CN102636655B - 一种荧光原位微量淋巴毒检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫学领域，公开了一种荧光原位微量淋巴毒检测方法和试剂盒。该方法将受者血清中IgG抗体的Fab段与供者淋巴细胞表面抗原结合，洗板后加入由补体和抗人IgG轻链的二抗组成的混合液孵育，使所述二抗的Fab段与受者血清中IgG抗体结合，补体与二抗的Fc段结合，然后由补体介导细胞杀伤效应杀死靶细胞，接着进行荧光染色并利用计数法统计供者淋巴细胞的死亡率。本发明所述检测方法增加了抗人IgG轻链的二抗，以其为桥梁提高了补体结合机率，弥补了传统CDC方法由于受者血清抗体滴度较低而导致补体难以结合IgG抗体的缺陷，提高了检测淋巴细胞毒性的准确性和灵敏度，能够应用于器官移植前的配型检测中。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种荧光原位微量淋巴毒检测方法和试剂盒。
背景技术
器官移植已经成为治疗脏器衰竭的重要手段之一，但这项技术在飞速发展的同时也面临着各种挑战，其中受者自身免疫系统可识别外源性脏器，而人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen,HLA）是器官移植发生免疫排斥的最主要原因。
受者作为生物有着一种天赋的能力和机构-免疫系统，它能对进入其体内的外来“非己”组织器官加以识别、控制、摧毁和消灭。这种生理免疫过程在临床上表现为免疫排斥反应，导致移植器官破坏和移植失败。移植器官正像人的其他细胞一样，有二大类主要抗原：ABO血型和人类白细胞抗原（HLA），它们会造成同种异体移植的排斥反应。ABO血型主要有4种（O型、A型、B型、AB型），寻找ABO血型相同的供受者并不难，但是HLA异常复杂，现已查明有7种抗原类型，即HLA-A、B、C、D、DR、DQ、DP，共148个抗原，其组合可超过200万种。事实上除非同卵双生子，否则不可能找到HLA完全相同的供受者。所以，同种异体移植后必然存在发生排斥反应的风险，但如果供受者HLA高度相同，免疫排斥反应发生的程度会较轻，因此，移植前需要对供受者匹配程度进行充分评估，以降低移植排斥的风险。供受者微量淋巴毒试验（Micro-complement dependent cytotoxicity test,CDC），即检测供者淋巴细胞的杀伤率，以此来推断出受者是否可以接受供者的器官进行移植。
CDC，从字面上直译为微量补体依赖的细胞毒性试验，在国内普遍称为微量淋巴毒试验。其检测原理是补体与抗体的Fc段结合后，补体系统被激活，在靶细胞表面形成MAC（膜攻击复合物），MAC在细胞膜上形成亲水性穿膜孔道，能使水和电解质通过，而不让蛋白质类大分子逸出，最终可因胞内渗透压改变，而使细胞溶解破坏，从而介导细胞杀伤效应，这种效应即为补体依赖的细胞毒作用。但是，这种传统CDC方法在受者血清滴度较低的情况下容易产生假阴性反应或疑似阴性反应，使检测结果出现较大误差，灵敏度较差。同时，传统CDC方法使用台盼蓝染色统计淋巴细胞死亡率，这种依靠单一染色方法进行结果统计容易因人为经验而造成较大误差，进一步降低了CDC方法的准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种荧光原位微量淋巴毒检测方法和试剂盒，使得该检测方法能够提高灵敏度和准确度。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种荧光原位微量淋巴毒检测方法，将受者血清和供者淋巴细胞混匀孵育，使受者血清中IgG抗体的Fab段与供者淋巴细胞表面抗原结合，洗板后加入由补体和抗人IgG轻链的二抗组成的混合液孵育，使所述二抗的Fab段与受者血清中IgG抗体结合，补体与二抗的Fc段结合，然后由补体介导细胞杀伤效应杀死靶细胞，接着进行荧光染色并利用计数法统计供者淋巴细胞的死亡率，所述补体和二抗的体积比为150-250∶1，所述供者淋巴细胞的存活率大于90%。
其中，所述受者血清和供者淋巴细胞孵育时间优选为30min，所述受者血清、供者淋巴细胞以及混合液孵育时间优选为60min。
