CN107312090A - 抗平颏海蛇毒素抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗平颏海蛇毒抗体，其是采用平颏海蛇毒素经灭活而成的平颏海蛇毒素抗原免疫马匹产生的IgG抗体。该抗平颏海蛇毒抗体的制备方法包括如下步骤：步骤一：抗原制备：称取平颏海蛇毒素，然后进行灭活制得所述的平颏海蛇毒素抗原；步骤二：免疫马匹：将步骤一制得的所述的平颏海蛇毒素抗原与马细胞因子的佐剂混合后免疫马匹，收集所述马匹的血浆；步骤三：提取抗体：从步骤二制得的血浆中提取马抗平颏海蛇毒免疫球蛋白F(ab’)₂。此外，本发明还公开了所述的抗平颏海蛇毒素抗体在制备抗海蛇血清制剂中的应用。本发明能保护人和动物在平颏海蛇咬伤时免受平颏海蛇毒素中毒，所获抗体特异性高，反应灵敏，适于大规模推广应用。

Description

抗平颏海蛇毒素抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，更具体地，涉及抗蛇毒抗体技术领域，特别是指一种抗平颏海蛇毒素抗体；此外，本发明还涉及该抗平颏海蛇毒素抗体的制备方法和应用。

背景技术

海蛇均为剧毒蛇，是最危险的海洋生物之一，主要分布于澳大利亚北部至东南亚海域，全球范围约50种，我国海域有19种，其分布北起辽宁、南至海南及广西沿海，其中分布最广、数量最多、咬伤发病率较高的海蛇为平颏海蛇(Lapemis curtus)和青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)。平颏海蛇的毒性极强，比陆上最毒的蛇毒还要强得多。因其毒液是多种蛋白的混合物，冷冻干燥后的平颏海蛇毒中多肽占90％左右，其中包含酶、多肽毒素及小肽等，经一级结构分析，平颏海蛇神经毒素的短肽链由60－62个氨基酸残基组成的单链，有4个二硫键；长肽链由66－74个氨基酸残基组成，一般有5个二硫键。它们高专一性结合乙酰胆碱受体，阻断突触传递，主要是阻断胆碱能神经肌肉接头部位，引起麻痹，多以呼吸肌麻痹而导致窒息死亡。现已证明，多种海蛇毒均有共同的抗原，现用免疫学方法，制备出抗蛇毒血清，如裂颏海蛇毒的抗毒素能中和7－8种海蛇毒素，还能中和多种陆地蛇毒如蝰、眼镜蛇、眼镜王蛇等的蛇毒。故平颏海蛇抗毒素血清，有广泛使用价值，临床上可用于治疗毒蛇咬伤尤其是含有神经毒素的毒蛇如金环蛇、银环蛇等的咬伤。

平颏海蛇毒素毒性很强，其毒性相当眼镜蛇毒的50倍，是氰化钠毒性的80倍，3.5毫克的平颏海蛇毒液就足以使一个成年人丧命。这仅仅是眼镜蛇毒致死剂量的五分之一，而这种平颏海蛇的毒性在海蛇中还不是最毒的。据对120起被平颏海蛇咬伤的例子分析，平颏海蛇主要是当渔民在提网、拣鱼时，当涉水或潜水作业时，被它所咬。所以，在人口密度大、平颏海蛇多的地方，特别是河口附近，水质混浊的地方，平颏海蛇会对人构成很大的威胁。泰国、越南和印度沿海地区就常有人被平颏海蛇咬伤或咬死。海蛇咬伤也是部队滨海训练和未来重点作战海域军事行动及海岛居民面临的重要医疗卫生问题。如不及时处理，海蛇咬伤患者死亡率高达50％。因此，研制特效海蛇咬伤救治药物具有十分重要的现实意义。

免疫佐剂也称佐剂或抗原佐剂，是一类单独使用时一般无免疫原性，但是与抗原物质合并使用时能增强抗原物质免疫原性，增强机体免疫应答，或改变机体免疫应答反应类型的物质。免疫佐剂的生物作用包括：抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性状，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用；可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变；改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。

