CN106573985A - 抗vasa抗体及其生产方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗VASA的抗体(mAb)，特别是以高亲和力特异性结合VASA的人源化的mAb。本发明提供了这些抗VASA mAb的轻链和重链的CDR的氨基酸序列以及这些CDR的共有序列。本公开内容还提供了编码抗VASA mAb的核酸分子、表达载体、宿主细胞、用于制备抗VASA mAb的方法以及用于表达抗VASA mAb的方法。最后，本发明公开了使用抗VASA mAb分离和/或纯化表达VASA的细胞的方法。
Description
本申请要求于2014年9月16日提交的美国临时申请号62/051,130和于2014年12月8日提交的美国临时申请号62/089,054的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本公开一般涉及抗体，其制备和用途。具体地，本公开涉及特异性结合人VASA蛋白的抗体，产生此类抗体的方法，以及使用此类抗体的诊断、治疗和临床方法。
发明背景
VASA蛋白在果蝇(Drosophila)中被鉴定为种质的组分，其编码DEAD家族ATP依赖性RNA解旋酶(Liang et al.(1994),Development,120:1201-11；Lasko et al.(1988),Nature 335:611-17)。VASA的分子功能涉及结合种质细胞的产生、卵子发生和翻译起始中的靶mRNA(Gavis et al.(1996),Development 110:521-28)。VASA是极细胞形成所需的，并且仅限于整个发育中的种质细胞谱系。
已经在各种动物种中分离了Vasa同源基因，并且VASA可以用作大多数动物种中的种质细胞谱系的分子标志物(Noce et al.(2001),Cell Structure and Function 26:131-36)。例如，Castrillon et al.(2000),Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)97(17):958590-9590表明人类Vasa基因在卵巢和睾丸中表达，但在体细胞组织中是不可检测的。
哺乳动物雌性种系干细胞(也称为卵细胞干细胞或卵巢干细胞(OSC)或卵前体细胞)在哺乳动物卵巢的体细胞组织中的存在首先描述于Johnson et al.(2004),Nature428:145-50中，并且已经被其他研究小组所证实(例如Zou et al.(2009),Nature CellBiology,已在线公开DOI:10.1038/ncb1869；Telfer&Albertini(2012),NatureMedicine18(3):353-4)。OSC用于产生用于人工繁殖技术(ART)(包括体外受精(IVF))的卵母细胞的潜在用途或作为用于线粒体转移至卵母细胞的高功能性线粒体的来源，以及OSC用于治疗绝经期的各种症状，已经被描述于科学和专利文献中(例如Tilly&Telfer(2009),Mol.Hum.Repro.15(7):393-8；Zou et al.(2009),同上；Telfer&Albertini(2012),同上；White et al.(2012),Nature Medicine 18(3):413-21；WO2005/121321；美国专利号7,955,846；美国专利号8,652,840；WO2012/142500；美国专利号8,642,329和美国专利号8,647,869)。
当OSC首次被Johnson et al.(2004)(同上)表征时，证明了细胞表达VASA蛋白，并且针对VASA蛋白的抗体已经用于从卵巢组织匀浆中分离OSC(例如Zou et al.(2009),同上；White et al.(2012),同上)。此外，White et al.(2012)(同上)证明了针对VASA的N末端结构域的抗体不能用于分离活的表达VASA的OSC，而针对C末端结构域的抗体可以有效地分离细胞，这表明C末端结构域而不是N末端结构域结构域，是细胞外的并因此对于抗体是可接近的。
抗VASA多克隆抗体的产生首次被描述于Castrillon et al.(2000)(同上)和WO01/36445中。针对人VASA蛋白的C末端部分的多克隆抗体可从Abcam plc(Cambridge,UK；产品代码AB13840)和R&D Systems,Inc.(Minneapolis,MN；目录号AF2030)商业获得，并且直接针对人VASA的N末端部分的单克隆抗体也可从R&D Systems,Inc.(Minneapolis,MN；目录号AF2030)商业获得。
然而，仍然需要针对VASA的C末端细胞外结构域的高亲和力抗体，用于鉴定(例如通过免疫组织化学或标记的抗体)和分离(例如通过磁性或荧光激活细胞分选)表达VASA的细胞，包括但不限于OSC。
发明概述
本发明公开了抗VASA抗体(mAb)，特别是以高亲和力特异性结合VASA的人源化mAb。本发明提供了这些抗VASA mAb的轻链和重链的CDR的氨基酸序列以及这些CDR的共有序列。本公开内容还提供了编码抗VASA mAb的核酸分子、表达载体、宿主细胞、用于制备抗VASA mAb的方法以及用于表达抗VASA mAb的方法。最后，本发明公开了使用抗VASA mAb分离和/或纯化表达VASA的细胞的方法。
下面示出和描述本公开内容的这些方面和其他方面和实施例方案。在查所附附图和发明详述时，其他系统、过程和特征对于本领域技术人员将变得显而易见。本发明是指所有这样的其他系统、过程和特征包括在本说明书内、在本发明的范围内，并且由所附权利要求保护。
附图简要说明
