CN103910798B - 抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体，其特征在于，由一份高效价抗圆斑蝰蛇毒素抗体和一份高效价抗五步蛇毒素抗体混合而成，所述的抗圆斑蝰蛇毒素抗体是采用圆斑蝰蛇毒素经灭活而成的圆斑蝰蛇毒素抗原免疫母鸡产生的鸡卵黄IgY抗体，所述的抗五步蛇毒素抗体是采用五步蛇毒素经灭活而成的五步蛇毒素抗原免疫母鸡产生的鸡卵黄IgY抗体。本发明能保护人和动物在蝰蛇或五步蛇咬伤时免受圆斑蝰蛇毒素或五步蛇毒素的伤害，特异性高，反应灵敏，成本低，适于大规模推广应用。本发明还提供了上述抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体的制备方法和应用，其制备方法过程简单，应用广泛，十分具有实用性。

Description

抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，更具体地，涉及抗蛇毒抗体技术领域，特别是指一种抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体及其制备方法和应用。

背景技术

圆斑蝰蛇(Vipera russellii)主要分布于我国广东、广西、福建、云南、湖南、江西、台湾等华南地区，是我国的主要毒蛇品种。圆斑蝰也广泛分布在东南亚，常见于马来西亚、越南、泰国、缅甸、柬埔寨等国。圆斑蝰属蝰科蝰亚科蝰属。

圆斑蝰蛇毒素主要是血液毒，毒性成分以凝血毒素为主，还含有较强的溶血毒素、纤维蛋白溶解毒素、抗凝毒素、血小板积聚变性因子、出血毒素、心脏毒素等。还含有许多酶类，主要有磷脂酶A₂，(PLA)、激肽释放酶、精氨酸酶、磷酸二酯酶、透明质酸酶、蛋白水解酶等。圆斑蝰蛇毒有很强的凝血毒素，可直接激活凝血因子X而发挥凝血作用；有类似凝血酶功能，能直接使纤维蛋白原变成纤维蛋白；激活凝血酶原作用。这几种凝血作用的共同结果是引起凝血纤溶症，这种纤溶症可以导致和加重弥漫性血管内凝血(DIC)、出血性休克、急性肾功能衰竭、内出血、脑水肿、急性心衰等。

圆斑蝰蛇的心脏毒素是由60个氨基酸组成的碱性多肽，分子量7KD左右，含4对二硫键，生化结构上和神经毒素相似。当心脏毒素被吸收进入血液循环达到一定浓度时，会对全身肌肉产生膜兴奋作用，心脏毒素的带有正电的碱性氨基酸与肌细胞膜外带负电部分产生静电吸引作用，使胞膜持久去极化而难以复极化。其结果是细胞膜的完整性破坏，细胞内的物质流出，细胞死亡。心脏毒素对心肌的损害最明显，中毒量大时可产生室颤，继而心脏停搏。心脏病理检查可见出血坏死灶、心肌纤维断裂等。圆斑蝰蛇的出血性毒素能促使炎症递质释放，造成血管内皮细胞联接的疏松，红细胞可以通过松散的细胞联接处漏出血管。出血毒素也可以引起毛细血管内皮细胞破坏，红细胞从破坏的内皮细胞处外渗出血。圆斑蝰蛇蛇毒中的卵磷酯酶A₂(PLA₂)可直接作用于红细胞膜上的磷脂，使红细胞破坏溶解。PLA₂可损害心肌，增强心脏毒素的毒性作用；破坏毛细血管管壁，增加通透性。PLA₂在低浓度时促进血小板凝聚，在高浓度时抑制血小板聚集，从而使血凝系统的调控失去功能。

圆斑蝰蛇毒素毒性很强，对人的致死量为42mg左右，同时圆斑蝰蛇的排毒量也很大，一次攻击可以排毒达到45毫克，足以造成伤者死亡。圆斑蝰蛇咬伤后患者发病迅速，症状严重，皮下出血形成瘀斑，血液大量快速凝固，血液中凝血因子消耗殆尽。随后，血液失去凝血功能，全身严重出血，常引起DIC。圆斑蝰蛇毒素还可以损害心肌，造成心肌功能障碍。

圆斑蝰蛇咬伤轻者可造成肢体残疾，重者死亡，圆斑蝰蛇咬伤的死亡率很高。对野外从事林业、农业生产的工作者危害极大。所以对研制相应特效治疗血清显得极为迫切。国外已有抗蝰蛇毒血清产品上市，主要针对分布于欧洲的蝰蛇种类制备，已生产使用的蝰蛇毒血清有河蝰、毒蝰、极北蝰、草原蝰抗血清等。英国药典1993年版第二卷记载的河蝰、毒蝰、极北蝰、草原蝰抗血清的效价分别为:抗河蝰(Vipera ammodytes Venom)抗血清不低于100LD₅₀，抗毒蝰(Vipera aspis Venom)不低于100LD₅₀，抗北极蝰(Vipera berus Venom)不低于50LD₅₀，抗草原蝰(Vipera ursinsi Venom)不低于150LD₅₀。

五步蛇(学名：尖吻蝮，地方名：白花蛇、蔪蛇、百步蛇等)属蝰蛇科蝮亚科，尖吻蝮属。五步蛇头大，明显三角形，吻端尖而向上翘。头背黑褐色，头侧自吻鳞经眼至口角上唇鳞以上均为黑褐色，以下黄白色，偶有少许黑褐色斑点。头腹及喉部为白色，散有少数黑褐色斑点。最大体长可达1.5m。五步蛇已知的分布地区有安徽、重庆、江西、浙江、福建、湖南、湖北、广西、贵州、广东及台湾省。国外只见于越南北部。