细胞因子(Cytokine,CK)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称，细胞因子介导多种免疫细胞间的相互作用。天然的细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞分泌；且多以单体形式存在；以非特异性方式发挥作用。参与免疫应答与免疫调节，如 IFN-γ刺激APC表达MHC-II；IL-1辅助T细胞活化；IL-2、4、5、6、GM-CSF等促进T、B细胞的增殖与分化；TNF-α、IL-1、IFN-γ等激活巨噬细胞，增强吞噬杀伤活性，TNF-αTNF-b具有细胞毒性并刺激中性粒细胞，IFN-γ抑制病毒复制。为了提高马匹免疫后机体免疫水平，以增强马的抵抗力，本申请发明人试用几种不同马细胞因子的佐剂，配合抗原免疫马匹。发现含有GMCSF的佐剂可以明显提高被免疫动物的抗体滴度。

甲醛常用来灭活病毒制造疫苗，或者用于毒素灭活生产类毒素，是一种经典的灭活方法。目前国内蛇毒灭活方法是甲醛灭活法，此法系将毒素和甲醛混合或对甲醛透析3-7天或更长时间进行脱毒，导致高度交联的蛇毒。这个脱毒反应比较复杂，涉及赖氨酸与吲哚、苯环、胍、ε-NH2、酰胺等基团交联形成亚甲基桥。这种交联桥的生成使得蛋白相互链接形成很大的复合物，同时，这种反应是很难调控和重复，抗原的构象因此而发生改变，部分抗原表位被屏蔽(Visser J,Chapman DS.Snakes and snakebite.Cape Town,Struik,1978)。灭活毒素不像天然毒素，失去了部分能产生中和作用抗体的表位。表现为免疫后抗体的滴度很高，但是仅有很小一部分抗体具有中和蛇毒活性(WHO Guidelines for theProduction, Control and Regulation of Snake Antivenom Immunoglobulins.2008)。甲醛处理过的灭活蛇毒和抗蛇毒血清混合培育后，这些血清仍能中和蛇毒毒性，这从另外一个方面说明甲醛灭活抗原的构象发生了重大的变化。平颏海蛇的神经毒素分子量小，毒性大，免疫原性差，既不容易脱毒又很难免疫获得高中和活性的抗体。同时，甲醛灭活是不完全的，有部分抗原的毒性位点未被消除，毒性没有完全被去除。甲醛灭活蛇毒免疫动物时反应很大，注射后常出现颤抖，发热，甚至出现神经和血液系统的症状，而导致死亡。用甲醛灭活的蛇毒免疫马等大型动物，需要大剂量抗原才能产生可用于治疗的抗毒素效价。这种方法使得动物不能耐受，也成为我们抗毒素生产中一个瓶颈。总之，甲醛灭活蛇毒仍保留蛇毒的部分毒性、蛇毒抗原构象改变、抗原性下降，导致动物免疫时不能耐受，获得的中和抗体效价低。本发明采用蛋白烷基化试剂碘乙酰胺烷基化平颏海蛇毒，这种方法灭活的蛇毒蛋白其构象不发生明显变化，保留着天然蛇毒的关键性抗原表位，免疫后可以产生高效价中和抗体。同时高保真的蛇毒的应用，得以降低动物免疫用的抗原用量，动物的副反应明显降低，体质获得提高，免疫系统的功能可以正常发挥，比较迅速地产生高滴度的中和抗体。

WHO明确指出，传统的草药以及一般的药物对平颏海蛇毒素无解毒作用，唯有特异的抗平颏海蛇血清才有治疗效果，因此非常有必要研究抗平颏海蛇毒血清。平颏海蛇毒的毒性成分主要是小分子多肽，这些小肽的免疫原性比较弱，用常规的免疫方法不能获得高效价的抗血清，为此亟需研发一种高效价的抗平颏海蛇血清。

发明内容：

本发明要解决的技术问题就是针对以上存在的问题与不足，提供一种效价高，能具有很好的中和平颏海蛇毒素的功能，能保护人和动物平颏海蛇咬伤时免受平颏海蛇毒素伤害，特异性高，反应灵敏，适于大规模推广应用的抗平颏海蛇毒素抗体及其相关制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种抗平颏海蛇毒素抗体，其是采用平颏海蛇毒素经灭活而成的平颏海蛇毒素抗原免疫马匹产生的IgG抗体。

