CN111748031B - 高纯度抗蛇毒血清及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高纯度抗蛇毒血清及其制备方法。本发明主要是通过溴化氰活化多糖类载体、毒蛇毒素偶联溴化氰活化多糖类载体及采用亲和层析的方法提纯抗蛇毒血清F(ab’)2得到高纯度抗蛇毒血清。采用本发明的制备方法获得高中和效价的抗蛇毒血清制品，具有很好的中和蛇毒素的功能的同时，大幅度降低了制品中无中和毒性作用的蛋白量，可以明显降低因异种蛋白引起的过敏反应发生率以及减轻过敏反应的严重程度。另外，本发明制备方法简单，条件温和，适于大规模推广应用。

Description

高纯度抗蛇毒血清及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高纯度抗蛇毒血清及其制备方法。

背景技术

毒蛇，英文Viper，是指能分泌特殊毒液的蛇类，是性格狡猾，出击狠毒的捕食者，敏锐的感官让猎物无处逃窜，诡异的攻击让死亡如影随形。中国的毒蛇有40余种，多分布于长江以南的广大省份，其已知的分布地区有安徽、重庆、江西、浙江、福建、湖南、湖北、广西、贵州、广东及台湾省。毒蛇中有10大剧毒的蛇，包括银环蛇、五步蛇、眼镜王蛇、舟山眼镜蛇、原矛头蝮、白唇竹叶青、白眉蝮、灰蓝扁尾海蛇、圆斑蝰蛇、金环蛇。

蛇毒是复杂的物质，主要是具有酶活性的蛋白质。蛇毒按其性质可分为：神经毒、血循毒、混合毒三大类。大多数毒蛇的蛇毒所含的毒性蛋白成分可引起局部和全身作用，这些作用可引起局部组织损害，血管损伤，溶血，弥漫性血管内凝血(DIC)样(去纤维蛋白)综合征和肺、心、肾及神经病变。以五步蛇为例，其奇毒无比，之所以称五步蛇意指人类只要曾被其所咬，脚下踏出五步内必然会毒发倒地。根据调查资料显示，由五步蛇咬伤所致的死亡事件，在我国是较为常见的。【赵尔宓、黄美华等主编《中国动物志爬行纲第三卷》科学出版社1998年版390页】。

世界卫生组织关于“毒蛇咬伤处理准则”(Guidelines for the management ofsnake-bites，World Health Organization 2010)中明确提出抗蛇毒血清是治疗蛇毒的唯一有效解毒剂，是治疗蛇毒引起全身中毒的基本药物。在临床实践中也发现，尽管用了传统医学的方法进行治疗，最终还需抗蛇毒血清才能挽回病人的生命。

抗蛇毒血清是治疗毒蛇咬伤病人的特效解药，现在市售的抗蛇毒血清每毫升能中和2毫克左右的蛇毒，每剂(10毫升)大约能中和20毫克毒素，治疗一个毒蛇咬伤病人大约需要3-8剂抗蛇毒血清。市售的抗蛇毒血清系采用灭活的毒蛇毒素免疫马匹，待马匹产生特异抗蛇毒抗体后，采取马匹的血浆，经胃蛋白酶消化去除F(ab’)2抗体的Fc片段、纯化获得F(ab’)2片段而成。尽管这种抗血清的抗体F(ab’)2含量在90％左右，但是其能中和毒素的有效F(ab’)2成分仅只占总F(ab’)2量的10％左右，其余F(ab’)2对毒素无中和作用。另外，马F(ab’)2以及其它马血清蛋白对于人体而言是异种蛋白，大剂量异种蛋白进入人体后可以引起过敏反应，尤其是血清病(III型过敏反应)，发病率高、病情严重、持续时间长。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的主要在于提供一种高纯度抗蛇毒血清，其具有远高于市售抗蛇毒血清中能中和毒素的有效F(ab’)2成分，可以降低抗蛇毒血清的剂量。

本发明的目的还在于提供一种所述高纯度抗蛇毒血清的制备方法，该方法能除去与中和抗体无关的其它蛋白，提高抗蛇毒血清的纯度，来减少血清病的发病率、减轻病症、缩短病程。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明的一些实施方案之中提供的一种高纯度抗蛇毒血清的制备方法包括：a)溴化氰活化多糖类载体，b)毒蛇毒素偶联溴化氰活化多糖类载体，c)采用亲和层析的方法提纯抗蛇毒血清F(ab’)2。