五步蛇生活在海拔100～1400m的山区或丘陵地带。大多栖息在山谷溪涧附近，偶尔也进入山区村宅。喜食鼠类、鸟类、蛙类、蟾蜍和蜥蜴。之所以称之为五步蛇，意指人类只要曾被其所咬，脚下踏出五步内必然会毒发倒地，以显示该蛇奇毒无比。该蛇种的毒液的单位上的毒性(对小白鼠之LD₅₀值)并不强烈，但是排毒量大，具有较大的危险性由五步蛇的咬击所导致的死亡事件是较为常见的(赵尔宓、黄美华等主编《中国动物志爬行纲第三卷》科学出版社1998年版390页)。

五步蛇毒素主要血循环毒素，包括凝血和抗凝血成分、出血因子、直接溶解纤维蛋白成分，直接溶血因子、细胞毒因子、降血压因子等。引起出血因子的主要因子是出血因子I(AaH1),分子量为22kD，此分子可破坏内皮细胞间质和基底膜，引起出血。凝血毒素有凝血酶样作用，能直接使纤维蛋白原凝固，能加速凝血酶原转化为凝血酶，造成弥散性血管内凝血，以致血液失凝及广泛出血。纤维蛋白溶解毒素能直接水解纤维蛋白和纤维蛋白原，使血凝过程产生的大量为血栓溶解，血内残留的纤维蛋白原也受水解破坏，发生纤维蛋白溶解症，造成全身多发性出血。五步蛇毒的蛋白水解酶能引起伤口局部严重炎症反应，伤口部位肿胀，剧烈疼痛。心脏毒素对各类细胞膜有不可逆的损害，细胞膜去极化，使细胞的结构和功能发生障碍。

对于上述类型的毒蛇，经常会发生人类被咬的情况，此时蛇毒的抗毒素就十分必要了，通常，蛇毒的抗毒素是用蛇毒免疫马匹等大动物，使之产生高效价抗体，随后采集这些动物的血浆，分离纯化相应的抗体制成抗毒素。由于大动物的来源受限，用采血的方法获取抗体的产量低，对动物有一定程度的伤害，需要一个能保护动物福利的替代方案。

生物的抗体是指机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B细胞——浆细胞所合成与分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。现今发现，禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫，分别受胸腺和法氏囊的控制。当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，禽蛋的卵黄对抗体(免疫球蛋白)有集聚作用，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgY)在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk，IgY)；IgY是鸟类的抗体，这相当于哺乳动物的IgG。

卵黄抗体(IgY)与哺乳动物IgG的功能相似，是一种多克隆抗体，具有典型的免疫球蛋白空间构象，正常鸡IgY的分子量约为180KDa，由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成，分子量分别为60～70KDa和22～30KDa。其等电点约为5.2。IgY移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgY可在卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgY。一个鸡蛋含有100～200毫克的IgY抗体。卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液，为刚出壳雏禽提供被动免疫保护，在雏禽疾病预防中具有重要作用。

IgY与一般哺乳动物IgG相比，IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。IgY具有良好的热稳定性，在温度高达75℃条件下，仍保持一定的生物学活性。65℃时可保持24h以上，70℃时加热90min后其活性才明显下降60℃，30min条件下巴氏消毒不影响IgY；高于80℃，大部分IgY失去活性。IgY制剂在4℃贮存5年或在室温贮存6个月其活性仍无明显下降，IgY在pH4.0～11.0时比较稳定，pH3.0～3.5时活性迅速下降，pH12时活性亦有所下降。IgY对胃蛋白酶有较高的抵抗力，将胃蛋白酶和IgY在pH2.0温育1h后，几乎所有活性丧失，但在pH4.0时1h后可保持91％的活性，甚至温育10h后仍有63％活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳酶温育8h，活性保持39％和41％。

与产生于哺乳动物的IgG相比，IgY还具有许多其他独特的优点：

(1)无需采血，只需收集免疫家禽所产下的蛋即可获得抗体；

(2)使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一的特异性IgY；

(3)由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应；

(4)不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或价阳性结果；作为治疗制剂使用时，无须考虑补体激活随之而来一系列副作用；

(5)耐热、耐酸，巴氏灭菌温度下也不会失活并且在pH值小于3时仍能保持稳定活性，可以用加热、低pH等方法进行灭活病毒处理，使得产品更加安全。

所以，采用IgY作为IgG的替代品是十分具有实现性的。

现今，圆斑蝰蛇和五步蛇在地域分布上重叠，这两种蛇伤都发生在偏远山区，交通不便，就医困难。发生蛇伤时，患者和医生有时难以判别是五步蛇还是蝰蛇致伤以致误用不相关的抗蛇毒血清，失去最佳救治机会。且国外现有的产品主要是基于欧洲分布的蝰蛇种类制备的，由于不同种类、不同地区的蝰蛇蛇毒抗原特异性具有种属差异和地域差异，国外蝰蛇抗血清用于治疗我国圆斑蝰蛇咬伤患者，针对性差，疗效不明显；另外圆斑蝰蛇排毒量多，毒性强，咬伤后发病迅速，死亡率高，需要高效价的抗毒素才能中和。

所以研制一种可从禽类IgY中得到、同时中和蝰蛇和五步蛇蛇毒、高效价、廉价且易于取得的抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体是十分具有实用价值的。

发明内容：

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种效价高，能具有很好的中和圆斑蝰蛇毒素和五步蛇毒素的功能，能保护人和动物在蝰蛇或五步蛇咬伤时免受圆斑蝰蛇毒素或五步蛇毒素的伤害，特异性高，反应灵敏，成本低，适于大规模推广应用的抗圆斑蝰蛇毒素和五步蛇毒素抗体及其相关制备方法和应用。

