CN104650221B - 大容量血清抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大容量血清抗体的制备方法，包括如下步骤，先采集经免疫后的新鲜血液，收集血浆，冻存备用；然后将收集的血浆进行过滤，收集滤液，得初滤血清制品；将制得的初滤血清制品中加入凝血酶，搅拌均匀，然后20～37℃条件下温敷0.5～4h，再用孔径为0.22～0.88μm的滤纸过滤，收集滤液，得血清抗体；利用本发明的方法制得的血清抗体量多，品质佳，稳定性好，且适合大容量血清抗体的制备，具有较好的市场前景。

Description

大容量血清抗体的制备方法

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及大容量血清抗体的制备方法。

背景技术

血清抗体属于抗体药物中的最初级产品，仅在实验室小规模制备以用于科学研究较常见。纤维蛋白原是血浆与血清区别的主要组分之一，由a、β和γ链通过29对二硫键连接而成的分子量为340kDa的六聚体，作为血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的受体参与血小板的活化聚集和在凝血酶及动物机体其他组分的作用下参与第三阶段的凝血。

随着养殖业集约化的快速发展，免疫失败、动物重大疫病的散发性暴发、抗病毒药物在兽医临床的禁用及以原发性病毒性疾病所至的混合感染，为动物各种疫病特异性的血清、免疫球蛋白及白蛋白等提供了市场空间。目前，提取制备血清抗体最常见的方法是冻融法、冷乙醇法、自然沉析法，前两种成本低，但对血浆中的纤维蛋白去除不彻底，易在制备后的短时间内出现絮状物的沉析，影响提取的血清抗体的品质及后续相关研究；自然沉析法对提取的血清总蛋白量影响最小，且析出的血清抗体品质很好，但提取的血清抗体量最少，丢失较多，不能满足制备大容量血清抗体的需求。

因此，急需一种大容量血清抗体的制备方法，纤维蛋白去除彻底，血清抗体量多，品质好。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供大容量血清抗体的制备方法，该方法血清抗体获得量多，纤维蛋白去除彻底，品质好，适合大容量制备，能够实现产业化。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、大容量血清抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)采集经免疫后的新鲜血液，收集血浆，保存备用；

(2)将步骤(1)收集的血浆进行过滤，收集滤液，得初滤血清制品；

(3)将步骤(2)制得的初滤血清制品中加入凝血酶，搅拌均匀，20-37℃条件下温敷0.5～4h，接着用滤纸过滤，收集滤液，得血清抗体；所述凝血酶的加入量按每毫升初滤血清制品加入10～40IU凝血酶。

优选的，采集经免疫后的新鲜血液为将免疫的待宰正常健康肥猪于最后次免疫猪瘟疫苗3天后屠宰，收集新鲜猪血即可。

优选的，所述收集血浆是将收集的新鲜猪血按抗凝剂与新鲜猪血体积比为1:10抗凝剂，所述抗凝剂的质量分数为3.8％；混匀后于4℃静置4～5小时，然后于5000r/min条件下离心0.5h，收集上清液得血浆。

更优选的，所述抗凝剂为枸椽酸钠。

优选的，步骤(2)中，所述过滤是将血浆用孔径为0.22-0.88μm的过滤器过滤，过滤器为不锈钢正压微孔滤器。

优选的，步骤(3)中，所述凝血酶的加入量按每毫升初滤血清制品加入30IU凝血酶。

优选的，所述温敷37℃条件下温敷2h。

优选的，所述过滤为用孔径为0.88μm的滤纸过滤。

更优选的，步骤(3)中收集滤液后还包括如下步骤：将获得的血清抗体加入硫柳汞钠至硫柳汞钠的质量百分数为0.02～0.4％。

本发明的有益效果在于：本发明公开了大容量血清抗体的制备方法，该方法简单，能够用于大容量血清的制备，并且血清获得量多，纤维蛋白去除彻底，品质佳，稳定性好，在5～15℃条件下静置1个月保持澄清透明，且血清(比如猪瘟抗体血凝试验)在5～15℃条件下静置1个月后效价达1：16，效价优于其他方法制备的血清抗体。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为四种方法备血清抗体前后的猪瘟抗体效价(猪瘟正向间接血凝试验检测法)比较(效价3、2分别表示稀释倍数或凝集效价为1：8和1：4)。

图2为不同保存温度对四种方法制备的血清抗体效价变化曲线。

图3为不同温度环境下保存时间对四种方法制备的血清抗体稳定性的影响(A:5-15℃室温环境下保存30d血清猪瘟抗体效价变化曲线；B:15-25℃室温环境下保存30d血清猪瘟抗体效价变化曲线)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所使用的主要试剂盒材料如下：猪瘟冻干正向间接血凝试验诊断液购自中国农科院兰州兽医研究所；凝血酶冻干粉(10IU/mg)购自北京第一生物化学药业有限公司；蛋白质定量(双缩脲法)测试盒购于江苏南京建成生物有限公司；硫柳汞钠购自国药集团化学试剂有限公司；试验用猪血采自重庆市荣昌县施济桥屠宰场经检疫的待宰正常健康肥猪。