其中，所述毒蛇毒素选自新鲜采取的毒蛇毒素、用乙二胺四乙酸(EDTA)处理的毒蛇毒素、用苯甲基磺酰氟(PMSF)处理的毒蛇毒素或用乙二胺四乙酸(EDTA)及苯甲基磺酰氟(PMSF)处理的毒蛇毒素的一种或它们的混合物。

本发明的一些实施方案之中还提供了由上述方法制备的高纯度抗蛇毒血清。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

(1)本发明采用的制备方法的原理是除去抗毒蛇免疫球蛋白中无中和毒素作用的IgG，从而获得高中和效价的抗蛇毒血清制品，该抗蛇毒血清制品能具有很好的中和蛇毒素的功能的同时，大幅度降低了制品中无中和毒性作用的蛋白量。

(2)本发明得到的高纯度抗蛇毒血清制剂能高效保护人和动物在毒蛇免受相应蛇毒素的伤害，而且可以明显降低因异种蛋白引起的过敏反应发生率以及减轻过敏反应的严重程度。

(3)本发明制备方法简单，条件温和，适于大规模推广应用。

具体实施方式

上述内容相当粗略地概述了本发明的特点和技术优点，以便更好地理解随后本发明的详细描述。下文将描述本发明另外一些特点和优点，它们构成本发明权利要求书的主题。应当认识到，所公开的原理和具体实施方案可很容易地用作为改变或设计实施本发明相同目的的其它体系的基础。还应当认识到，这样的等效体系并不背离所附权利要求中所提出的本发明。结合结果，从以下的描述可更好地理解被认为是本发明特征的有关其组配和操作方法的新颖特征，以及另外一些目的和优点。

在本发明一较为具体的实施方案之中，一种高纯度抗蛇毒血清的制备方法包括：a)溴化氰活化多糖类载体，b)毒蛇毒素偶联溴化氰活化多糖类载体，c)采用亲和层析的方法提纯抗蛇毒血清F(ab’)2。

其中，所述毒蛇毒素选自新鲜采取的毒蛇毒素、用乙二胺四乙酸(EDTA)处理的毒蛇毒素、用苯甲基磺酰氟(PMSF)处理的毒蛇毒素或用乙二胺四乙酸(EDTA)及苯甲基磺酰氟(PMSF)处理的毒蛇毒素的一种或它们的混合物。

在本发明一较佳的实施方案之中，一种高纯度抗蛇毒血清的制备方法的具体步骤包括：

a)溴化氰活化多糖类载体：溴化氰溶于丙酮并配制成1M浓度，取所需量溴化氰溶液加入到多糖类载体同时快速搅拌，在3分钟之内滴加溶于60％丙酮溶液中浓度为0.5-3.0M有机碱中，滴加完毕后搅拌1-5分钟，搅拌结束后反应物立即倒入冰浴制冷的洗涤溶液中(丙酮∶0.1N盐酸为1∶1)，置冰箱保存；

b)毒蛇毒素偶联溴化氰活化多糖类载体：用pH7.0-8.010-200mM磷酸钠、150mM氯化钠缓冲液洗涤步骤a)中得到的溴化氰活化多糖类载体后，加入毒蛇毒素，在室温中震摇反应2-6小时，然后用pH7.0-8.0的10-200mM磷酸钠、150mM氯化钠及100mM甘氨酸缓冲液洗涤凝胶并留置；

c)采用亲和层析的方法提纯抗蛇毒血清F(ab’)2：首先将步骤b)中得到的毒蛇毒素偶联溴化氰活化多糖类载体装入层析柱，第二步是上样，样品为抗蛇毒血清，第三步是用洗涤缓冲液洗涤，第四步是用洗脱缓冲液洗脱蛋白。

其中，在一较为具体的实施方案之中，所述多糖类载体选自琼脂糖，如Sepharose，Bestarose凝胶，优选的，采用2％-6％琼脂糖浓度的凝胶，进一步优选的，选用4％琼脂糖浓度的凝胶如Sepharose CL4B FF或Bestarose 4B。