图1提供了来自GenBank登录号NP_077726的人VASA蛋白同种型1的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图2提供来自GenBank登录号NP_001139357的小鼠VASA同源蛋白同种型1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图3提供了人VASA蛋白的C末端部分(SEQ ID NO：1的残基690-724)和小鼠VASA同源物(SEQ ID NO：2的残基691-728)之间的氨基酸比对。
图4A显示了与本发明的抗体和对照抗体(AB13840，Abcam plc，Cambridge，UK)反应的VASA/DDX4多肽的C末端结构域的区域，图4B显示了对照抗体与VASA蛋白和V1和V2多肽的结合。
图5A显示1E9和1A12针对VASA的亲和力的剂量反应结合曲线；并且图5B显示了使用VASA、V1和V2肽的ELISA测定的结果，其表明1E9结合与市售兔多克隆抗体(AB13840，Abcam plc，Cambridge，UK)相同的表位。NC＝阴性对照；VASA＝SEQ ID NO：1残基700-724；VASA-1＝V1或SEQ ID NO：1残基712-721；VASA-2＝V2或SEQ ID NO：1残基700-709。
图6A显示1E9的IgG和scFv-Fc形式针对VASA的亲和力的剂量反应结合曲线；并且图6B显示1E9的IgG和scFv-Fc形式与VASA、V1和V2肽的结合的ELISA测定的结果。NC＝阴性对照；VASA＝SEQ ID NO：1残基700-724；VASA-1＝V1或SEQ ID NO：1残基712-721；VASA-2＝V2或SEQ ID NO：1残基700-709。
图7A显示了使用3个抗VASA杂交瘤抗体(2M1/1K3、2M1/1K23和2M1/1L5)和不是VASA特异性的两种阴性对照(2M1/1F5和2M1/1H5)的结合实验的结果；图7B显示了4种VASA特异性杂交瘤抗体(2M1/1K3、2M1/1K23和2M1/1L5)与1E9-λ相比的剂量反应曲线；并且图7C显示VASA特异性杂交瘤抗体2M1/2K4与1E9-λ相比的剂量反应曲线。
图8显示来自8个杂交瘤(2M1/1L20、2M1/1J20、1M1/1C9、2M1/1N3、2M1/1K23、1M1/1L5和2M1/2K4)的抗VASA抗体的亚型分析结果。
图9A-9B显示了抗VASA发明的一些VL序列的比对。该图指示三个CDR区(粗体，下划线)的大致位置和对应于每个序列的SEQ ID NO。
图10A-10B显示了抗VASA发明的一些VH序列的比对。该图指示三个CDR区(粗体，下划线)的大致位置和对应于每个序列的SEQ ID NO。
图11显示图9的VL区的独特CDR序列的比对。
图12显示图10的VH区的独特CDR序列的比对。
发明详述
本公开涉及分离的抗体(Ab)，特别是以高亲和力特异性结合VASA的Ab。在某些实施方案中，抗VASA Ab衍生自特定的重链和轻链序列和/或包含特定的结构特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR区。本公开内容提供了分离的抗VASA Ab，制备此类抗VASA Ab的方法，包含此类抗VASA Ab的免疫缀合物和双特异性分子，以及表达此类抗VASA Ab的方法。本公开该图指示三个CDR区(粗体，下划线)的大致位置和对应于每个序列的SEQ ID NO。还涉及使用抗VASA Ab分离和/或纯化表达VASA的细胞(包括哺乳动物雌性种系干细胞或卵细胞干细胞(OSC)或卵前体细胞及其祖细胞)的方法。
为了更容易地理解本公开内容，本发明定义了某些术语。在整个发明详述中阐述了其他定义。
定义
本文所用的术语“抗体”或缩写“Ab”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链，其具有或不具有天然糖基化。完整的“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白或其抗原结合部分。每条个重链包括重链可变区(VH)和重链恒定区。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链包括轻链可变区(VL)和具有一个结构域CL的轻链恒定区。VH和VL区可以进一步细分为互补决定区(CDR)和框架区(FR)。VH和VL区各自包括三个CDR，称为CDR1、CDR2和CDR3，其与抗原(例如VASA)相互作用。
本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”是指保留特异性结合抗原(例如VASA)的能力的抗体的一个或多个片段。包括在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段、dAb片段和分离的CDR。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体制剂”是指基本上由具有单重链氨基酸序列和单轻链氨基酸序列的抗体组成的抗体分子制剂(但其可具有异质糖基化)。
本文所用的术语“人源化的抗体”包括具有恒定区和可变区框架区(FR)但不具有来源于人种系免疫球蛋白序列的CDR的抗体。
本文所用的术语“重组抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有抗体。在某些实施方案中，从经转化以表达抗体的宿主细胞(例如，来自转染瘤)中分离重组抗体。在其它实施方案中，从重组的组合抗体文库(例如噬菌体展示文库)分离重组抗体。也可以通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它手段来制备、表达、产生或分离重组抗体。
