實施例中，Z1 限於A或V；及/或Z2 限於R、K或C；及/或Z3 限於G、R、S、Y、D或不存在；及/或Z4 限於Y、N、G、R或不存在；及/或Z5 限於S、N、E或不存在；及/或Z6 限於D或不存在；及/或Z7 限於L、S或不存在；及/或Z8 限於L或不存在；及/或Z9 限於G、R或不存在；及/或Z10 限於I、N、R、L或不存在；及/或Z11 限於A、F、S、G或不存在；及/或Z12 限於W、Y、A或不存在；及/或Z13 限於F、Y、G或M；及/或Z14 限於A、D、W或Y；及/或Z15 限於Y、F、W或G。
儘管已經在先前例示性實施例中描述且說明所揭露的主題，應瞭解本發明僅藉助於實例進行，且所揭露的主題的實施細節的許多變化可在不脫離所揭露的主題的精神及範疇的情況下進行，所揭露的主題的精神及範疇僅受以下申請專利範圍限制。
無
圖1提供來自GenBank Accession來自NP_077726的人類VASA蛋白質同功異型物1的胺基酸序列（SEQ ID NO:1）。 圖2提供來自GenBank Accession來自NP_001139357的小鼠VASA同源物蛋白質同功異型物1的胺基酸序列（SEQ ID NO: 2）。 圖3提供人類VASA蛋白質（SEQ ID NO: 1的殘基690-724）與小鼠VASA同源物（SEQ ID NO: 2的殘基691-728）的C端部分之間的胺基酸比對。 圖4A顯示與本發明抗體及對照抗體（AB13840，英國劍橋抗體劍橋公共有限公司（Abcam plc, Cambridge, UK））反應的VASA/DDX4多肽的C端域的區域且圖4B顯示對照抗體與VASA蛋白質及V1及V2多肽的結合。 圖5A顯示對1E9及1A12的VASA的親和力的劑量反應結合曲線；且圖5B顯示用VASA、V1以及V2肽的ELISA分析的結果，其表明1E9結合與市售兔多株抗體（AB13840，英國劍橋抗體劍橋公共有限公司）相同的抗原決定基（epitope）。NC =陰性對照；VASA = SEQ ID NO: 1殘基700-724；VASA-1 = V1或SEQ ID NO: 1殘基712-721；VASA-2 = V2或SEQ ID NO: 1殘基700-709。 圖6A顯示對1E9的IgG及scFv-Fc形式的VASA的親和力的劑量反應結合曲線；且圖6B顯示1E9的IgG及scFv-Fc形式與VASA、V1以及V2肽的結合的ELISA分析的結果。NC =陰性對照；VASA = SEQ ID NO: 1殘基700-724；VASA-1 = V1或SEQ ID NO: 1殘基712-721；VASA-2 = V2或SEQ ID NO: 1殘基700-709。 圖7A顯示用三種抗VASA融合瘤抗體（2M1/1K3、2M1/1K23以及2M1/1L5）及兩種不為VASA特異性的陰性對照（2M1/1F5及2M1/1H5）進行的結合實驗的結果；圖7B顯示與1E9-λ相比四種VASA特異性融合瘤抗體（2M1/1K3、2M1/1K23以及2M1/1L5）的劑量反應曲線；以及圖7C顯示與1E9-λ相比VASA特異性融合瘤抗體2M1/2K4的劑量反應曲線。 圖8顯示來自八種融合瘤的抗VASA抗體（2M1/1L20、2M1/1J20、1M1/1C9、2M1/1N3、2M1/1K23、1M1/1L5以及2M1/2K4）的亞分型分析的結果。 圖9A至圖9B顯示本發明的抗VASA的VL序列中的一些的比對。圖指示三個CDR區的大致位置（粗體，底線）及對應於各序列的SEQ ID NO。 圖10A至圖10B顯示本發明的抗VASA的VH序列中的一些的比對。圖指示三個CDR區的大致位置（粗體，底線）及對應於各序列的SEQ ID NO。 圖11顯示圖9的VL區的獨特CDR序列的比對。 圖12顯示圖10的VH區的獨特CDR序列的比對。

Claims (17)

  1. 一種特異性結合至人類VASA蛋白質的抗體，包括： 免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈， 其中所述輕鏈的可變區包括： （i）CDR1區，包括由SEQ ID NO: 83-88所構成的族群中選出的胺基酸序列； （ii）CDR2區，包括由SEQ ID NO: 89-95所構成的族群中選出的胺基酸序列；及/或 （iii）CDR3區，包括由SEQ ID NO: 96-104所構成的族群中選出的胺基酸序列。
  2. 一種特異性結合至人類VASA蛋白質的抗體，包括： 免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈， 其中所述重鏈的可變區包括： （i）CDR1區，包括由SEQ ID NO: 105-112所構成的族群中選出的胺基酸序列； （ii）CDR2區，包括由SEQ ID NO: 113-121所構成的族群中選出的胺基酸序列；及/或 （iii）CDR3區，包括由SEQ ID NO: 122-131所構成的族群中選出的胺基酸序列。
  3. 一種特異性結合至人類VASA蛋白質的抗體，包括： 免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈， 其中所述輕鏈的可變區包括： （i）CDR1區，包括由VL CDR1基元1-2所構成的族群中選出的胺基酸序列； （ii）CDR2區，包括由VL CDR2基元1-3所構成的族群中選出的胺基酸序列；及/或 （iii）CDR3區，包括由VL CDR3基元1-5所構成的族群中選出的胺基酸序列。
  4. 一種特異性結合至人類VASA蛋白質的抗體，包括： 免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈， 其中所述重鏈的可變區包括： （i）CDR1區，包括由VH CDR1基元1-2所構成的族群中選出的胺基酸序列； （ii）CDR2區，包括由VL CDR2基元1-2所構成的族群中選出的胺基酸序列；及/或 （iii）CDR3區，包括由VL CDR3基元1所構成的族群中選出的胺基酸序列。
  5. 一種抗體製劑，包括如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的抗體。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的抗體製劑，其中所述製劑為單株抗體製劑。
  7. 如申請專利範圍第5項所述的抗體製劑，其中所述製劑為至少兩種單株抗體製劑的混合物。
  8. 一種經分離核酸分子，編碼如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的重鏈或輕鏈。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的經分離核酸，其中所述核酸由以下各者所構成的族群中選出：選殖載體、表現載體、異源重組載體以及病毒整合載體。
  10. 一種細胞，用如申請專利範圍第8項至第9項中任一項所述的核酸轉型。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的細胞，其中所述細胞為哺乳動物細胞。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的細胞，其中所述細胞為嚙齒動物細胞。
  13. 如申請專利範圍第11項所述的細胞，其中所述細胞為CHO細胞。
  14. 如申請專利範圍第11項所述的細胞，其中所述細胞為人類細胞。
  15. 一種分離表現VASA蛋白質的細胞的方法，包括： （a）獲得細胞群體； （b）使所述細胞群體與如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的多種抗體接觸；以及 （c）將所述群體中特異性結合所述抗體的細胞與所述群體中不特異性結合所述抗體的細胞分離。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的分離表現VASA蛋白質的細胞的方法，其中細胞藉由螢光激活細胞分選分離。
  17. 如申請專利範圍第15項所述的分離表現VASA蛋白質的細胞的方法，其中細胞使用固定二級抗體藉由螢光激活細胞分選分離。
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