其中，在一较为具体的实施方案之中，所述有机碱为三乙胺(TEA)、二甲氨基吡啶(DAP)中的一种或它们的混合物。

优选的，所述有机碱浓度为1.0-2.0M；进一步优选的，有机碱浓度为1.5M。

其中，在一较为具体的实施方案之中，所述溴化氰(CNBr)的加入量为5mg CNBr/1g凝胶-40mg CNBr/1g凝胶；优选的，所述溴化氰(CNBr)的加入量为10mg CNBr/1g凝胶-30mgCNBr/1g凝胶；进一步优选的，所述溴化氰(CNBr)的加入量为15mg CNBr/1g凝胶-25mgCNBr/1g凝胶。

在步骤a)中载体活化时发生的是溴化氰和多糖类载体(琼脂糖)的羟基反应，使其活化为高反应性的氰酸酯和环状亚胺碳酸等。由于在载体活化的碱性条件下，只有少于2％的溴化氰能形成有用的活化基团，因此需要用特定有机碱如三乙胺(TEA)、二甲氨基吡啶(DAP)等形成的氰基转移复合物来取代溴化氰。

其中，在一较为具体的实施方案之中，所述毒蛇毒素选自银环蛇、五步蛇、眼镜王蛇、舟山眼镜蛇、原矛头蝮、白唇竹叶青、白眉蝮、灰蓝扁尾海蛇、圆斑蝰蛇、金环蛇的毒素中的一种或它们的混合物。

在一些较佳实施方案之中，所述的毒蛇毒素加EDTA处理，EDTA添加的浓度为0.1mM-50mM；优选的，EDTA添加浓度为0.5mM-20mM；进一步优选的，EDTA添加浓度为1 mM-2mM。

在一些较佳实施方案之中，所述的毒蛇毒素加PMSF处理，PMSF添加的浓度为0.01mM-10mM；优选的，PMSF添加的浓度为0.05mM-1mM；进一步优选的，PMSF添加的浓度为0.1mM-0.2mM。

在一些较佳实施方案之中，所述的毒蛇毒素加EDTA和PMSF处理，EDTA添加的浓度为0.1mM-50mM，PMSF添加的浓度为0.01mM-10mM；优选的，EDTA添加浓度为0.5mM-20mM，PMSF添加的浓度为0.05mM-1mM；进一步优选的，EDTA添加浓度为1mM-2mM，PMSF添加的浓度为0.1mM-0.2mM。

在一些较佳实施方案之中，所述毒蛇毒素中的蛋白浓度为5-50mg/ml；优选的，毒蛇毒素中的蛋白浓度为10-40mg/ml；进一步优选的，毒蛇毒素中的蛋白浓度为15-25mg/ml。

在步骤b)中用乙二胺四乙酸(EDTA)处理是用EDTA螯合掉毒蛇毒素中的金属离子，以防止他们与巯基发生反应。增加苯甲基磺酰氟(PMSF)处理是抑制毒蛇毒素中的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的活性。毒蛇毒素偶联时，活化的多糖与毒蛇毒素上的氨基共价交联发生偶联反应，得到亲和吸附剂。

其中，在一较为具体的实施方案之中，所述层析柱柱高为1cm-50cm；优选的，所述层析柱柱高为5cm-35cm；进一步优选的，所述层析柱柱高为15-25cm。

其中，在一较为具体的实施方案之中，所述上样样品可以是免疫了毒蛇毒抗原的马血浆或血清、兔血浆或血清、羊血浆或血清、羊驼血浆或血清、其它哺乳动物的血浆或血清、哺乳动物血浆或血清经加工后获得的IgG或F(ab’)2片段中的一种或它们的混合物。

在一些较佳实施方案之中，所述上样样品的pH控制在5-10之间；优选的，pH控制在6-9之间；进一步优选的，pH控制在7-8之间。

在一些较佳实施方案之中，所述上样的速度为1-100cm柱高/小时；优选的，所述上样的速度为5-50cm柱高/小时；进一步优选的，所述上样的速度为10-20cm柱高/小时。