本文所用的术语“同种型”是指由恒定区基因编码的重链类(例如，人抗体的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)或轻链类(例如，人中的κ或λ)。术语“亚型”是指亚型内的亚类(例如，人中的IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。
短语“特异性针对特定抗原的抗体”在本文中与短语“与特定抗原特异性结合的抗体”可互换使用。本文所用的术语“Ka”是指结合速率，术语“Kd”是特定抗体-抗原复合物的解离速率。术语“KD”是指解离常数，其由Kd与Ka的比获得并表示为摩尔浓度(M)。根据一些实施方案，“特异性结合人VASA”的抗体意指以5×10-8M或更小、更优选1×10-8M或更小的KD结合人VASA的抗体。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但合适的方法和材料如下所述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将取得控制权。此外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，而不是限制性的。
抗VASA抗体
本发明提供了对人VASA蛋白、特别是C末端区具有高亲和力的多种新抗体。抗体可以包含本文公开的完整VH和VL区，或可以仅包含本文公开的CDR序列。此外，基于本文公开的CDR序列，提供了CDR序列的序列基序，并且抗体可以包含由基序定义的CDR序列。
本发明的CDR序列(包括图11和12中公开的CDR和本文公开的序列基序定义的CDR)可以根据本领域熟知的方法与其他免疫球蛋白序列组合以产生具有由本发明的CDR确定的抗原结合特异性的免疫球蛋白分子。
在一些实施方案中，本发明的CDR与来自其他抗体的框架区(FR)和恒定结构域(CH或CL)序列组合。例如，尽管本文公开的一些CDR衍生自鼠杂交瘤并且具有鼠FR和恒定结构域序列，但是它们可以与人或其他哺乳动物FR和恒定结构域序列重组以产生人源化或其他重组抗体。此类重组抗体的产生是本领域技术人员众所周知的，并且仅需要常规实验。
包含在此类重组抗体中的恒定区的类型可以根据其预期用途进行选择。例如，如果抗体旨在用于靶向表达VASA的细胞用于破坏的治疗用途，则可以使用IgG亚型的重链恒定结构域(即Fc区)。如果抗体仅作为用于标记细胞的试剂(例如，用于荧光激活细胞分选(FACS))，则完整抗体，抗原结合片段(Fab)，单链可变片段(Fsc)，单结构域抗体(sdAb)或甚至非抗体免疫球蛋白分子(例如，MHC受体胞外结构域)可与本发明的CDR一起使用。
本发明的CDR可以独立地选择，使得给定可变轻链(VL)或可变重链(VH)的CDR1、CDR2和CDR3序列可以选自不同的原始VL和VH链，选自不同的VL和VH CDR基序，或选自所公开的CDR和基序的组合。然而，轻链CDR的序列应当选自公开的VL CDR或VL CDR基序，并且重链CDR的序列应当选自公开的VH CDR或VH CDR基序。类似地，适当时，对于VL或VH链，CDR1区的序列应当选自公开的CDR1或CDR1基序序列，CDR2区的序列应当选自公开的CDR2或CDR2基序序列，并且CDR3区的序列应当选自公开的CDR3或CDR3基序序列。
使用抗VASA抗体检测或分离细胞的方法
本发明的抗VASA抗体可用于免疫亲和纯化、免疫组织化学和免疫治疗的标准方法中，但特异性应用于表达VASA蛋白的细胞和组织。
例如，本发明的抗VASA抗体可用于从仅包含表达VASA的细胞的一部分的混合细胞群中分离表达VASA的细胞。例如，已经发现雌性种系干细胞或卵细胞干细胞或其前体以非常低的比例存在于卵巢组织中。可以切除卵巢组织(例如卵巢表面上皮和/或皮层)，解离成单个细胞，并使用荧光标记的抗VASA抗体进行诸如FAC的技术或使用固定的抗VASA抗体进行免疫亲和纯化。如上所述，分离的表达VASA的细胞在辅助生殖技术中具有多种用途。
或者，可以使用本发明的抗VASA抗体进行免疫组织化学以鉴定表达VASA的细胞或组织和/或在这样的细胞中定量VASA表达。
另外，本发明的抗VASA抗体可以治疗性地用于靶向表达VASA的细胞，以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)或包含本发明缀合至放射性或化学毒性部分的抗VASA抗体的免疫毒素进行破坏。本发明的抗VASA抗体的抗体-药物缀合物也可用于将治疗药物递送至表达VASA的细胞。
编码抗VASA抗体的核酸分子
本发明还提供了编码本发明的抗VASA抗体的核酸分子。可以使用通用遗传密码的标准表以选择将编码期望的氨基酸序列的密码子，或者可以使用反映不同生物体的密码子偏好特征的专用密码子表来设计这样的核酸。因此，例如，为了优化本发明的抗VASA抗体在CHO细胞中的表达，可以使用针对CHO细胞优化的密码子表设计编码所需抗体的核酸。
编码本发明的抗VASA抗体的核酸可以包括在本领域已知的多种载体中，包括克隆载体(例如细菌或哺乳动物克隆载体)、转化载体(例如同源重组，病毒整合或自主复制载体)和表达载体(例如，高拷贝数，诱导型或组成型哺乳动物表达载体)。
表达抗VASA抗体的细胞
本发明还提供了表达编码本发明的抗VASA抗体的异源序列的宿主细胞。这样的宿主细胞可用于商业生产本发明的抗VASA抗体，并且可以通过用上述表达载体转化合适的宿主细胞产生这样的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了表达本发明的抗VASA抗体的哺乳动物细胞，包括CHO细胞。然而，本领域技术人员可以在多种宿主细胞中表达抗体，包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物系统。参见，例如，Verma et al.(1998),J.Immunol.Methods 216(1-2):165-81，其全部内容通过引用并入本文。