较佳的，所述的平颏海蛇毒素依次经苯甲基磺酰氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)和碘乙酰胺处理进行灭活。

较佳的，所述平颏海蛇毒素经灭活而成的平颏海蛇毒素抗原与重组马GMCSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)混合后免疫马匹，然后提取马抗平颏海蛇毒免疫球蛋白F(ab’)₂。

在本发明的第二方面，提供了一种上述的抗平颏海蛇毒素抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：抗原制备：称取平颏海蛇毒素，然后进行灭活制得所述的平颏海蛇毒素抗原；

步骤二：免疫马匹：将步骤一制得的所述的平颏海蛇毒素抗原免疫马匹，收集所述马匹的血浆；

步骤三：提取抗体：从步骤二制得的血浆中提取马抗平颏海蛇毒免疫球蛋白F(ab’)₂。

较佳的，在所述的步骤一中，所述的平颏海蛇毒素依次经PMSF、EDTA和碘乙酰胺处理进行灭活。

较佳的，在所述的步骤二中，用所述的平颏海蛇毒素抗原与重组马GMCSF混匀后注射所述的马匹，收集免疫马匹的血浆。更佳的，所述的平颏海蛇毒素抗原与重组马GMCSF佐剂等量混匀后注射所述的马匹，使最终的灭活毒素的浓度为5毫克/毫升、重组马GMCSF浓度为 20微克/毫升，之后每隔10天加强免疫一次，共5次或6次，免疫50天或60天后采集免疫马匹血浆。注射采用多点皮下注射法，一般选用4点。

较佳的，在所述的步骤三中，所述提取马抗平颏海蛇毒免疫球蛋白F(ab’)₂的方法包括如下步骤：步骤A.将所述的血浆和胃蛋白酶消化溶液用硫酸铵沉淀、压滤后，将滤出液加硫酸铵二次沉淀，沉淀免疫球蛋白F(ab’)₂。更具体地，步骤A.将血浆用注射用水稀释(通常 1-2倍体积)，充分搅拌(pH可调整为2.8-3.6)，加胃蛋白酶消化，消化结束后加硫酸铵(例如25％饱和度)沉淀杂蛋白。压滤除去沉淀后上清加硫酸铵(例如至50％饱和度)，沉淀免疫球蛋白F(ab’)₂。

更佳的，在所述的步骤A后，还包括步骤B：将所述的免疫球蛋白F(ab’)₂压滤后，将沉淀溶于注射用水，用超滤膜(例如50KD超滤膜)超滤除去硫酸铵，并加入磷酸钠缓冲液(例如pH 7.0，20mM磷酸钠)，经(DEAE-Sepharose FF)离子交换层析获得精制免疫球蛋白 F(ab’)₂。

在本发明的第三方面，提供了上述的抗平颏海蛇毒素抗体在制备抗海蛇血清制剂中的应用。。

较佳的，所述抗平颏海蛇毒素抗体为马抗平颏海蛇毒免疫球蛋白F(ab’)₂，其抗体效价为每毫升制品能中和至少20LD₅₀平颏海蛇毒素，蛋白浓度不大于170克/升。

本发明有益效果在于：

1、本发明的抗平颏海蛇毒素抗体是采用平颏海蛇毒素经灭活后免疫马匹，此免疫方法获得的抗体效价高，能具有很好的中和平颏海蛇毒素的功能。制成抗平颏海蛇毒素抗体制剂能保护人和动物在平颏海蛇免受相应蛇毒素的伤害，抗体特异性高，反应灵敏，适于大规模推广应用。经实验验证，采用碘乙酰胺灭活平颏海蛇毒素与重组马GMCSF免疫马匹，其免疫马匹获得的血浆抗体效价明显高于用甲醛灭活平颏海蛇毒素与福氏不完全佐剂免疫马匹来源的血浆，用其制备的抗平颏海蛇毒血清的效价比后者高1倍以上，达到了预料不到的技术效果。因此，本发明优选重组马GMCSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)佐剂结合新型碘乙酰胺抗原灭活方法制备平颏海蛇毒抗原佐剂混合注射剂对马匹进行免疫，获得含有高效价抗体的马血浆并以此为原料制备抗平颏海蛇血清。