为了解决上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种抗圆斑蝰蛇毒素和五步蛇毒素抗体，其特点是，所述的抗圆斑蝰蛇毒素和/或五步蛇毒素抗体是采用圆斑蝰蛇毒素和/或五步蛇蛇毒经灭活后共同免疫母鸡产生的鸡卵黄IgY抗体或分别免疫母鸡、分别产生的抗圆斑蝰蛇蛇毒IgY和抗五步蛇蛇毒IgY混合而成，所述的圆斑蝰蛇毒素购自江西鹰潭蛇场广州办事处，批号200701；所述的五步蛇毒素购自浙江义乌蛇类研究所，批号200802。

较佳的，所述的圆斑蝰蛇毒素先后经PMSF、EDTA和碘乙酰胺处理进行灭活。所述的五步蛇毒素经甲醛处理进行灭活。

本发明有益效果在于：

本发明的抗圆斑蝰蛇毒素抗体是采用圆斑蝰蛇毒素经灭活后免疫母鸡产生的鸡卵黄IgY抗体，所述的圆斑蝰蛇毒素购自江西鹰潭蛇场广州办事处，批号200701，此免疫方法获得的抗体效价高，能具有很好的中和圆斑蝰蛇毒素的功能。本发明的抗五步蛇毒素抗体是采用五步蛇毒素经灭活后免疫母鸡产生的鸡卵黄IgY抗体，所述的五步蛇毒素购自浙江义乌蛇类研究所，批号200802，此免疫方法得到的抗体效价高，能具有很好的中和五步蛇毒素的功能。本发明将抗圆斑蝰蛇毒素抗体和抗五步蛇毒素抗体以1:1的比例混合，制成抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体制剂能保护人和动物在蝰蛇或五步蛇咬伤时免受相应蛇毒素的伤害，特异性高，反应灵敏，成本低，适于大规模推广应用。

在本发明的第二方面，提供了一种上述的抗圆斑蝰蛇毒素抗体的制备方法，其特点是，包括以下步骤：

A、抗原制备：采集圆斑蝰蛇毒素，然后进行灭活制得抗原；

B、免疫母鸡；将步骤A制得的抗原免疫母鸡，收集所述的母鸡所下的鸡蛋；母鸡可以是例如出生4～5个月的母鸡。

C、提取抗体；分离所述的鸡蛋中的鸡蛋黄，采用水溶法提取所述的鸡蛋黄中的IgY抗体，从而得到所述的抗圆斑蝰蛇毒素抗体。

较佳的，在所述的步骤A中，所述的圆斑蝰蛇毒素先后经PMSF、EDTA和碘乙酰胺处理进行灭活。

较佳的，在所述的步骤B中，所述的抗原与不完全福氏佐剂充分混匀后注射所述的母鸡，之后每隔10天加强免疫一次，共6次，连续收集4个月鸡蛋。注射采用多点皮下注射法，一般选用4点。

较佳的，在所述的步骤C中，将鸡蛋黄用注射用水稀释(通常5～6体积)，充分搅拌(pH可调整为2～8)，过滤(例如用帆布)，收集滤液，加硫酸铵(例如33％饱和度硫酸铵或80％饱和度硫酸铵)沉淀IgY抗体。

更佳的，在所述的步骤C后，还包括步骤：将所述的IgY抗体压滤后，将沉淀溶于注射用水，用超滤膜(例如10KD超滤膜)超滤除去硫酸铵，并加入磷酸钠缓冲液(例如pH7.0，20mM磷酸钠)，经DEAE-Sepharose FF和SP-Sepharose FF离子交换层析获得精制IgY抗体。

本发明还提供了一种上述的抗五步蛇毒素抗体的制备方法，其特点是，包括以下步骤：

A、抗原制备：采集五步蛇毒素，然后进行灭活制得抗原；

B、免疫母鸡；将步骤A制得的抗原免疫母鸡，收集所述的母鸡所下的鸡蛋；母鸡可以是例如出生4～5个月的母鸡。

C、提取抗体；分离所述的鸡蛋中的鸡蛋黄，采用水溶法提取所述的鸡蛋黄中的IgY抗体，从而得到所述的抗五步蛇毒素抗体。

较佳的，在所述的步骤A中，所述的五步蛇毒素经甲醛处理进行灭活。

较佳的，在所述的步骤B中，所述的抗原与不完全福氏佐剂充分混匀后注射所述的母鸡，之后每隔10天加强免疫一次，共6次，连续收集4个月鸡蛋。注射采用多点皮下注射法，一般选用4点。

较佳的，在所述的步骤C中，将鸡蛋黄用注射用水稀释(通常5～6体积)，充分搅拌(pH可调整为2～8)，过滤(例如用帆布)，收集滤液，加硫酸铵(例如33％饱和度硫酸铵或80％饱和度硫酸铵)沉淀IgY抗体。

更佳的，在所述的步骤C后，还包括步骤：将所述的IgY抗体压滤后，将沉淀溶于注射用水，用超滤膜(例如10KD超滤膜)超滤除去硫酸铵，并加入磷酸钠缓冲液(例如pH7.0，20mM磷酸钠)，经DEAE-Sepharose FF和SP-Sepharose FF离子交换层析获得精制IgY抗体。