其中，在一较为具体的实施方案之中，所述洗涤缓冲液可以是磷酸缓冲液、Tris缓冲液、碳酸钠缓冲液或其它缓冲液中的一种或它们的混合物。

在一些较佳实施方案之中，所述洗涤缓冲液的pH控制在4-9之间；优选的，所述洗涤缓冲液的pH控制在5-8之间；进一步优选的，所述洗涤缓冲液的pH控制在6-7之间。

其中，在一较为具体的实施方案之中，所述洗脱缓冲液可以是甘氨酸盐酸缓冲液、醋酸缓冲液中的一种或它们的混合物。

在一些较佳实施方案之中，所述洗脱缓冲液的pH控制在2.5-3.3之间；优选的，所述洗脱缓冲液的pH控制在2.6-3.1之间；进一步优选的，所述洗脱缓冲液的pH控制在2.7-3.0之间。

由于经过步骤a)和b)处理得到的毒蛇毒素偶联溴化氰活化多糖类载体能与毒蛇毒素对应的抗体发生特异性可逆反应，因此经免疫亲和层析分离后，抗蛇毒蛋白的纯度大幅度提高。

以下结合若干实施例进一步阐明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

又及，如下实施例之中采用的抗五步蛇毒血清(对比例)，其主要采用如下方法制备：一体积抗五步蛇毒血浆加二体积注射用水，2N盐酸调pH至3.2-3.4，升温至30℃，按每毫升溶液加3单位胃蛋白酶的比例加胃蛋白酶，在30℃温度下搅拌反应1小时，反应结束用2N氢氧化钠调pH至5.6-5.8，升温至56-58℃，保温30分钟。保温结束后降温至24-28℃，加辛酸至4％(v/v)，100rpm搅拌30分钟，随后用压滤的方法，除去沉淀，上清用millipore截留值为30kd膜包对PBS超滤并浓缩到蛋白浓度为50mg/ml左右，2-8℃储存备用。

实施例1

a)溴化氰活化琼脂糖凝胶制备

100克Sepharose 4B凝胶用60％丙酮洗涤后悬浮于1000毫升60％丙酮中，置-15℃。加14毫升1M溴化氰(溶于丙酮中)到Sepharose 4B悬液中，在冰浴下快速搅拌，同时滴加14毫升三乙胺(TEA)溶液(1.5M溶于60％丙酮)。3分钟后整个反应混合物迅速倒入冰浴预冷的1000毫升洗涤溶液中(丙酮∶0.1N盐酸为1∶1)。搅拌均匀后置2-8℃冰箱保存。

b)五步蛇毒素偶联溴化氰活化琼脂糖凝胶制备

溴化氰活化琼脂糖凝胶悬液倒入柱高25cm直径5cm的层析柱中，凝胶先后用冰纯水、pH7.4，50mM磷酸，0.15M氯化钠缓冲液洗涤后加入浓度为20mg/ml的五步蛇毒溶液100毫升(总蛋白量2000mg)，密封后置360度旋转摇床室温旋转反应4小时。反应完毕，用PBS洗涤凝胶至无蛋白流出后，加入含0.1M甘氨酸的PBS，继续在360度旋转摇床上旋转反应2小时以封闭未结合蛇毒的活性位点。封闭完毕后凝胶先后用PBS，含20％乙醇的PBS洗涤后2-8℃保存。

溴化氰活化琼脂糖凝胶偶联五步蛇毒素完毕后用PBS洗涤流出的液体共250毫升，用凯氏定氮法测得蛋白浓度为1.1mg/ml，洗涤流出液蛋白总量为275mg。

偶联到琼脂糖凝胶的蛇毒蛋白量＝2000mg-275mg＝1725mg，每毫升凝胶偶联17.25mg蛇毒。

c)五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶亲和层析纯化抗五步蛇毒血清

五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶倒入柱高25cm直径2.5cm的层析柱中，用pH7.4 PBS洗涤除去乙醇后，1升抗五步蛇毒血清上亲和层析柱，上样速度为10ml/min，上样完毕，接着先后用200毫升pH7.4 PBS和200毫升含0.5M NaCl pH7.4 PBS洗涤，洗涤速度为10ml/min；目的蛋白用pH3.0，0.1M醋酸洗脱，洗脱速度为2.5ml/min，收集洗脱的蛋白峰，用2N氢氧化钠调pH至4.5，2-8℃储存备用。