实施例
免疫原性肽
下面的肽用作免疫原以生成针对人VASA的C末端结构域的抗体并筛选以高亲和力结合VASA的抗体：
VASA-1(V1)免疫原:SQAPNPVDDE(SEQ ID NO:1残基712-721)
VASA-2(V2)免疫原:GKSTLNTAGF(SEQ ID NO:1残基700-709)
如图3所示，这些免疫原包含来自VASA的C末端结构域的氨基酸序列，其在人VASA蛋白和小鼠VASA同源物之间是高度保守的。
杂交瘤的生成
在使用VASA肽免疫原V1和V2(上文)的分开实验中形成杂交瘤。通过标准方法将肽缀合到载体蛋白上。使用缀合肽免疫小鼠，并通过用缀合肽加强来增加免疫应答。在血清中增加抗体效价的时期后，处死动物并取出脾脏。将脾B细胞与小鼠融合伴侣细胞系(SP2-0)融合用于分离和克隆。通过有限稀释的生长(outgrowth)形成杂交瘤，并通过克隆滴定实验产生克隆。通过ELISA测定检查VASA反应性抗体的存在。通过在有限稀释细胞克隆下铺板的细胞的生长和稳定来衍生杂交瘤。
将VASA/DDX4多肽的C末端结构域区中VASA反应性抗体的结合与对照抗体(AB13840,Abcam plc,Cambridge,UK)的结合进行比较以描绘结合的相似性表位。示例性结果显示在图4中。
杂交瘤的分析
将杂交瘤腹膜内注射到小鼠中，并且在允许生长期之后，收集腹水并且进行纯化，均使用标准程序，然后通过ELISA分析。
腹水衍生的抗体与VASA、VASA-1和VASA-2多肽的结合用于选择用于进一步分析的抗体。例如，如图7所示，将四种抗VASA杂交瘤抗体(2M1/1K3、2M1/1K23、2M1/1L5和2M1/2K4)的结合与不是VASA特异性的两种阴性对照(2M1/1F5和2M1/1H5)的结合进行比较，和/或1E9-λ抗体的结合进行比较(如下所述)。
重组文库淘选(panning)
作为杂交瘤技术的替代方案，使用噬菌体展示技术生成针对人VASA/DDX4的氨基酸残基700-724的抗体。噬菌体展示文库由约40个供血者的正常B细胞库形成。噬菌体用于展示抗体的scFv链。
针对VASA/DDX4700-724肽淘选人初始scFv文库的结果如下表1所示：
表1
在3轮和4轮选择后鉴定的单菌落的ELISA结果显示在下表2-4中。两个克隆是值得注意的：“1A12”(板1，A行，12列)和“1E9”(板1，E行，9列)。
表2
表3
表4
5轮选择后鉴定的单菌落的ELISA结果显示在下表5-7中。值得注意的克隆包括1A11、1B4、1B7、1D4、1D5、1E2、1E3、1F7、1G3、1G12、2B8、2C7、2E11、2F1、2G8、2G10、2H9、3B2、3B5、3B7、3D11、3E5、3E12、3F6和3H11。
表5
表6
表7
粗体显示的克隆进行了PCR扩增。
转化成scFv-Fc融合体并在哺乳动物细胞中表达
在5轮淘选后，DNA消化模式显示来自第5轮淘选的许多克隆是相同的，表明不需要另外轮的选择和ELISA分析。
选择两个独特的克隆(1A12、1E9)用于转化为scFv-Fc融合体用于在哺乳动物细胞中表达以及用于ELISA和FACS分析。图5A显示了剂量反应结合曲线，其表明1E9具有0.02779nM的EC50，而1A12具有0.2156nM的EC50。此外，图5B显示了使用V1和V2VASA肽的ELISA测定的结果，其表明1E9结合与市售兔多克隆抗体(AB13840,Abcam plc,Cambridge,UK)相同的表位。
比较了1E9抗体的两种不同形式：IgG和scFv-Fc。如图6A所示，1E9IgG具有0.08919nM的EC50，1E9scFv-Fc具有0.3072nM的EC50。此外，如图6B所示，两种形式都对VASA-1表位具有特异性。
合成抗体基因产生
使用以下步骤产生合成抗体基因：
(1)杂交瘤抗体的亚型测定。使用市售试剂盒，根据制造商的操作方案(例如，Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit，目录号MMT1，AbDSerotech，Kidlington，UK)，测定杂交瘤抗体的IgG亚型。图8显示来自8个杂交瘤(2M1/1L20、2M1/1J20、1M1/1C9、2M1/1N3、2M1/1K23、1M1/1L5和2M1/2K4)的抗VASA抗体的亚型分析结果。所有抗体均为IgG1、IgG2a或IgG2b。
(2)简并引物合成。基于经测试的8个杂交瘤抗体的亚型信息，使用来自小鼠IgG数据库(即International Immunogenetics Information或IMGT数据库；参见Lefranc et al.(2003),Leukemia 17:260-266,和Alamyar et al.(2012),MethodsMol.Biol.2012；882:569-604)的序列信息设计小鼠IgG VH和VL的简并引物。设计和合成了VH链的10个简并正向引物和VL链的10个简并正向引物(9个用于κ链，1个用于λ链)。此外，设计和合成了VH链的2个简并反向引物(1个用于IgG1和IgG2b亚型，1个用于IgG2a亚型)和VL链的5个用于简并反向引物(4个用于κ链，1个用于λ链)。
(3)RNA提取、扩增、克隆和测序。通过标准技术从杂交瘤细胞提取RNA，通过使用基因特异性和oligo(dT)引物的标准技术进行第一链cDNA合成，并使用基因特异性引物扩增cDNA。然后将扩增的DNA连接到市售的细菌克隆载体(pMD18-T,Sino Biological,Inc.,Beijing,China)。进行标准方法以将连接产物转化到大肠杆菌(E.coli)DH5α中，并且对阳性克隆进行测序。
抗体序列分析