传统CDC方法是通过补体与人IgG的Fc段结合从而介导细胞杀伤效应，若受者血清中抗体滴度较低，人IgG抗体Fab段与淋巴细胞表面抗原结合后，相邻的人IgG抗体Fc段之间的距离较远不足以结合补体，从而无法进一步发挥补体介导的细胞杀伤效应，致使检测出的淋巴细胞死亡率比应有的死亡率偏低，容易误判，轻者造成器官移植的失败，重者危及受者生命健康。
本技术领域公知，Ig分子的Fab段为抗原结合片段，Fc段为可结晶片段，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。而本发明针对现有技术问题，在加入补体的同时增加一种抗人IgG轻链的二抗，因此所述二抗的Fab段能够特异性的结合于人IgG的轻链，且由于人IgG具有两个轻链，所以一个IgG抗体能够结合两个二抗，形成更多的Fc段，同时使得两个二抗的Fc段之间距离较近，能够作为桥梁充分结合介导细胞杀伤效应的效应分子-补体，激活补体，启动免疫反应，从而最大程度的介导细胞杀伤效应，使检测出的淋巴细胞死亡率与应有的死亡率缩小误差，提高检测的灵敏度和准确性。
本发明所述二抗可通过市售或本领域常规方法制得，作为优选，本发明所述二抗为羊抗人IgG κ轻链的IgG，即以采用纯化的人本周氏蛋白（IgG轻链）作为免疫原免疫山羊，然后从山羊的血清中分离纯化得到羊抗人IgG κ轻链的IgG，IgG轻链中50-70%为κ轻链，30-50%为λ轻链，因此轻链中主要是κ轻链。
在检测过程中，由于淋巴细胞的存活率会影响检测结果的准确性，故供者淋巴细胞存活率要大于90%，使检测结果的误差在可允许的范围内。此外，本发明所述检测方法优选供者淋巴细胞的含量为2×106个/L。其中，所述受者血清和供者淋巴细胞的体积比为2∶1，所述供者淋巴细胞和混合液的体积比优选为1∶5。
本发明对于检测方法中的补体与二抗的体积比例要求比较苛刻，为150-250∶1，优选为200∶1。由于免疫反应存在前带和后带现象，抗原抗体需要在合适的比例下才能充分反应，两者的比例过高或者过低均无法使二抗与固定于淋巴细胞表面的人IgG抗体充分结合，也就无法与补体充分结合，从而减弱反应强度，降低准确性。
本发明可以采用传统方法的台盼蓝染色，被杀死的淋巴细胞会成蓝色，通过计数法统计细胞总数和死细胞总数即可得出淋巴细胞的死亡率。而作为优选，本发明采用AO/EB双荧光染色，在孵育完成后，活细胞的核酸被AO染色，呈绿色荧光；死细胞的核酸被EB染色，呈橘红色荧光，然后通过计数法统计活细胞总数和死细胞总数即可得出淋巴细胞的死亡率。两种颜色能够形成显著反差，更加利于统计淋巴细胞的死亡率，相比于单一的染料染色更有利于准确度的提升。
在实际的检测的过程中，血清、淋巴细胞以及混合液的孵育需要借助Terasaki板来进行，这是本领域所公知的，但由于Terasaki板的特殊结构需要用专门的倒置荧光显微镜来检测结果。而本发明所述检测方法只需将Terasaki板倒置，用普通的荧光显微镜即可观察，利于该方法普遍推广。
此外，本发明还提供一种荧光原位微量淋巴毒检测试剂盒，包括补体和抗人IgG к轻链的二抗。作为优选，所述二抗为羊抗人IgG к轻链的IgG，所述试剂盒还包括AO/EB双荧光染色液和PBS洗板液。
本发明采用阴性和阳性质控血清，分别运用传统CDC方法和本发明所述检测方法进行试验对比，结果显示，两种方法的阴性血清结果无显著差异，但本发明所述检测方法的阳性血清结果明显高于传统CDC方法的结果。同时，本发明还选取了抗体滴度较低的9份阳性血清样品和1份阴性血清样品进行试验对比，结果显示，传统CDC方法的阳性血清结果同阴性血清结果较为接近，准确性较差，而本发明检测方法的阳性血清结果与阴性血清结果有明显差异，且高于传统CDC方法的阳性血清结果。以上试验结果均充分表明本发明所述检测方法能够提高检测淋巴细胞毒效应的准确性。
此外，本发明还将阳性质控血清倍比稀释，在稀释到800倍时，本发明所述方法的供者淋巴细胞死亡率为37%，而现有CDC方法的结果为14%，而本领域判断标准规定，低于20%的结果可以判定为疑似阴性，可见传统CDC方法的灵敏度较差，容易发生错判。