本发明提供了一种抗圆斑蝰蛇和抗五步蛇毒素抗体的制备方法，其特点是，包括以下步骤：

A、抗原制备：采集五步蛇毒素，然后进行灭活制得抗原；采集圆斑蝰蛇蛇毒，进行灭活制得抗原

B、免疫母鸡；将步骤A制得的两种蛇毒抗原混合后免疫母鸡，收集所述的母鸡所下的鸡蛋；母鸡可以是例如出生4～5个月的母鸡。

C、提取抗体；分离所述的鸡蛋中的鸡蛋黄，采用水溶法提取所述的鸡蛋黄中的IgY抗体，从而得到所述的抗圆斑蝰蛇和抗五步蛇毒素抗体。

较佳的，在所述的步骤A中，所述的五步蛇毒素经甲醛处理进行灭活，所述的圆斑蝰蛇毒素先后经PMSF、EDTA和碘乙酰胺处理进行灭活。

较佳的，在所述的步骤B中，所述的抗原与不完全福氏佐剂充分混匀后注射所述的母鸡，之后每隔10天加强免疫一次，共6次，连续收集4个月鸡蛋。注射采用多点皮下注射法，一般选用4点。

较佳的，在所述的步骤C中，将鸡蛋黄用注射用水稀释(通常5～6体积)，充分搅拌(pH可调整为2～8)，过滤(例如用帆布)，收集滤液，加硫酸铵(例如33％饱和度硫酸铵或80％饱和度硫酸铵)沉淀IgY抗体。

更佳的，在所述的步骤C后，还包括步骤：将所述的IgY抗体压滤后，将沉淀溶于注射用水，用超滤膜(例如10KD超滤膜)超滤除去硫酸铵，并加入磷酸钠缓冲液(例如pH7.0，20mM磷酸钠)，经DEAE-Sepharose FF和SP-Sepharose FF离子交换层析获得精制IgY抗体。

本发明的有益效果在于：上述制备方法流程简单，适合工业化大生产。

在本发明的第五方面，提供了上述的圆斑蝰蛇毒素和五步蛇抗体在制备圆斑蝰蛇毒素和五步蛇毒素解毒剂中的应用。

在本发明的第六方面，提供了一种抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体免疫制剂，其特点是，包括上述的抗圆斑蝰蛇毒素抗体和抗五步蛇毒素抗体。

附图说明

图1为本发明实施例9的抗体样本的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离实验结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方法作进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

实施例1圆斑蝰蛇毒素灭活：

圆斑蝰蛇毒素冻干粉购自江西鹰潭蛇场广州办事处，批号200701，用pH7.0 20mMTris缓冲液溶解成20毫克/毫升浓度，加入PMSF至最其终浓度为0.8-1.2mM，搅拌后加入EDTA至0.8-1.5mM，调节蛋白浓度至1毫克/毫升，取100毫升蛇毒蛋白溶液加900毫升50mMpH7.8Tris缓冲液，离心4000rpm 30分钟，除去沉淀颗粒物质，上清缓缓倒入3000毫升含碘乙酰胺溶液(50mM Tris，1.33mM EDTA，2.67M NaCl，2.67M尿素，266.7mM碘乙酰胺pH 8.0)，充分混匀后置37度水浴箱避光反应3小时。反应结束后用分子量截留值10kD的Millipore板式超滤器超过滤，同时更换缓冲为pH7.0，50mM Tris，0.15M氯化钠缓冲液，将最终蛋白浓度浓缩到1毫克/毫升，低温保存备用。

低温新鲜采取五步蛇蛇毒，立即用pH7.0 20mM Tris缓冲液稀释10倍，离心4000rpm 30分钟，除去沉淀颗粒物质，调节蛋白浓度至20毫克/毫升，加入0.3-0.6％甲醛(v/v)，37℃保温2周后低温保存备用。

实施例2灭活蝰蛇毒素免疫健康母鸡：

用灭活圆斑蝰蛇毒素与福氏不完全佐剂等量混合，使最终的灭活毒素的浓度为0.5毫克/毫升，每羽母鸡每次注射0.5毫升，在第一次注射后，每隔10天强化注射一次，共4次；以后每隔45天加强免疫一次。共10羽母鸡免疫灭活蝰蛇毒素，鸡号分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

实施例3灭活五步蛇毒素免疫健康母鸡：

用灭活五步蛇毒素与福氏不完全佐剂等量混合，使最终的灭活毒素的浓度为0.5毫克/毫升，每羽母鸡每次注射0.5毫升，在第一次注射后，每隔10天强化注射一次，共4次；以后每隔45天加强免疫一次。共10羽母鸡免疫灭活五步蛇毒素，鸡号分别为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。

实施例4灭活圆斑蝰蛇毒素和灭活五步蛇毒素共同免疫健康母鸡：

用灭活五步蛇毒素和灭活蝰蛇毒素与福氏不完全佐剂等量混合，使最终的灭活的五步蛇毒素和蝰蛇毒素的浓度均为0.5毫克/毫升，每羽母鸡每次注射0.5毫升，在第一次注射后，每隔10天强化注射一次，共4次；以后每隔45天加强免疫一次。共10羽母鸡免疫灭活蝰蛇毒素与五步蛇毒素混合抗原，鸡号分别为21、22、23、24、25、26、27、28、29、30。

实施例5鸡血清抗圆斑蝰蛇毒素抗体ELISA效价测定：

于第一次免疫后40天经腋静脉取血1毫升，分离血清，采用间接ELISA法测定血清中的抗体效价。用pH 9.6，50mM碳酸钠缓冲液稀释天然圆斑蝰蛇毒素到1μg/ml的浓度，取96孔酶标板(Nunc-Maxisorb)，每孔加200微升稀释的圆斑蝰蛇蛇毒，37℃孵育2小时，倾去稀释的蛇毒，然后加200微升5％脱脂奶粉(溶于PBS-Tween 20(M-PBST))37℃封闭1小时。鸡血清用M-PBST稀释1024倍，IgY用M-PBST稀释1000倍后加到包被有蛇毒的孔内37℃孵育60分钟，充分洗涤后加入1:5000稀释的HRP标记抗鸡IgY(Sigma)，孵育60分钟后充分洗涤，显色，酶标仪上读数。表1、表2为ELISA的结果。