产生潜在有用的抗Vasa抗体的克隆进行DNA测序，并推导出相应的氨基酸序列。公开了衍生自上述杂交瘤的8个抗体的序列(即1N23、1K23、2K4、1C9、1J20、1L20、1K3、1L5)，衍生自在合同下产生的杂交瘤的另外4个抗体(即CTA4/5、CTB4/11、CTC2/6、CTD2/6)和来源于噬菌体展示的2个抗体(即1A12和1E9)。
可变轻链序列
1N23的VL。对来自1N23杂交瘤的阳性VL克隆进行测序，发现6个编码功能性VL链。这6个克隆被命名为1N23VL5-5、1N23VL5-8_0816、1N23VL1-8、1N23VL1-2_0820、1N23VL1-4_0820和1N23VL1-2。
1K23的VL。对来自1K23杂交瘤的阳性VL克隆进行测序，发现4个编码功能性VL链。这4个克隆被命名为1K23VL2-5、1K23VL2-6、1K23VL2-8_0822和1K23VL2-3_0829。
2K4的VL。对来自2K4杂交瘤的阳性VL克隆进行测序，发现8个编码功能性VL链。这8个克隆被命名为2K4VL1-3_0820、2K4VL1-4、2K4VL1-1、2K4VL1-6_0820、2K4VL2-5_0816、2K4VL2-4、2K4VL2-6_0816和2K4VL2-5。
1C9的VL。对来自1C9杂交瘤的阳性VL克隆进行测序，发现3个编码功能性VL链。这3个克隆被命名为1C9VL2-4、1C9VL2-6和1C9VL2-3_0816。
1J20的VL。对来自1J20杂交瘤的阳性VL克隆进行测序，发现3个编码功能性VL链。这3个克隆被命名为1J20VL5-2_0907、1J20VL5-6_0907和1J20VL4-3_0907。
1L20的VL。对来自1L20杂交瘤的阳性VL克隆进行测序，发现一个编码功能性VL链。该克隆被命名为1L20VL5-0912_091。
1K3的VL。对来自1K3杂交瘤的阳性VL克隆进行测序，发现4个编码功能性VL链。这4个克隆被命名为1K3VL2-5、1K3VL2-5、1K3VL2-3和1K3VL2-4。
1L5的VL。对来自1L5杂交瘤的阳性VL克隆进行测序，发现2个克隆编码功能性VL链。这2个克隆被命名为1L5VL2-4和1L5VL3-1。
另外的VL。获得另外4种的称为CTA4_VL、CTB4_VL、CTC6_VL、CTD6_VL的杂交瘤抗体的VL序列。
VL序列比对。上述所有VL序列的比对显示在图9中。该图指示三个CDR区(粗体，下划线)的大致位置和对应于每个序列的SEQ ID NO。
独特VL CDR序列。图9中VL的独特CDR序列的比对显示在图11中。在34个VL序列中，如图11所示，仅有5个独特的CDR1序列、6个独特的CDR2序列和8个独特的CDR3序列。
VL CDR共有序列。基于图11中公开的序列，以及天然存在的氨基酸的结构/功能特征，可以确定VL CDR的共有序列。
一个共有序列是VL CDR1基序1：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO:132)
其中X1是Q、N、K、R、S或T；X2是S、T、C、N或Q；X3是I、L、V、M或A；X4是V、L、I、M、A或不存在；X5是H、K、R或不存在；X6是S、T、C或不存在；X7是N、Q或不存在；X8是G、A或不存在；X9是N或Q；X10是T、S、C、N或Q；并且X11是Y、F或W。在一些实施方案中，X1限于Q、K或S；和/或X2限于S或N；和/或X3限于I或L；和/或X4限于V、L或不存在；和/或X5限于H或不存在；和/或X6限于S或不存在；和/或X7限于N或不存在；和/或X8限于G或不存在；和/或X9限于N；和/或X10限于T、S或N；和/或X11限于Y或F。在一些实施方案中，子序列X1X2X3限于Q N I；在一些实施方案中，子序列X1X2X3限于Q S L；并且在一些实施方案中，子序列X1X2X3限于K S L。此外，在一些实施方案中，当X1X2X3是Q S L或Q N I时，则X4是V；而在其他实施方案中，当X1X2X3是K S L时，则X4是L。在一些实施方案中，当X9X10是N T时，则X11是Y。
特别注意到SEQ ID NO：86-88的VL CDR1序列与图11中的其它序列截然不同，备选的共有序列是VL CDR1基序2：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO:133)
其中X1是Q、N、K或R；X2是S、T、C、N或Q；X3是I、L、V、M或A；X4是V、L、I、M或A；X5是H、K或R；X6是S、T或C；X7是N或Q；X8是G或A；X9是N或Q；X10是T、S或C；并且X11是Y、F或W。在一些实施方案中，X1限于Q或K；和/或X2限于S或N；和/或X3限于I或L；和/或X4限于V或L；和/或X5限于H；和/或X6限于S；和/或X7限于N；和/或X8限于G；和/或X9限于N；和/或X10限于T；和/或X11限于Y。在一些实施方案中，子序列X1X2X3限于Q N I；在一些实施方案中，子序列X1X2X3限于Q S L；并且在一些实施方案中，子序列X1X2X3限于K S L。此外，在一些实施方案中，当X1X2X3是Q SL或Q N I时，则X4是V；而在其他实施方案中，当X1X2X3是K S L时，则X4是L。在一些实施方案中，当X9X10是N T时，则X11是Y。
对于VL CDR2，一个共有序列是VL CDR2基序1：
Y1Y2Y3(SEQ ID NO:134)
其中Y1是K、R或H；Y2是V、I、L、M、A、T、S或C；并且Y3是S、T、C、N或Q。在一些实施方案中，Y2限于V、I、M或T；和/或Y3限于S或N。
特别注意到SEQ ID NO:94的VL CDR2序列与图11中的其它序列截然不同，备选的共有序列是VL CDR2基序2：