由以上技术方案可知，本发明所述检测方法增加了抗人IgG轻链的二抗，以其为桥梁提高了补体结合机率，弥补了传统CDC方法由于受者血清抗体滴度较低而导致补体难以结合IgG抗体的缺陷，提高了检测淋巴细胞毒性的准确性和灵敏度，能够应用于器官移植前的配型检测中。
具体实施方式
本发明公开了一种荧光原位微量淋巴毒检测方法和试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法及试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种荧光原位微量淋巴毒检测方法和试剂盒做进一步说明。
实施例1：本发明所述检测方法
常规采集受者待测血清，Ficoll法分离供者待测淋巴细胞，调整淋巴细胞含量为2×106/L，保证细胞活率>90%。
待测血清（2ul）+待测淋巴细胞（1ul）加入Terasaki板的反应孔中，轻微混匀后20-25℃孵育30min，使受者血清中IgG抗体的Fab段与供者淋巴细胞表面抗原充分结合，然后每孔加8μl 1×PBS，1000rpm离心10sec，轻微震荡，甩板，洗板两次，洗去未结合物质。
从-80℃冰箱中取出分装好的补体和鼠抗人IgG κ轻链的IgG（市售获得），融化后，按1∶150（二抗：补体）的体积比例临用时配制。将新鲜配制的补体+二抗混合液5ul立即加入反应孔中，20-25℃孵育60min，使所述二抗的Fab段与受者血清中IgG抗体的κ轻链结合，补体与二抗的Fc段结合，然后由补体介导细胞杀伤效应杀死靶细胞。
每孔加入5ul台盼蓝荧光染料，1000rpm离心10sec后，荧光显微镜下利用计数法统计细胞总数、死细胞总数，得出淋巴细胞死亡率，判断淋巴细胞毒效应。
实施例2：本发明所述检测方法
常规采集受者待测血清，Ficoll法分离供者待测淋巴细胞，调整淋巴细胞含量为2×106/L，保证细胞活率>90%。
待测血清（2ul）+待测淋巴细胞（1ul）加入Terasaki板的反应孔中，轻微混匀后20-25℃孵育30min，使受者血清中IgG抗体的Fab段与供者淋巴细胞表面抗原充分结合，然后每孔加8μl 1×PBS，1000rpm离心10sec，轻微震荡，甩板，洗板两次，洗去未结合物质。
从-80℃冰箱中取出分装好的补体和羊抗人IgG κ轻链的IgG（均购自于One Lambda公司），融化后，按1∶200（二抗：补体）的体积比例临用时配制。将新鲜配制的补体+二抗混合液5ul立即加入反应孔中，20-25℃孵育60min，使所述二抗的Fab段与受者血清中IgG抗体的κ轻链结合，补体与二抗的Fc段结合，然后由补体介导细胞杀伤效应杀死靶细胞。
每孔加入5ul荧光染料FluoroQuenchTM AO/EB，1000rpm离心10sec后，荧光显微镜下利用计数法统计活、死细胞总数，得出淋巴细胞死亡率，判断淋巴细胞毒效应。
实施例3：本发明所述检测方法
常规采集受者待测血清，Ficoll法分离供者待测淋巴细胞，调整淋巴细胞含量为2×106/L，保证细胞活率>90%。
待测血清（2ul）+待测淋巴细胞（1ul）加入Terasaki板的反应孔中，轻微混匀后20-25℃孵育30min，使受者血清中IgG抗体的Fab段与供者淋巴细胞表面抗原充分结合，然后每孔加8μl 1×PBS，1000rpm离心10sec，轻微震荡，甩板，洗板两次，洗去未结合物质。
从-80℃冰箱中取出分装好的补体和兔抗人IgG κ轻链的IgG（市售获得），融化后，按1∶250（二抗：补体）的体积比例临用时配制。将新鲜配制的补体+二抗混合液5ul立即加入反应孔中，20-25℃孵育60min，使所述二抗的Fab段与受者血清中IgG抗体的κ轻链结合，补体与二抗的Fc段结合，然后由补体介导细胞杀伤效应杀死靶细胞。
每孔加入5ul荧光染料FluoroQuenchTM AO/EB，1000rpm离心10sec后，荧光显微镜下利用计数法统计活、死细胞总数，得出淋巴细胞死亡率，判断淋巴细胞毒效应。
实施例4：准确性对比试验
试验方法：本发明实施例2检测方法（不同AHG：补体配比）和传统CDC方法，区别在于传统CDC只加入补体，其他条件均一致；
淋巴细胞样品：采集于苏州大学附属第一医院肾移植供者；