表1为鸡血清抗圆斑蝰蛇毒ELISA检测结果：免疫母鸡在免疫第0、10、20、30、40天分别采血，分离血清，检测抗体效价，(血清1024倍稀释)

实施例6卵黄抗圆斑蝰蛇毒素抗体ELISA法检测效价测定：

用pH 9.6，50mM碳酸钠缓冲液稀释天然圆斑蝰蛇毒素到1μg/ml的浓度，取96孔酶标板(Nunc-Maxisorb)，每孔加200微升稀释的圆斑蝰蛇蛇毒，37℃孵育2小时，倾去稀释的蛇毒，然后加200微升5％脱脂奶粉(溶于PBS-Tween 20(M-PBST))37℃封闭1小时。取每次免疫后7天的鸡蛋，分离卵黄，加6体积纯水，充分搅拌后2～8度放置过夜，取上清，用M-PBST稀释1000倍后加到包被有蛇毒的孔内37℃孵育60分钟，充分洗涤后加入1:5000稀释的HRP标记抗鸡IgY(Sigma)，孵育60分钟后充分洗涤，显色，酶标仪上读数。

表2为鸡免疫抗圆斑蝰蛇毒素IgY ELISA检测结果：免疫母鸡在免疫起始天(0天)，免疫第10、20、30、40天分别取蛋，初步分离IgY，用PBS稀释1000倍后进行效价检测，检测的结果为OD₄₉₅读数。

实施例7间接法ELISA测定抗五步蛇毒素抗体效价

用pH 9.6，50mM碳酸钠缓冲液稀释天然五步蛇蛇毒到1μg/ml的浓度，取96孔酶标板(Nunc-Maxisorb)，每孔加200微升稀释的五步蛇蛇毒，37℃孵育2小时，倾去稀释的蛇毒，然后加200微升5％脱脂奶粉(溶于PBS-Tween 20(M-PBST))37℃封闭1小时。鸡血清用M-PBST稀释1024倍，IgY用M-PBST稀释1000倍后加到包被有蛇毒的孔内37℃孵育60分钟，充分洗涤后加入1:5000稀释的HRP标记抗鸡IgY(Sigma)，孵育60分钟后充分洗涤，显色，酶标仪上读数。

表3为鸡血清抗五步蛇蛇毒ELISA检测结果，免疫母鸡在免疫第0、10、20、30、40天分别采血，分离血清，检测抗体效价。(血清1024倍稀释)

表4为鸡卵黄抗五步蛇IgY ELISA检测结果：免疫母鸡在免疫起始天(0天)，免疫第10、20、30、40天分别取蛋，分离IgY，获10mg/ml左右浓度的IgY，用PBS稀释1000倍后进行效价检测，检测的结果为OD₄₉₅读数。

实施例8ELISA法圆斑蝰蛇蛇毒和五步蛇蛇毒共同免疫母鸡的血清和卵黄IgY效价

用pH 9.6，50mM碳酸钠缓冲液稀释天然圆斑蝰蛇蛇毒到1μg/ml的浓度，取96孔酶标板(Nunc-Maxisorb)，每孔加200微升稀释的圆斑蝰蛇蛇毒，37℃孵育2小时，倾去稀释的蛇毒，然后加200微升5％脱脂奶粉(溶于PBS-Tween 20(M-PBST))37℃封闭1小时。共免疫鸡血清用M-PBST稀释1024倍，IgY用M-PBST稀释1000倍后加到包被有蛇毒的孔内37℃孵育60分钟，充分洗涤后加入1:5000稀释的HRP标记抗鸡IgY(Sigma)，孵育60分钟后充分洗涤，显色，酶标仪上读数。

表5共免疫鸡血清抗圆斑蝰蛇毒ELISA检测结果：免疫母鸡在免疫第0、10、20、30、40天分别采血，分离血清，检测抗体效价。(血清1024倍稀释)

表6为共免疫鸡卵黄抗圆斑蝰蛇毒素IgY ELISA检测结果：免疫母鸡在免疫起始天(0天)，免疫第10、20、30、40天分别取蛋，初步分离IgY，用PBS稀释1000倍后进行效价检测，检测的结果为OD₄₉₅读数。

用pH 9.6，50mM碳酸钠缓冲液稀释天然五步蛇蛇毒到1μg/ml的浓度，取96孔酶标板(Nunc-Maxisorb)，每孔加200微升稀释的五步蛇蛇毒，37℃孵育2小时，倾去稀释的蛇毒，然后加200微升5％脱脂奶粉(溶于PBS-Tween 20(M-PBST))37℃封闭1小时。共免疫鸡血清用M-PBST稀释1024倍，共免疫鸡卵黄IgY用M-PBST稀释1000倍后加到包被有蛇毒的孔内37℃孵育60分钟，充分洗涤后加入1:5000稀释的HRP标记抗鸡IgY(Sigma)，孵育60分钟后充分洗涤，显色，酶标仪上读数。

表7为共免疫鸡血清抗五步蛇蛇毒ELISA检测结果：免疫母鸡在免疫第0、10、20、30、40天分别采血，分离血清，检测抗体效价。(血清1024倍稀释)

表8为共免疫鸡卵黄抗五步蛇IgY ELISA检测结果:

免疫母鸡在免疫起始天(0天)，免疫第10、20、30、40天分别取蛋，分离IgY，获10mg/ml左右浓度的IgY，用PBS稀释1000倍后进行效价检测，检测的结果为OD₄₉₅读数。

实施例9分离提取抗蛇毒素的IgY:

鉴于圆斑蝰蛇蛇毒和五步蛇蛇毒共免疫母鸡蛋IgY的中和活性明显比免疫单价蛇毒的母鸡蛋IgY中和活性低，但其仍旧能够用于制备抗圆斑蝰蛇蛇毒和五步蛇蛇毒抗体，本实施例采用圆斑蝰蛇蛇毒和五步蛇蛇毒分别免疫母鸡所产的鸡蛋，分别制备IgY，然后根据相应的抗体效价进行混合而制得高效价的抗蝰蛇和五步蛇制品。具有抗体活性的抗蛇毒素卵黄抗体的产品可以通过下列步骤获得：挑选血清1024倍稀释后抗体ELISA滴度>2.0的母鸡产下的鸡蛋，将所获得的免疫鸡蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，取蛋黄。用搅拌机将蛋黄充分搅拌均匀后加入5倍体积的纯水进行稀释并混合均匀，用1N氢氧化钠溶液调节pH至5.8(±0.2)，继续搅拌使之完全混合均匀，置2～8℃冰库放置过夜；第二天，用压滤方法将沉淀和清液分离，收集过滤后的清液，加入固体硫酸铵使溶液达到33％饱和硫酸铵浓度，在冰库中持续搅拌3小时，使抗体蛋白充分沉淀；用压滤方法分离沉淀，将沉淀溶于纯化水中，溶解后的蛋白溶液用10KD超滤膜进行超滤置换缓冲液，所置换的缓冲液为pH7.0，20mM磷酸钠缓冲液，超滤后的液体即为初步纯化的抗体；DEAE-Sepharose FF凝胶用pH7.0，20mM磷酸钠缓冲液平衡，初步纯化的抗体直接过DEAE-Sepharose FF凝胶层析柱，大部分杂蛋白与DEAE-Sepharose FF凝胶结合，IgY抗体流穿后，收集流穿液，继而过事先用pH7.0，20mM磷酸钠缓冲液平衡过的SP-SepharoseFF离子交换凝胶层析柱，上样完毕后，凝胶柱用含50mM氯化钠的pH7.0，20mM磷酸钠缓冲液洗涤，然后用含250mM氯化钠的pH7.0，20mM磷酸钠缓冲液洗脱，洗脱液精制IgY抗体。

图1为抗体样本聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果，如图1所示，对抗体的纯度进行检测：将抗体样本用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后用银染法染色，检查染色条带，呈现单一的蛋白条带，未见其它杂蛋白条带。

实施例10IgY中和圆斑蝰蛇蛇毒活性试验(ED₅₀)

圆斑蝰蛇蛇毒LD₅₀初步确定实验：

选择体重18－20克小鼠进行蛇毒毒力初步确定试验。用生理盐水稀释圆斑蝰蛇毒至不同的浓度，每个浓度取0.5毫升腹腔注射一只小鼠，注射48小时观测小鼠的成活状况。根据预初试验的结果，初步推断出蛇毒致死的剂量。

圆斑蝰蛇蛇毒LD₅₀试验：

选择体重18－20克小鼠进行蛇毒毒力试验，每6只分成一组，所需组数则根据试验需要而定。采用Bliss简化几率单位法测定蛇毒毒力，以半数致死量LD₅₀表示。圆斑蝰蛇毒根据预初试验的结果把剂量调节至使用最高剂量时小鼠的死亡率接近100％，最小剂量时小鼠的死亡率接近0％，在最高剂量和最低剂量之间添加3－5个剂量组，各剂量组之间的比值衡定。注射蛇毒后观察48小时，记录小鼠的成活状况。本研究所用的圆斑蝰蛇毒素的LD₅₀为0.69mg毒素/kg小鼠体重。

中度有效剂量试验(The medium effective dose，ED₅₀)试验：

抗蛇毒IgY ED₅₀范围初步测定试验：

IgY的效价测定按国际通用的中和试验法进行动物试验，其方法是把抗原和特异性IgY抗体作用一定时间后，再给动物注射，借助动物体的反应情况来判定IgY的效价。本发明所用的动物试验方法是以动物死亡为反应指征，以小白鼠注射抗蛇毒IgY与蛇毒混合液后，动物的生存死亡情况，确定IgY的效价。

为了确定IgY的中和剂量范围，5LD₅₀剂量的圆斑蝰蛇蛇毒与不同浓度的IgY混合成1毫升体积后在37℃水浴箱中放置1小时，取0.4毫升这种混合液体注射到小鼠的腹腔内，每个浓度注射一只小鼠，观测小鼠在48小时内存活状态。通过这种预初试验获得小鼠100％存活和100％死亡所用的IgY的浓度范围。

根据IgYED₅₀范围初步测定试验获得的小鼠100％存活和100％死亡所用的IgY的浓度，将ED₅₀所用的IgY浓度在这个范围进行分组，每组试验的小鼠为5只，体重在18－20克之间。免疫IgY效价的测定采用固定蛇毒剂量、改变IgY剂量的方法，即取1毫升浓度蛇毒溶液(蛇毒以LD₅₀或mg为单位)加入1毫升含不同浓度的IgY，混合后置37℃1小时，取0.4毫升注射小白鼠腹腔内作中和反应测定之，以含IgY最低浓度量动物不死亡为中和终点，计算1毫升IgY中和蛇毒量。经测定，应用本发明所获得的1毫升蛋白浓度为100毫克/毫升的IgY能中和277LD₅₀的圆斑蝰蛇毒素。