Y1Y2Y3(SEQ ID NO:135)
其中Y1是D或E；Y2是N或Q；并且Y3是N或Q。在一些实施方案中，Y1限于D；和/或Y2限于N；和/或Y3限于N。
类似地，特别注意到SEQ ID NO:95的VL CDR2序列与图11中的其它序列截然不同，备选的共有序列是VL CDR2基序3：
Y1Y2Y3(SEQ ID NO:136)
其中Y1是Q或N；Y2是D或E；并且Y3是K、R或H。在一些实施方案中，Y1限于Q；和/或Y2限于D；和/或Y3限于K。
对于VL CDR3，一个共有序列是VL CDR3基序1：
Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9Z10(SEQ ID NO:137)
其中Z1是S、T、C、F、Y、M、L、V、I或A；Z2是Q、N、S、T或C；Z3是S、T、C、G、A、H、K、R、Q、N、Y、F或W；Z4是A、G、S、T、C、L、I、V、M、D或E；Z5是H、K、R、E、D、S、T或C；Z6是V、L、I、M、A、Y、F、W、S、T或C；Z7是P、S、T、C或不存在；Z8是S、T、C或不存在；Z9是W、P、L、I、V、M、A、F或Y；并且Z10是T、S、C、V、L、I、M、A。在一些实施方案中，Z1限于S、F、M或L；和/或Z2限于Q或S；和/或Z3限于S、G、H、Q或Y；和/或Z4限于A、S、T、L或D；和/或Z5限于H、E、D或S；和/或Z6限于V、Y、F或S；和/或Z7限于P、S或不存在；和/或Z8限于S或不存在；和/或Z9限于W、P、L或F；和/或Z10限于T或V。
特别注意到SEQ ID NO:96-98的VL CDR3序列在位置Z5处带正电荷而图11中的其他序列则没有，备选的共有序列是VL CDR3基序2：
Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9Z10(SEQ ID NO:138)
其中Z1是S、T、C、F或Y；Z2是Q或N；Z3是S、T、C、G或A；Z4是A、G、S、T或C；Z5是H、K或R；Z6是V、L、I、M或A；Z7是P或不存在；Z8不存在；Z9是W、P、L、I、V、M、A、F或Y；并且Z10是T、S或C。在一些实施方案中，Z1限于S或F；和/或Z2限于Q；和/或Z3限于S或G；和/或Z4限于A、S或T；和/或Z5限于H；和/或Z6限于V；和/或Z7限于P或不存在；和/或Z8限于不存在；和/或Z9限于W、P、L或F；和/或Z10限于T。
特别注意到SEQ ID NO:99-102的VL CDR3序列在位置Z5处带负电荷而图11中的其他序列则没有，备选的共有序列是VL CDR3基序3：
Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9Z10(SEQ ID NO:139)
其中Z1是M、C、L、I、V、A；Z2是Q或N；Z3是H、K、R、Q、N、G、A、Y或F；Z4是L、I、V、M、A、D或E；Z5是E或D；Z6是Y或F；Z7是P；Z8不存在；Z9是W、P、L、I、V、M、A、F或Y；并且Z10是T、S或C。在一些实施方案中，Z1限于M或L；和/或Z2限于Q；和/或Z3限于H、Q、G或Y；和/或Z4限于L或D；和/或Z5限于E或D；和/或Z6限于Y或F；和/或Z7限于P；和/或Z8限于不存在；和/或Z9限于W、P、L或F；和/或Z10限于T。
特别注意到SEQ ID NO:103的VL CDR3序列与图11中的其它序列截然不同，备选的共有序列是VL CDR3基序4：
Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9Z10(SEQ ID NO:140)
其中Z1是S、T或C；Z2是S、T或C；Z3是Y或F；Z4是T、S,或C；Z5是S、T或C；Z6是S、T或C；Z7是S、T或C；Z8是S、T或C；Z9是W、P、F或Y；并且Z10是V、L、I、M、A、T、S或C。在一些实施方案中，Z1限于S或T；和/或Z2限于S或T；和/或Z3限于Y；和/或Z4限于T或S；和/或Z5限于S或T；和/或Z6限于S或T；和/或Z7限于S或T；和/或Z8限于S或T；和/或Z9限于W、P或F；和/或Z10限于V、L、I、T或S。在一些实施方案中，Z1限于S；和/或Z2限于S；和/或Z3限于Y；和/或Z4限于T；和/或Z5限于S；和/或Z6限于S；和/或Z7限于S；和/或Z8限于S；和/或Z9限于W；和/或Z10限于V。
最后，特别注意到SEQ ID NO:104的VL CDR3序列与图11中的其它序列截然不同，备选的共有序列是VL CDR3基序5：
Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9Z10(SEQ ID NO:141)
其中Z1是Q或N；Z2是A或G；Z3是W、Y或F；Z4是D或E；Z5是S、T或C；Z6是R、K或H；Z7是T、S或C；Z8是V、I、L、M或A；Z9是V、I、L、M或A；并且Z10是I、L、V、M或A。在一些实施方案中，Z1限于Q；和/或Z2限于A；和/或Z3限于W；和/或Z4限于D；和/或Z5限于S；和/或Z6限于R；和/或Z7限于T；和/或Z8限于V；和/或Z9限于V；和/或Z10限于I。
可变重链序列
1N23的VH。对来自1N23杂交瘤的阳性VH克隆进行测序，发现4个编码功能性VH链。这4个克隆被命名为1N23VH3-5、1N23VH3-7、1N23VH2-1和1N23VH1-5。
1K23的VH。对来自1K23杂交瘤的阳性VH克隆进行测序，发现6个编码功能性VH链。这6个克隆被命名为1K23VH2-1_0910、1K23VH1-4_0907、1K23VH1-10_0907、1K23VH8-4_0907、1K23VH8-5_0907和1K23VH8-9_0907。