血清样品：质控血清（阴性和阳性两种，均购自于One Lambda公司）、自制阳性血清（包含有各种类型抗体，由UCLA大学提供）、10份患者血清样品（试验前鉴定9份为低抗体滴度阳性血清样品、1份为抗体阴性血清样品，由苏州大学第一附属医院提供）；
试验结果：见表1和表2
表1质控血清对比试验结果（淋巴细胞死亡率%）
由上表可知，两种方法的阴性质控血清结果无显著差异，但本发明所述检测方法（二抗：补体=1∶150-250）的阳性质控血清的检测结果明显高于传统CDC方法的结果。同时，从上表中还可以得知，由于免疫反应的前带和后带现象，二抗：补体体积比例超出本发明所述比例后，其检测结果同样不准确，淋巴细胞死亡率偏低。以上试验结果均充分表明本发明所述检测方法能够提高检测淋巴细胞毒性的准确性。
表2患者血清剂自制阳性血清对比试验结果（淋巴细胞死亡率%）
由上表可知，两种方法的自制阳性血清的检测结果明显高于传统CDC方法的结果，抗体滴度较低的9份患者阳性血清样品结果同样高于传统CDC方法的结果，而患者阴性血清样品结果无明显差异；此外，可以看出传统CDC方法的患者阳性血清结果同阴性血清结果较为接近，准确性较差，而本发明检测方法的阳性血清结果与阴性血清结果有明显差异。
实施例5：灵敏度检测
采用实施例4中阳性质控血清，依次稀释0、50、100、200、400、800倍，分别用实施例2检测方法（AHG：补体=1∶200）以及传统CDC方法，区别在于传统CDC只加入补体，其他条件均一致，检测结果见表2。
表2灵敏度检测结果
由表2可知，在稀释到800倍时，本发明所述方法的供者淋巴细胞死亡率为37%，而现有CDC方法的结果为14%，而本领域判断标准规定，低于20%的结果可以判定为疑似阴性，可见传统CDC方法的灵敏度较差，容易发生错判。
实施例6：本发明所述检测淋巴细胞毒的试剂盒
试剂盒组成：补体、羊抗人IgG κ轻链的IgG。
实施例7：本发明所述检测淋巴细胞毒的试剂盒
试剂盒组成：补体、羊抗人IgG κ轻链的IgG、PBS洗板液、AO/EB双荧光染料。
实施例8：本发明所述检测淋巴细胞毒的试剂盒
试剂盒组成：补体、鼠抗人IgG κ轻链的IgG、PBS洗板液、台盼蓝染料。
实施例9：本发明所述检测淋巴细胞毒的试剂盒
试剂盒组成：补体、兔抗人IgG κ轻链的IgG、PBS洗板液、AO/EB双荧光染料。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种荧光原位微量淋巴毒检测方法，其特征在于，将受者血清和供者淋巴细胞混匀孵育，使受者血清中IgG抗体的Fab段与供者淋巴细胞表面抗原结合，洗板后加入由补体和抗人IgG轻链的二抗组成的混合液孵育，使所述二抗的Fab段与受者血清中IgG抗体结合，补体与二抗的Fc段结合，然后由补体介导细胞杀伤效应杀死靶细胞，接着进行荧光染色并利用计数法统计供者淋巴细胞的死亡率，所述补体和二抗的体积比为150-250:1，所述供者淋巴细胞的存活率大于90%，所述受者血清和供者淋巴细胞的体积比为2:1，所述供者淋巴细胞与混合液的体积比为1:5。
2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述供者淋巴细胞的含量为2×106个/L。
3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述二抗为羊抗人IgGκ轻链的IgG。
4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述补体和二抗的体积比为200:1。
5.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述荧光染色为AO/EB双荧光染色。
6.一种荧光原位微量淋巴毒检测试剂盒，其特征在于，包括补体和抗人IgG轻链的二抗。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述二抗为羊抗人IgGκ轻链的IgG。
8.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括AO/EB双荧光染色液和PBS洗板液。
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