2、上述制备方法流程简单，十分具有实用性，适合工业化大生产。

附图说明

图1为本发明实施例9中不同浓度的碘乙酰胺灭活平颏海蛇毒素加重组马GMCSF佐剂免疫马匹得到的海蛇抗毒血清对抗5LD₅₀的小鼠生存曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方法作进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

实施例1 碘乙酰胺法灭活平颏海蛇毒素：

平颏海蛇毒素冻干粉用pH 7.0 20mM Tris缓冲液溶解成20毫克/毫升浓度，加入PMSF (苯甲基磺酰氟)至其终浓度为0.8-1.2mM，蛋白浓度为20毫克/毫升；搅拌后加入EDTA(乙二胺四乙酸溶液)至其浓度为0.8-1.5mM，调节蛋白浓度至1毫克/毫升，取100毫升蛇毒蛋白溶液加900毫升50mM pH 7.8Tris缓冲液，离心4000rpm 30分钟，除去沉淀颗粒物质，上清缓缓倒入3000毫升含碘乙酰胺溶液(50mM Tris，1.33mM EDTA，2.67M NaCl， 2.67M尿素，266.7mM碘乙酰胺pH 8.0)，充分混匀，使其中的碘乙酰胺浓度为100-200mM 范围内，置37℃水浴箱避光反应3小时。反应结束后用分子量截留值10kD的Millipore板式超滤器超过滤，同时更换缓冲为pH7.0，50mM Tris，0.15M氯化钠缓冲液，将最终蛋白浓度浓缩到20毫克/毫升，低温保存备用。

实施例2 甲醛灭活平颏海蛇毒素：

平颏海蛇毒素冻干粉用pH 7.0 20mM Tris缓冲液溶解成20毫克/毫升浓度，离心4000rpm 30分钟，除去沉淀颗粒物质，加入0.3-0.6％甲醛(v/v)，37℃保温2周后低温保存备用。

实施例3 重组马GMCSF制备

根据中国发明专利申请CN201110090267.0所述，用基因工程的方法，在大肠杆菌中表达，获得的包涵体经变性、复性、层析、透析等方法制备而成，用此方法得到的重组马GMCSF的纯度大于95％，蛋白浓度在0.01-50毫克/毫升范围，比活性等于或大于4x10⁶unit/mg。

实施例4 碘乙酰胺灭活平颏海蛇毒素加入重组马GMCSF佐剂免疫健康马匹：

用碘乙酰胺灭活平颏海蛇毒素(实施例1制得)与重组马GMCSF佐剂等量混合，使最终的灭活毒素的浓度为5毫克/毫升、重组马GMCSF浓度为20微克/毫升，每匹马每次注射1毫升，在第一次注射后，每隔10天强化注射一次，共5次；第5次免疫10天后采集血浆。共5匹马免疫碘乙酰胺灭活平颏海蛇毒素与重组马GMCSF佐剂配制而成的抗原，马号分别为1、 2、3、4、5。

实施例5 甲醛灭活平颏海蛇毒素加福氏不完全佐剂免疫健康马匹：

用灭活平颏海蛇毒素(实施例2制得)与福氏不完全佐剂等量混合，使最终的灭活毒素的浓度为5毫克/毫升，每匹马每次注射1毫升，在第一次注射后，每隔10天强化注射一次，共5次；第5次免疫10天后采集血浆。共5匹马免疫甲醛灭活平颏海蛇毒素与福氏不完全佐剂配制而成的抗原，马号分别为11、12、13、14、15。

实施例6 碘乙酰胺灭活平颏海蛇毒素加福氏不完全佐剂免疫健康马匹：

用灭活平颏海蛇毒素(实施例1制得)与福氏不完全佐剂等量混合，使最终的灭活毒素的浓度为5毫克/毫升，每匹马每次注射1毫升，在第一次注射后，每隔10天强化注射一次，共 5次；第5次免疫10天后采集血浆。共5匹马免疫碘乙酰胺灭活平颏海蛇毒素与福氏不完全佐剂配制而成的抗原，马号分别为21、22、23、24、25。