实施例11IgY中和五步蛇蛇毒活性试验(ED₅₀)

五步蛇蛇毒LD₅₀初步确定实验：

选择体重18－20克小鼠进行蛇毒毒力初步确定试验。用生理盐水稀释五步蛇蛇毒至不同的浓度，每个浓度取0.5毫升腹腔注射一只小鼠，注射48小时观测小鼠的成活状况。根据预初试验的结果，初步推断出蛇毒致死的剂量。

五步蛇蛇毒LD₅₀试验：

选择体重18－20克小鼠进行蛇毒毒力试验，每6只分成一组，所需组数则根据试验需要而定。采用Bliss简化几率单位法测定蛇毒毒力，以半数致死量LD₅₀表示。五步蛇蛇毒根据预初试验的结果把剂量调节至使用最高剂量时小鼠的死亡率接近100％，最小剂量时小鼠的死亡率接近0％，在最高剂量和最低剂量之间添加3－5个剂量组，各剂量组之间的比值衡定。注射蛇毒后观察48小时，记录小鼠的成活状况。本研究所用的五步蛇毒素的LD₅₀为0.81mg毒素/kg小鼠体重。

中度有效剂量试验(The medium effective dose，ED₅₀)试验：

抗蛇毒IgY ED₅₀范围初步测定试验：

IgY的效价测定按国际通用的中和试验法进行动物试验，其方法是把抗原和特异性IgY抗体作用一定时间后，再给动物注射，借助动物体的反应情况来判定IgY的效价。本发明所用的动物试验方法是以动物死亡为反应指征，以小白鼠注射抗蛇毒IgY与蛇毒混合液后，动物的生存死亡情况，确定IgY的效价。

为了确定IgY的中和剂量范围，5LD₅₀剂量的五步蛇蛇毒与不同浓度的IgY混合成1毫升体积后在37℃水浴箱中放置1小时，取0.4毫升这种混合液体注射到小鼠的腹腔内，每个浓度注射一只小鼠，观测小鼠在48小时内存活状态。通过这种预初试验获得小鼠100％存活和100％死亡所用的IgY的浓度范围。

根据IgY ED₅₀范围初步测定试验获得的小鼠100％存活和100％死亡所用的IgY的浓度，将ED₅₀所用的IgY浓度在这个范围进行分组，每组试验的小鼠为5只，体重在18－20克之间。免疫IgY效价的测定采用固定蛇毒剂量、改变IgY剂量的方法，即取1毫升浓度蛇毒溶液(蛇毒以LD₅₀或mg为单位)加入1毫升含不同浓度的IgY，混合后置37℃1小时，取0.4毫升注射小白鼠腹腔内作中和反应测定之，以含IgY最低浓度量动物不死亡为中和终点，计算1毫升IgY中和蛇毒量。经测定，应用本发明所获得的1毫升蛋白浓度为100毫克/毫升的IgY能中和183LD₅₀的五步蛇毒素。

实施例12IgY抗体制剂原液制备

通过SP-Sepharose FF离子交换层析用250mM氯化钠洗脱抗五步蛇IgY和抗蝰蛇IgY分别用10kD超滤膜超滤，置换缓冲液为150mM氯化钠，20mM磷酸钠，Ph6.0～7.0，同时浓缩至蛋白浓度200～300克/升。分别测定两种IgY的LD₅₀，并用pH 6.5PBS(20mM磷酸钠，150mM氯化钠溶液稀释至每毫升抗五步蛇IgY能中和210～220LD50五步蛇蛇毒；每毫升抗蝰蛇IgY能中和420～440LD₅₀蝰蛇蛇毒。两种IgY等量混合，加入间甲酚使其最终浓度为0.2％(v/v)，分装成10毫升/支。

该IgY抗体制剂原液包含有以下组分：

1、精制特异性抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体IgY，其抗体效价能中和至少2000LD₅₀(小鼠)圆斑蝰蛇毒素和1000LD₅₀(小鼠)五步蛇毒素；蛋白浓度不大于200克/升；

2、0.15M氯化钠-渗透压保持剂；

3、0.2％间甲酚-防腐剂；

4、蒸馏水；

5、20mM磷酸钠-pH稳定剂。

实施例13抗蝰蛇和五步蛇IgY制品中和蝰蛇蛇毒活性试验和五步蛇蛇毒活性试验(ED₅₀)

为了验证抗蝰蛇IgY和抗五步蛇IgY混合后中和这两种毒素的效价不相互抑制，本研究又用本发明获得的IgY制品分别对蝰蛇和五步蛇毒素进行中和试验。

5LD₅₀剂量的蝰蛇蛇毒与不同浓度的抗蝰蛇蛇毒和抗五步蛇蛇毒IgY混合成1毫升体积后在37℃水浴箱中放置1小时，取0.4毫升这种混合液体注射到小鼠的腹腔内，每个浓度注射5只小鼠，观测小鼠在48小时内存活状态。通过这一试验测得每毫升抗蝰蛇IgY能中和270LD₅₀蝰蛇蛇毒。

5LD₅₀剂量的五步蛇蛇毒与不同浓度的抗蝰蛇蛇毒和抗五步蛇蛇毒IgY混合成1毫升体积后在37℃水浴箱中放置1小时，取0.4毫升这种混合液体注射到小鼠的腹腔内，每个浓度注射5只小鼠，观测小鼠在48小时内存活状态。通过这一试验测得每毫升抗蝰蛇IgY能中和135LD₅₀蝰蛇蛇毒。