本发明中抗凝剂可以为枸橼酸钠。

实施例1

大容量血清抗体的制备方法(凝血酶法)，具体步骤如下：

(1)取待宰正常健康肥猪免疫猪瘟疫苗按5、2、3、4头份/头或2、2、2、4头份/份免疫(注：疫苗为兔源猪瘟活疫苗，规格；10头份/瓶，≥0.02g组织毒/头份，疫苗生产单位为：上海海利生物技术有限公司)，每周免疫一次，第5周用首免的2-3倍剂量免疫猪瘟疫苗，加倍免疫3天后屠宰收集新鲜猪血；屠宰前用洁净自来水冲洗待屠宰肥猪全身，并用来苏尔消毒；放血刀或其他屠宰用品用酒精或其他消毒液消毒；

(2)将步骤(1)收集的新鲜猪血按体积比为1:10加入质量分数为3.8％的枸椽酸钠，混匀后于4℃静置4～5小时，然后于5000r/min条件下离心0.5h，收集上清液即血浆，于-20℃下过夜保存，备用；

(3)将步骤(2)保存的血浆在4℃下用5-10L规格滤膜孔径0.22-0.88微米的特制不锈钢正压微孔滤器过滤，收集滤液，得初滤血清制品；

(4)将步骤(3)制得的初滤血清制品按1毫升初滤血清制品加入10IU加入凝血酶，搅拌均匀，然后在37℃条件下温敷2h，再用孔径为0.88μm的滤纸过滤，收集滤液，保存，备用；

(5)将步骤(4)获得的滤液加入硫柳汞钠至硫柳汞钠的质量百分数为0.02％，混匀，得血清初级产品。

本实施例中，凝血酶使用前用20～50mL无菌蒸馏水稀释溶解；温敷中在20～37℃下温敷0.5～4小时均可；硫柳汞钠的作用为防腐，硫柳汞钠浓度度为0.02％～0.04％(质量百分比)范围内均能实现发明目的。

对比实施例1

大容量血清抗体的制备方法(自然沉析法)，具体步骤如下：按上述相同方法采集的新鲜猪血37℃静置30min，划口，4℃静置24-48h，收集析出的液体经离心即为血清抗体。

对比实施例2

大容量血清抗体的制备方法(冻融法)，具体步骤如下：按上述相同方法采集的新鲜猪血，经抗凝处理后，离心取上清液，置-20℃条件下静置冷冻24-48h，过滤，收集滤液即为血清抗体。

对比实施例3

大容量血清抗体的制备方法(冷乙醇法)，具体步骤如下：按上述相同方法采集的新鲜猪血，经抗凝处理后，离心取上清液，然后按体积比为(10：1)加入冷乙醇，作用0.5～2h，过滤，收集滤液即为血清抗体。

实施例1与对比实施例1～3获得血清抗体比较：

1)血清抗体量：分别取500mL新鲜猪血，按照上述方法制备血清抗体，然后将去置刻度量杯中统计血清抗体获得量，每组设置3次。结果显示，实施例1、对比实施例1～3血清抗体的获得量依次为207mL、39mL、185mL和181mL。上述结果表明凝血酶法制得的血清抗体量最多，500mL的新鲜血液制备出平均为207mL的血清剂量。

2)血清抗体品质：分别取500mL新鲜猪血，按照上述方法制备血清抗体，然后比较四份血清抗体的色泽、澄清度。同时，采取双缩尿法测定四份制备前后血浆及血清蛋白总浓度。结果显示，实施例1、对比实施例1～3血清抗体的蛋白含量依次为72.72mg/mL、67.80mg/mL、67.63mg/mL、70.00mg/mL，与血浆总蛋白浓度73.6mg/mL比较，自然沉析法对血清蛋白含量影响最低，仅降低了0.8个蛋白浓度；凝血酶法和冻融法对血清蛋白影响大的是冻融法，从制备前的73.60mg/mL分别降到了67.80mg/mL和67.63mg/mL。

3)血清抗体稳定性：分别取500mL新鲜猪血，按照上述方法制备血清抗体，然后比较四份血清抗体的猪瘟抗体效价。抗体效价实验参照杨小燕等报道的猪瘟正向间接血凝试验方法(杨小燕，李晓华，戴爱玲等.闽西地区规模化猪场猪瘟抗体水平监测及免疫效果分析.中国兽医学报，2002，22(6)：555-557)，结果如图1所示。由图1可知，提取前的血浆猪瘟最大凝集价为1：8，即猪瘟的抗体水平是1：8；经四种方法制备的血清抗体的猪瘟抗体效价各不相同。其中凝血酶法和自然沉积法对猪瘟抗体效价几乎无影响。