实施例7 马抗平颏海蛇毒血清ELISA效价测定：

于每次免疫后10天经颈静脉取血1毫升，分离血清，采用间接ELISA法测定血清中的抗体效价。用pH 9.6，50mM碳酸钠缓冲液稀释天然平颏海蛇毒素到1μg/ml的浓度，取96孔酶标板(Nunc-Maxisorb)，每孔加200微升稀释的平颏海蛇蛇毒，37℃孵育2小时，倾去稀释的蛇毒，然后加200微升5％脱脂奶粉(溶于PBS-Tween 20(M-PBST))37℃封闭1小时。马血清用M-PBST稀释1024倍，后加到包被有蛇毒的孔内37℃孵育60分钟，充分洗涤后加入1:5000稀释的HRP标记抗马IgG(Sigma)，孵育60分钟后充分洗涤，显色，酶标仪上读数。

下表1为马抗平颏海蛇毒血清ELISA检测效价结果：免疫马匹在免疫第10、20、30、40、 50天分别采血，分离血清，检测抗体效价，(血清1024倍稀释)检测的结果为OD₄₉₅读数。

表1 马抗平颏海蛇毒血清ELISA检测效价结果

实施例8 分离提取用碘乙酰胺灭活平颏海蛇毒素与重组马GMCSF免疫马匹来源的血浆中的免疫球蛋白F(ab’)₂:

马号1、2、3、4、5的马匹在第五次免疫后的第十天和第十二天，每匹马各采取3000毫升血浆，混合后加注射用水90升，调节pH至3.5，加胃蛋白酶150克，30℃消化90分钟后加硫酸铵180公斤，温度升至57-58℃，搅拌30分钟，压滤取滤过液，按每升滤过液加200 克硫酸铵的比例加入硫酸铵，充分搅拌后压滤取沉淀。沉淀加60升注射用水，超过滤除去硫酸铵并浓缩至15升并进行超滤置换缓冲液，所置换的缓冲液为pH 7.0磷酸钠缓冲液，超滤后的液体过Q-Sepharose FF凝胶，大部分杂蛋白与Q-Sepharose FF凝胶结合，IgG抗体流穿后，收集流穿液，继而过事先用pH 7.0，20mM磷酸钠缓冲液平衡过的SP-SepharoseFF离子交换凝胶层析柱，上样完毕后，凝胶柱用含50mM氯化钠的pH 7.0，20mM磷酸钠缓冲液洗涤，然后用含250mM氯化钠的pH 7.0，20mM磷酸钠缓冲液洗脱，洗脱液精制IgG抗体。

实施例9 分离提取用甲醛灭活平颏海蛇毒素与福氏不完全佐剂免疫马匹来源的血浆中的免疫球蛋白F(ab’)₂:

马号11、12、13、14、15的马匹在第五次免疫后的第十天和第十二天，每匹马各采取3000 毫升血浆，纯化方法同实施例8。

实施例10 平颏海蛇毒毒性试验(LD₅₀)

1)平颏海蛇蛇毒LD₅₀初步确定实验：

(1)平颏海蛇毒素：用稀释液溶解配制为0.5mg/ml(作为母液)

稀释液：硼酸盐缓冲液

氯化钠 8.5g

硼酸 4.5g

硼砂 0.5g

加蒸馏水至1000ml,过滤，调pH值为7～7.4灭菌后使用。

(2)毒力初步测定：选择体重18－20克小鼠进行蛇毒毒力初步确定试验。用生理盐水稀释平颏海蛇毒至不同的浓度，每个浓度取0.5毫升腹腔注射一只小鼠，注射48小时观测小鼠的成活状况。根据预初试验的结果，初步推断出蛇毒致死的剂量。毒素最小剂量定为0.5 μg/g，小鼠存活，最大剂量为2μg/g小鼠死亡。

2)平颏海蛇蛇毒LD₅₀试验：

(1)动物分组：昆明小鼠分10组，每组6只，空白对照组2只，共62只。体重20克。

毒素梯度稀释，注射小鼠

(2)每只小鼠注射量：200μl/只，每组配制10只小鼠的注射量

(3)通过改良寇氏法计算平颏海蛇毒素LD₅₀，剂量必须按等比级数分组，而且最小剂量组的阳性反应率应为0％，最大剂量组的阳性反应率应为100％，经过前期实验摸索，毒素最小剂量定为0.5μg/g，最大剂量为2μg/g，总共十组，组间等比倍数为1.17，因此每组小鼠的毒素注射剂量如下表2：