本发明实施例所获得的混合抗体抗两种蛇毒的中和效价均比单一抗体的效价高，这是由于蝰蛇和五步蛇蛇毒中有些毒性成分具有相似的抗原性，其毒性能被这两种抗体中的任何一种部分中和。

在我国圆斑蝰蛇和五步蛇的分布区域相同，主要在南方山区，偏远乡村。这类地区医疗资源相对匮乏，蛇伤病人往往很难区分这两种毒蛇，以致错用抗毒素，而导致病情延误。本发明为了避免上述情况，将高效价抗圆斑蝰蛇毒素抗体和抗五步蛇毒素抗体混合，制备了能中和圆斑蝰蛇和五步蛇毒素的制剂用于圆斑蝰蛇或五步蛇蛇伤，可以避免病情延误，导致病人得不到及时救治的后果。

本发明实施例的制备方法过程简单，成本低廉，适合大规模生产。

综上所述的，本发明的抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇抗体的效价高，能具有很好的中和圆斑蝰蛇毒素和五步蛇毒素的功能，能保护人和动物在圆斑蝰蛇或五步蛇咬伤时免受这两类毒素的伤害。本制品特异性高，保护作用显著，成本低，适于大规模推广应用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (6)

1.一种抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：进行抗原制备：

进行圆斑蝰蛇毒素抗原制备，采集圆斑蝰蛇毒素，立即加入0.08-0.12M苯甲基磺酰氟，使所述的苯甲基磺酰氟与所述的圆斑蝰蛇毒素形成最终浓度为0.8-1.2mM的1毫升蛇毒溶液；然后加入乙二胺四乙酸溶液，使其中的乙二胺四乙酸浓度在0.8-1.5mM范围内，加入碘乙酰胺溶液，使所述的蛇毒溶液和所述的碘乙酰胺溶液充分搅拌混匀，使其中的碘乙酰胺浓度为100-200mM范围内，避光培育；反应完成后，超滤，洗脱除去残存的苯甲基磺酰氟、碘乙酰胺、乙二胺四乙酸等小分子物质并浓缩，灭活脱毒后制得所述的圆斑蝰蛇毒素抗原；

进行五步蛇毒素抗原制备：采集五步蛇毒素，用PBS稀释，然后加入甲醛，放置，灭活蛇毒制得所述的五步蛇毒素抗原；

步骤二：免疫母鸡：

将制得的所述的圆斑蝰蛇毒素抗原和所述的五步蛇毒素抗原分别免疫母鸡，分别收集圆斑蝰蛇毒素抗原免疫母鸡所下鸡蛋与五步蛇毒素抗原免疫母鸡所下鸡蛋；

步骤三：提取抗体：

分别分离圆斑蝰蛇毒素抗原免疫母鸡所下鸡蛋与五步蛇毒素抗原免疫母鸡所下鸡蛋中的鸡蛋黄，采用水溶法和离子交换方法分别提取IgY抗体，从而分别得到抗圆斑蝰蛇毒素抗体和抗五步蛇毒素抗体；

步骤四：将所述的抗圆斑蝰蛇毒素抗体和所述的抗五步蛇毒素抗体按1:1比例混合成所述的抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体。

2.一种抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

进行圆斑蝰蛇毒素抗原制备，采集圆斑蝰蛇毒素，立即加入0.8-1.2M苯甲基磺酰氟，使所述的苯甲基磺酰氟与所述的圆斑蝰蛇毒素形成最终浓度为0.8-1.2mM的1毫升蛇毒溶液；然后加入乙二胺四乙酸溶液和碘乙酰胺溶液，使所述的蛇毒溶液和所述的乙二胺四乙酸溶液、碘乙酰胺溶液充分搅拌混匀，避光培育；反应完成后，超滤，洗脱除去残存的苯甲基磺酰氟、碘乙酰胺、乙二胺四乙酸等小分子物质并浓缩，灭活脱毒后制得所述的圆斑蝰蛇毒素抗原；进行五步蛇毒素抗原制备：采集五步蛇毒素，用PBS稀释，然后加入甲醛，放置，灭活蛇毒制得所述的五步蛇毒素抗原；

步骤二：免疫母鸡：

将制得的所述的圆斑蝰蛇毒素抗原和所述的五步蛇毒素抗原混合后免疫母鸡，收集所述的混合免疫母鸡所下的鸡蛋；

步骤三：提取抗体：

分离所述的混合免疫母鸡所下鸡蛋中的鸡蛋黄，采用水溶法和离子交换方法提取所述的混合免疫母鸡所下鸡蛋黄中的IgY抗体，从而得到所述的抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体。

3.根据权利要求1或2中任一所述的抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体的制备方法，其特征在于，所述的圆斑蝰蛇毒素先后经苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸和碘乙酰胺

处理进行灭活；

所述的五步蛇毒素经甲醛处理进行灭活。

4.根据权利要求1或2中任一所述的抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体的制备方法，其特征在于，免疫母鸡的方法为：用抗原与不完全福氏佐剂充分混匀后注射所述的母鸡，之后每隔10天加强免疫一次，共6次，连续收集4个月鸡蛋。

5.根据权利要求1或2中任一所述的抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体的制备方法，其特征在于，分离鸡蛋黄的方法为：将鸡蛋黄用注射用水稀释，充分搅拌，过滤，收集滤液，加硫酸铵沉淀IgY抗体。

6.根据权利要求1或2中任一所述的抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体的制备方法，其特征在于，提取IgY抗体的方法为：将所述的IgY抗体压滤后，将沉淀溶于注射用水，用超滤膜超滤除去硫酸铵，并加入磷酸钠缓冲液，经离子交换层析获得精制IgY抗体。