2K4的VH。对来自2K4杂交瘤的阳性VH克隆进行测序，发现4个编码功能性VH链。这4个克隆被命名为2K4VH3-8、2K4VH2-8、2K4VH1-1和2K4VH1-4。
1C9的VH。对来自1C9杂交瘤的阳性VH克隆进行测序，发现8个编码功能性VH链。这8个克隆包括被命名为1C9VH2-404-8_1024、1C9VH2-405-12_1024、1C9VH2-411-1_1024和1C9VH2-406-4_1024的4个独特序列。
1J20的VH。对来自1J20杂交瘤的阳性VH克隆进行测序，发现2个编码功能性VH链。这2个克隆被命名为1J20VH1-7_0910和1J20VH1-1-6_0829。
1L20的VH。对来自1L20杂交瘤的阳性VH克隆进行测序，发现3个编码功能性VH链。这3个克隆被命名为1L20VH2-3_0903、1L20VH2-1_0907和1L20VH2-3_0910。
1K3的VH。对来自1K3杂交瘤的阳性VH克隆进行测序，发现5个编码功能性VH链。这5个克隆被命名为1K3VH6-7、1K3VH6-8_0816、1K3VH3-4、1K3VH3-4和1K3VH3-3_0816。
1L5的VH。对来自1L5杂交瘤的阳性VH克隆进行测序，发现9个克隆编码功能性VH链。这9个克隆被命名为1L5VH003-5-8_0907、1L5VH003-6-3_0907、1L5VH001-7-6_0907、1L5VH001-6-5_0907、1L5VH001-6-11_0907、1L5VH003-6-2_0910、1L5VH001-6-12_0907、1L5VH003-3-4_0907和1L5VH003-3-8_0907。
另外的VH。获得另外4种的称为CTA5_VH、CTB11_VH、CTC2_VH、CTD2_VH的杂交瘤抗体的VH序列。
VH序列比对。上述所有VH序列的比对显示在图10中。该图指示三个CDR区(粗体，下划线)的大致位置和对应于每个序列的SEQ ID NO。
独特VH CDR序列。图10中VH的独特CDR序列的比对显示在图12中。在43个VH序列中，如图12所示，仅有8个独特的CDR1序列、9个独特的CDR2序列和10个独特的CDR3序列。
VH CDR共有序列。基于图12中公开的序列，以及天然存在的氨基酸的结构/功能特征，可以确定VH CDR的共有序列。
对于VH CDR1，一个共有序列是VH CDR1基序1：
X1X2X3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO:142)
其中X1是G或A；X2是Y、F、W、D或E；X3是T、S、C或M；X4是F、Y、W、V、L、I、M或A；X5是T、S、C、N或Q；X6是S、T、C、A或G；X7是Y、F、W、N、Q、G或A；并且X8是W、A、G、Y或F。在一些实施方案中，X1限于G；和/或X2限于Y、F或D；和/或X3限于T或S；和/或X4限于F或V；和/或X5限于T、S或N；和/或X6限于S、T或A；和/或X7限于Y、F、N或G；并且X8限于W、A或Y。在一些实施方案中，子序列X1X2X3限于G Y T；并且在一些实施方案中，子序列X1X2X3限于G F T。此外，在一些实施方案中，子序列X1X7X8限于S Y W。
特别注意到SEQ ID NO：109-110和112的VH CDR1序列与图12中的其它序列截然不同，备选的共有序列是VH CDR1基序2：
X1X2X3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO:143)
其中X1是G或A；X2是Y、F或W；X3是T、S、C或M；X4是F、Y或W；X5是T、S或C；X6是S、T或C；X7是Y、F或W；并且X8是W。在一些实施方案中，X1限于G；和/或X2限于Y或F；和/或X3限于T或S；和/或X4限于F；和/或X5限于T或S；和/或X6限于S或T；和/或X7限于Y或F；并且X8限于W。在一些实施方案中，子序列X1X2X3限于G Y T；并且在一些实施方案中，子序列X1X2X3限于G F T。此外，在一些实施方案中，子序列X1X7X8限于S Y W。
对于VH CDR2，一个共有序列是VH CDR2基序1：
Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8Y9Y10(SEQ ID NO:144)
其中Y1是I、L、V、M或A；Y2是Y、F、H、R、K、S或T；Y3是P、S、T、Y、F、R、K或H；Y4是G、A、S、T、K、R、H、D或E；Y5是T、S或不存在；Y6是R、K、H或不存在；Y7是N、Q、D、E、G、A或不存在；Y8是G、A、S、T、Y或F；Y9是D、E、A、G、N或Q；并且Y10是T、S、I、L、V、M、A、K、R或H。在一些实施方案中，Y1限于I；和/或Y2限于Y、H、R、K或S；和/或Y3限于P、S、Y或R；和/或Y4限于G、S、K或D；和/或Y5限于T或不存在；和/或Y6限于R或不存在；和/或Y7限于N、D、G或不存在；和/或Y8限于G、A、S或Y；和/或Y9限于D、E、A或N；和/或Y10限于T、I或K。
特别注意到SEQ ID NO：120-121的VH CDR2序列与图12中的其它序列截然不同，备选的共有序列是VH CDR2基序2：
Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8Y9Y10(SEQ ID NO:145)
其中Y1是I、L、V、M或A；Y2是Y、F、H、R、K、S或T；Y3是P、S、T、Y或F；Y4是G、A、S、T、K、R或H；Y5是T、S或不存在；Y6是R、K、H或不存在；Y7是N、Q、D、E或不存在；Y8是G、A、S、T、Y或F；Y9是D、E、A、G、N或Q；并且Y10是T、S、I、L、V、M或A。在一些实施方案中，Y1限于I；和/或Y2限于Y、H、R或S；和/或Y3限于P、S或Y；和/或Y4限于G、S或K；和/或Y5限于T或不存在；和/或Y6限于R或不存在；和/或Y7限于N、D或不存在；和/或Y8限于G、A、S或Y；和/或Y9限于D、E、A或N；和/或Y10限于T或I。