表2 小鼠LD₅₀测定试验

观察各组小鼠的死亡情况

3)实验结果

改良寇氏法计算公式：LD₅₀＝lg-1[X_m-i(∑p-0.5)]

本次实验中：D_m(最大剂量)为2μg/g，r(组间倍数)为1.17，X_m为lgD_m；i为lgr；p 为各组阳性反应(死亡)发生率，根据实验数据计算毒素LD₅₀为1μg/g，即1μg/g剂量的平颏海蛇毒素能使半数小鼠死亡。

实施例11 用碘乙酰胺灭活平颏海蛇毒素与重组马GMCSF免疫马匹来源的血浆制备的抗平颏海蛇毒血清中度有效剂量试验(The medium effective dose，ED₅₀)试验：

抗平颏海蛇毒血清ED₅₀范围初步测定试验：

抗平颏海蛇毒血清效价测定按国际通用的中和试验法进行动物试验，其方法是把抗原和特异性IgG抗体作用一定时间后，再给动物注射，借助动物体的反应情况来判定IgG的效价。本发明所用的动物试验方法是以动物死亡为反应指征，以小白鼠注射抗蛇毒IgG与蛇毒混合液后，动物的生存死亡情况，确定IgG的效价。

为了确定IgG的中和剂量范围，5LD₅₀剂量的平颏海蛇蛇毒与不同浓度的IgG混合成1毫升体积后在37℃水浴箱中放置1小时，取0.4毫升这种混合液体注射到小鼠的腹腔内，每个浓度注射一只小鼠，观测小鼠在48小时内存活状态。通过这种预初试验获得小鼠100％存活和100％死亡所用的IgG的浓度范围。

根据IgG ED₅₀范围初步测定试验获得的小鼠100％存活和100％死亡所用的IgG的浓度，将 ED₅₀所用的IgG浓度在这个范围进行分组，每组试验的小鼠为6只，体重在20克。免疫IgG 效价的测定采用固定蛇毒剂量、改变IgG剂量的方法，即取0.5毫升浓度蛇毒溶液(蛇毒以 LD₅₀或mg为单位)加入0.5毫升含不同浓度的IgG，混合后置37℃1小时，取0.4毫升注射小白鼠腹腔内作中和反应测定之，以含IgG最低浓度量动物不死亡为中和终点，计算1毫升IgG中和蛇毒量。

1.实验方法

前期准备

1)平颏海蛇毒素：用稀释液溶解配制为0.5mg/ml。

稀释液：硼酸盐缓冲液

氯化钠 8.5g

硼酸 4.5g

硼砂 0.5g

加蒸馏水至1000ml,过滤，调pH值为7～7.4灭菌后使用。

2)抗海蛇毒素血清准备：

抗海蛇血清原液10毫升，检测蛋白浓度为81mg/ml。

3)动物分组：昆明小鼠分10组，每组6只，对照组(纯毒素组)2只，共62只。体重 20克。

注：本次抗毒血清ED₅₀测定是针对于平颏海蛇毒素5LD₅₀(0.1mg/只)而进行，即能使半数注射过5LD₅₀毒素量的小鼠存活的抗毒血清量。

样品混合、注射小鼠

1)每只小鼠注射量：400μl/只

2)每组配制10只小鼠的注射量

3)毒素与抗血清在37℃孵育45分钟

4)通过改良寇氏法计算ED₅₀，剂量必须按等比级数分组，而且最小剂量组的阳性反应率应为0％，最大剂量组的阳性反应率应为100％，经过前期实验摸索，最小剂量定为0.05mg/g，最大剂量为0.405mg/g，总共十组，组间等比倍数为1.26，因此每组小鼠的注射剂量如下表 3：