4)保存温度对稳定性的影响：将按实施例1、对比实施例1～3方法制备的血清抗体各自分成4份，20mL/瓶分装于50mL规格试剂瓶，然后分别于-20℃、4℃、25℃、37℃保存7d，比较不同方法制备的血清抗体在不同保存温度环境条件下血清色泽、澄清度、沉淀物析出、抗体效价等指标，其中，-20℃保存的血清于4℃自然解冻后测定和观察；结果如图2所示。结果显示，-20℃、4℃、25℃、37℃环境静置7d，在-20℃和4℃时对四种方法得到血清抗体效价、色泽、澄清度等影响较少；25℃、37℃静置7d均出现大量析出物，且血清呈暗红色偏浑浊；25℃静置7d检测其猪瘟抗体效价，凝血酶法为1：2，其他三种方法均为0，表明凝血酶法制备的血清具相对较好的稳定性。

5)不同温度下保存时间对稳定性的影响

将按实施例1、对比实施例1～3方法制备的血清抗体各自分成4份，20mL/瓶分装于50mL规格试剂瓶，然后在5-15℃(重庆渝西地区10月下旬至下年度的4月底左右)、20-25℃(重庆渝西地区5月-10月初)左右的室温环境分别静置保存7d、14d和30d，于设置的保存时间到期时比较四种去除方法制备的血清在色泽、澄清度、沉淀物析出、抗体效价四方面的差异，结果如图3所示。结果显示，四种方法制备的血清抗体保存在室温15-25℃下的第7d开始，其色泽暗淡、开始有沉淀物析出、澄清度不同程度降低，血清猪瘟抗体效价除凝血酶法在第14d时为1：4外，其他三种方法其猪瘟抗体效价均为0，说明血清不宜保存在此温度环境；5-15℃的室温环境条件下，自然沉析法和凝血酶法制备的血清总体品质及稳定性较好，静置1个月时猪瘟抗体效价分别为1：4和1：16；均澄清透明；冻融法和冷乙醇法制备的血清5-15℃室温环境放置1个月均出现液体透明度降低，沉淀物较多，说明该两种方法对去除血浆纤维蛋白原不彻底。

由上述分析可以得出采用实施例1的方法制备血清抗体，其获得量最多，血清抗体品质佳，稳定性好，且适合大容量血清抗体的制备。

实施例2

为确定凝血酶法制备血清抗体的最佳条件，对凝血酶最佳使用剂量和保存温度进行优化：

1)凝血酶最佳使用剂量优化

取500mL规格的灭菌烧杯10个，分别加入备用血浆150mL，分别向血浆中加入1500IU、2000IU、2500IU、3000IU、3500IU、4000IU、4500IU、5000IU、5500IU、6000IU凝血酶，轻轻搅拌混匀，37℃静置0.5～1h，然后用孔径为0.88μm的滤纸过滤15-24h，收集过滤完全的滤液，移入对应编号的250mL规格试剂瓶，于收集时、置4℃于12h、24h、48h观察并记录试验结果。结果显示，在凝血酶与血浆按低于30IU：1mL使用，在析出完全的收集滤液及4℃下静置48h-168h有不同程度的析出物。其中，10-17IU：1mL于过滤24h的滤液即可见明显的白色紊状物；20-30IU：1mL比例于4℃下静置48-124h未见析出物；30IU及以上：1mL，4℃下静置48-336h未见析出物表明能较彻底去除血浆中的血浆纤维蛋白原；考虑成本与兼顾大容量制备的血清品质因素，以凝血酶与血浆按30IU：1mL的比例为本次大容量制备血清抗体的最适比例，按此比例使用既能较彻底去除血浆中的血浆纤维蛋白原，又节约制备成本。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.大容量血清抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）采集经免疫后的新鲜血液，收集血浆，保存备用；所述收集血浆是将收集的新鲜猪血按抗凝剂与新鲜猪血体积比为1:10抗凝剂，所述抗凝剂的质量分数为3.8%；混匀后于4℃静置4~5小时，然后于5000r/min条件下离心0.5h，收集上清液得血浆；

（2）将步骤（1）收集的血浆进行过滤，收集滤液，得初滤血清制品；

（3）将步骤（2）制得的初滤血清制品中加入凝血酶，搅拌均匀，37℃条件下温敷2h，接着用滤纸过滤，收集滤液，得血清抗体；所述凝血酶的加入量按每毫升初滤血清制品加入10~40IU凝血酶。

2.根据权利要求1所述大容量血清抗体的制备方法，其特征在于：采集经免疫后的新鲜血液为将免疫的待宰正常健康肥猪于最后次免疫猪瘟疫苗3天后屠宰，收集新鲜猪血即可。

3.根据权利要求2所述大容量血清抗体的制备方法，其特征在于：所述抗凝剂为枸椽酸钠。

4.根据权利要求1所述大容量血清抗体的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述过滤是将血浆用孔径为0.22-0.88μm的过滤器过滤。

5.根据权利要求1所述大容量血清抗体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述凝血酶的加入量按每毫升初滤血清制品加入30IU凝血酶。

6.根据权利要求1所述大容量血清抗体的制备方法，其特征在于：所述过滤为用孔径为0.88μm的滤纸过滤。

7.根据权利要求1~6任一项所述大容量血清抗体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中收集滤液后还包括如下步骤：将获得的血清抗体加入硫柳汞钠至硫柳汞钠的质量百分数为0.02~0.4%。