对于VH CDR3，一个共有序列是VH CDR3基序1：
Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9Z10Z11Z12Z13Z14Z15(SEQ ID NO:146)
其中Z1是A、G、V、L、I或M；Z2是R、K、H、C或M；Z3是G、A、R、K、H、S、T、Y、F、W、D、E或不存在；Z4是Y、F、W、N、Q、G、A、R、K、H或不存在；Z5是S、T、N、Q、E、D或不存在；Z6是D、E或不存在；Z7是L、I、V、M、A、S、T或不存在；Z8是L、I、V、M、A或不存在；Z9是G、A、R、K、H或不存在；Z10是I、L、V、M、A、N、Q、R、K、H或不存在；Z11是A、M、F、Y、W、S、T、G或不存在；Z12是W、Y、F、A、G或不存在；Z13是F、Y、W、G、A、M或C；Z14是A、G、M、D、E、W、Y或F；并且Z15是Y、F、W、G、A或V。在一些实施方案中，Z1限于A或V；和/或Z2限于R、K或C；和/或Z3限于G、R、S、Y、D或不存在；和/或Z4限于Y、N、G、R或不存在；和/或Z5限于S、N、E或不存在；和/或Z6限于D或不存在；和/或Z7限于L、S或不存在；和/或Z8限于L或不存在；和/或Z9限于G、R或不存在；和/或Z10限于I、N、R、L或不存在；和/或Z11限于A、F、S、G或不存在；和/或Z12限于W、Y、A或不存在；和/或Z13限于F、Y、G或M；和/或Z14限于A、D、W或Y；和/或Z15限于Y、F、W或G。
虽然已经在前述示例性实施方案中描述和示出了所公开的主题，但是应当理解，本公开内容仅仅是通过示例的方式做出的，并且可以进行所公开的主题的实现的细节的许多变化而不偏离所公开主题的精神和范围，其仅由所附权利要求限制。
Claims (17)
1.特异性结合人VASA蛋白的抗体，其包含：
免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，
其中所述轻链的可变区包含：
(i)CDR1区，其包含选自SEQ ID NO:83-88的氨基酸序列；
(ii)CDR2区，其包含选自SEQ ID NO:89-95的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3区，其包含选自SEQ ID NO:96-104的氨基酸序列。
2.特异性结合人VASA蛋白的抗体，其包含：
免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，
其中所述重链的可变区包含：
(i)CDR1区，其包含选自SEQ ID NO:105-112的氨基酸序列；
(ii)CDR2区，其包含选自SEQ ID NO:113-121的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3区，其包含选自SEQ ID NO:122-131的氨基酸序列。
3.特异性结合人VASA蛋白的抗体，其包含：
免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，
其中所述轻链的可变区包含：
(i)CDR1区，其包含选自VL CDR1基序1-2的氨基酸序列；
(ii)CDR2区，其包含选自VL CDR2基序1-3的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3区，其包含选自VL CDR3基序1-5的氨基酸序列。
4.特异性结合人VASA蛋白的抗体，其包含：
免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，
其中所述重链的可变区包含：
(i)CDR1区，其包含选自VH CDR1基序1-2的氨基酸序列；
(ii)CDR2区，其包含选自VL CDR2基序1-2的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3区，其包含选自VL CDR3基序1的氨基酸序列。
5.包含权利要求1-4任一项的抗体的抗体制剂。
6.权利要求5的抗体制剂，其中所述制剂是单克隆抗体制剂。
7.权利要求5的抗体制剂，其中所述制剂是至少两种单克隆抗体制剂的混合物。
8.分离的核酸分子，其编码权利要求1-4任一项的重链或轻链。
9.权利要求8的分离的核酸分子，其中所述核酸选自克隆载体、表达载体、异源重组载体和病毒整合载体。
10.用权利要求8-9任一项的核酸转化的细胞。
11.权利要求10的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
12.权利要求11的细胞，其中所述细胞是啮齿类动物细胞。
13.权利要求11的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
14.权利要求11的细胞，其中所述细胞是人类细胞。
15.分离表达VASA蛋白的细胞的方法，其包括：
(a)获得细胞群体；
(b)将该细胞群体与多个权利要求1-4中任一项所述的抗体接触；以及
(c)将群体中特异性结合所述抗体的细胞与群体中不特异性结合所述抗体的细胞分开。
16.权利要求15的方法，其中通过荧光激活细胞分选来分开细胞。
17.权利要求15的方法，其中使用固定化的二抗通过荧光激活细胞分选来分开细胞。
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