表3 马抗海蛇毒血清ED₅₀测定试验

观察小鼠24～48小时，详细记录发病和死亡情况。

2.实验结果

1)小鼠发病和死亡情况

第一组死亡6只，存活率0％

第二组死亡6只，存活率0％

第三组死亡6只，存活率0％

第四组死亡6只，存活率0％

第五组死亡6只，存活率0％

第六组死亡6只，存活率0％

第七组死亡5只，存活率16.7％

第八组到第十组全部存活，存活率100％

对照组(纯毒素组)全部死亡，具体死亡时间在图1中有详细记录，详见图1。

2)改良寇氏法计算ED₅₀

计算公式：ED₅₀＝lg^-1[X_m-i(∑p-0.5)]

本次实验中：D_m(最大剂量)为0.405mg/g，r(组间倍数)为1.26，X_m为lgDm；i为lgr；p为各组阳性反应(存活)发生率，根据以上数据计算ED₅₀为0.215mg/g，即0.215mg/g剂量的海蛇抗毒血清能使半数注射过5LD₅₀毒素的小鼠存活。

3)海蛇抗毒血清中和平颏海蛇毒素剂量

根据实验可知，0.2ml浓度为25.5mg/ml的血清即能对抗0.1mg毒素，所以应用本发明所获得的1毫升蛋白浓度为81mg/ml的IgG能中和1.6mg的平颏海蛇毒素。

实施例12 用甲醛灭活平颏海蛇毒素与福氏不完全佐剂免疫马匹来源的血浆制备的抗平颏海蛇毒血清中度有效剂量试验(The medium effective dose，ED₅₀)试验：

1.实验方法

前期准备

1)平颏海蛇毒素：用稀释液溶解配制为0.5mg/ml

稀释液：硼酸盐缓冲液

氯化钠 8.5g

硼酸 4.5g

硼砂 0.5g

加蒸馏水至1000ml,过滤，调pH值为7～7.4灭菌后使用。

2)抗海蛇毒素血清准备：

抗海蛇血清原液10毫升，检测蛋白浓度为80mg/ml

3)动物分组：昆明小鼠分6组，每组6只，对照组(纯毒素组)2只，共38只。体重 20克。

注：本次抗毒血清ED₅₀测定是针对于平颏海蛇毒素5LD₅₀(0.1mg/只)而进行，即能使半数注射过5LD₅₀毒素量的小鼠存活的抗毒血清量。

样品混合、注射小鼠

1)每只小鼠注射量：400ul/只

2)每组配制6只小鼠的注射量

3)毒素与抗血清在37℃孵育45分钟。

4)通过改良寇氏法计算ED₅₀，剂量必须按等比级数分组，而且最小剂量组的阳性反应率应为 0％，最大剂量组的阳性反应率应为100％，经过前期实验摸索，最小剂量定为0.2mg/g，最大剂量为0.792mg/g，总共六组，组间等比倍数为1.32，因此每组小鼠的注射剂量如下：

观察小鼠24～48小时，详细记录发病和死亡情况。

表4

观察小鼠24～48小时，详细记录发病和死亡情况。

2.实验结果

1)小鼠发病和死亡情况

第一组死亡6只，存活率0％

第二组死亡5只，存活率16.7％

第三组死亡4只，存活率33.3％

第四组死亡4只，存活率33.3％

第五组死亡2只，存活率66.7％

第六组死亡0只，存活率100％

对照组(纯毒素组)全部死亡。

2)改良寇氏法计算ED₅₀

计算公式：ED₅₀＝lg^-1[Xm-i(∑p-0.5)]

本次实验中：D_m(最大剂量)为0.792mg/g，r(组间倍数)为1.32，X_m为lgD_m；i为lgr；p为各组阳性反应(存活)发生率，根据以上数据计算ED₅₀为0.46mg/g，即0.46mg/g剂量的海蛇抗毒血清能使半数注射过5LD₅₀毒素的小鼠存活。

实施例13 抗海蛇血清制剂原液制备

通过SP-Sepharose FF离子交换层析用250mM氯化钠洗脱抗海蛇毒血清用10kD超滤膜超滤，置换缓冲液为150mM氯化钠，20mM磷酸钠，pH 6.0～7.0，同时浓缩至蛋白浓度80-170 克/升。测定抗血清的ED₅₀，并用pH 6.5PBS(20mM磷酸钠，150mM氯化钠溶液)稀释至每毫升抗血清能中和20～30LD₅₀海蛇毒，加入间甲酚使其最终浓度为0.2％(v/v)，分装成5 毫升/支。

该抗血清制剂原液包含有以下组分：

1、精制特异性抗平颏海蛇毒素免疫球蛋白F(ab’)₂，其抗体效价为每毫升制品能中和至少20LD₅₀(小鼠)平颏海蛇毒素；蛋白浓度不大于170克/升；

2、0.15M氯化钠-渗透压保持剂；

3、0.2％间甲酚-防腐剂；

4、蒸馏水；

5、20mM磷酸钠-pH稳定剂。

本发明实施例所获得用碘乙酰胺灭活平颏海蛇毒素与重组马GMCSF免疫马匹来源的血浆制备的抗平颏海蛇毒血清和用甲醛灭活平颏海蛇毒素与福氏不完全佐剂免疫马匹来源的血浆制备的抗平颏海蛇毒血清均能有效地中和海蛇毒素，但是用碘乙酰胺灭活平颏海蛇毒素与重组马GMCSF免疫马匹，其免疫马匹获得的血浆抗体效价明显高于用甲醛灭活平颏海蛇毒素与福氏不完全佐剂免疫马匹来源的血浆，用其制备的抗平颏海蛇毒血清的效价比后者高1倍以上，达到了预料不到的技术效果。因此用碘乙酰胺灭活平颏海蛇毒素与重组马GMCSF免疫马匹更具实用价值，本发明实施例的制备方法过程简单，本制品特异性高，能保护人和动物在平颏海蛇咬伤时免受海蛇毒素的伤害，适合大规模生产。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (10)

1.一种抗平颏海蛇毒素抗体，其特征在于，所述的抗平颏海蛇毒素抗体是采用平颏海蛇毒素经灭活而成的平颏海蛇毒素抗原免疫马匹产生的IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的抗平颏海蛇毒素抗体，其特征在于，所述的平颏海蛇毒素依次经苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸和碘乙酰胺处理进行灭活。

3.根据权利要求1或2所述的抗平颏海蛇毒素抗体，其特征在于，所述平颏海蛇毒素经灭活而成的平颏海蛇毒素抗原与重组马GMCSF混合后免疫马匹，然后提取马抗平颏海蛇毒免疫球蛋白F(ab’)₂。

4.一种抗平颏海蛇毒素抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：抗原制备：称取平颏海蛇毒素，然后进行灭活制得所述的平颏海蛇毒素抗原；

步骤二：免疫马匹：将步骤一制得的所述的平颏海蛇毒素抗原免疫马匹，收集所述马匹的血浆；

步骤三：提取抗体：从步骤二制得的血浆中提取马抗平颏海蛇毒免疫球蛋白F(ab’)₂。

5.根据权利要求4所述的抗平颏海蛇毒素抗体的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述的平颏海蛇毒素依次经苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸和碘乙酰胺处理进行灭活。

6.根据权利要求4所述的抗平颏海蛇毒素抗体的制备方法，其特征在于，步骤二中所述免疫马匹的方法为：用所述的平颏海蛇毒素抗原与重组马GMCSF混匀后注射所述的马匹，收集免疫马匹的血浆。

7.根据权利要求4所述的抗平颏海蛇毒素抗体的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述提取马抗平颏海蛇毒免疫球蛋白F(ab’)₂的方法包括如下步骤：步骤A.将所述的血浆和胃蛋白酶消化溶液用硫酸铵沉淀、压滤后，将滤出液加硫酸铵二次沉淀，沉淀免疫球蛋白F(ab’)₂。

8.根据权利要求7所述的抗平颏海蛇毒素抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤A后,还包括步骤B：将所述的免疫球蛋白F(ab’)₂压滤后，将沉淀溶解于水，用超滤膜超滤除去硫酸铵，并加入磷酸钠缓冲液，经离子交换层析获得精制免疫球蛋白F(ab’)₂。

9.根据权利要求1-3任一项所述的抗平颏海蛇毒素抗体在制备抗海蛇血清制剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，所述抗平颏海蛇毒素抗体为马抗平颏海蛇毒免疫球蛋白F(ab’)₂，其抗体效价为每毫升制品能中和至少20LD₅₀平颏海蛇毒素，蛋白浓度不大于170克/升。