实施例2

a)溴化氰活化琼脂糖凝胶制备

100克Sepharose 4B凝胶用60％丙酮洗涤后悬浮于1000毫升60％丙酮中，置-15℃。加14毫升1M溴化氰(溶于丙酮中)到Sepharose 4B悬液中，在冰浴下快速搅拌，同时滴加14毫升三乙胺(TEA)溶液(1.5M溶于60％丙酮)。3分钟后整个反应混合物迅速倒入冰浴预冷的1000毫升洗涤溶液中(丙酮∶0.1N盐酸为1∶1)。搅拌均匀后置2-8℃冰箱保存。

b)苯甲基磺酰氟处理过的五步蛇毒素偶联溴化氰活化琼脂糖凝胶制备

溴化氰活化琼脂糖凝胶悬液倒入柱高25cm直径5cm的层析柱中，凝胶先后用冰纯水、pH7.4，50mM磷酸，0.15M氯化钠缓冲液洗涤后加入浓度为20mg/ml偶联苯甲基磺酰氟处理过的的五步蛇毒溶液(制备方法见下面描述)100毫升(总蛋白量2000mg)，密封后置360度旋转摇床室温旋转反应4小时。反应完毕，用PBS洗涤凝胶至无蛋白流出后，加入含0.1M甘氨酸的PBS，继续在360度旋转摇床上旋转反应2小时以封闭未结合蛇毒的活性位点。封闭完毕后凝胶先后用PBS，含20％乙醇的PBS洗涤后2-8℃保存。

溴化氰活化琼脂糖凝胶偶联五步蛇毒素完毕后用PBS洗涤流出的液体共250毫升，用凯氏定氮法测得蛋白浓度为1.2mg/ml，洗涤流出液蛋白总量为250mg。

偶联到琼脂糖凝胶的蛇毒蛋白量＝2000mg-250mg＝1750mg，每毫升凝胶偶联17mg蛇毒。

其中，苯甲基磺酰氟处理过的的五步蛇毒溶液的制备方法为：取10毫升五步蛇毒(凯氏定氮法测得蛋白浓度为203mg/ml)加91.5毫升pH7.4，50mM磷酸钠，100mM氯化钠，配成每毫升含20毫克毒素的蛋白溶液，加91.5微升100mM苯甲基磺酰氟(PMSF，临用前将PMSF溶于DMSO，配成100mM浓度)混匀后置冰浴备用。

c)苯甲基磺酰氟处理过的五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶亲和层析纯化抗五步蛇毒血清

偶联苯甲基磺酰氟处理过的五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶倒入柱高25cm直径2.5cm的层析柱中，用pH7.4 PBS洗涤除去乙醇后，1升抗五步蛇毒血清上亲和层析柱，上样速度为10ml/min，上样完毕，接着先后用200毫升pH7.4 PBS和200毫升含0.5M NaCl pH7.4 PBS洗涤，洗涤速度为10ml/min；目的蛋白用pH3.0，0.1M醋酸洗脱，洗脱速度为2.5ml/min，收集洗脱的蛋白峰，用2N氢氧化钠调pH至4.5，2-8℃储存备用。

实施例3

a)溴化氰活化琼脂糖凝胶制备

100克Sepharose 4B凝胶用60％丙酮洗涤后悬浮于1000毫升60％丙酮中，置-15℃。加14毫升1M溴化氰(溶于丙酮中)到Sepharose 4B悬液中，在冰浴下快速搅拌，同时滴加14毫升三乙胺(TEA)溶液(1.5M溶于60％丙酮)。3分钟后整个反应混合物迅速倒入冰浴预冷的1000毫升洗涤溶液中(丙酮∶0.1N盐酸为1∶1)。搅拌均匀后置2-8℃冰箱保存。

b)EDTA处理过的五步蛇毒素偶联溴化氰活化琼脂糖凝胶制备

溴化氰活化琼脂糖凝胶悬液倒入柱高25cm直径5cm的层析柱中，凝胶先后用冰纯水、pH7.4，50mM磷酸，0.15M氯化钠缓冲液洗涤后加入浓度为20mg/ml偶联EDTA处理过的的五步蛇毒溶液(制备方法见下面描述)100毫升(总蛋白量2000mg)，密封后置360度旋转摇床室温旋转反应4小时。反应完毕，用PBS洗涤凝胶至无蛋白流出后，加入含0.1M甘氨酸的PBS，继续在360度旋转摇床上旋转反应2小时以封闭未结合蛇毒的活性位点。封闭完毕后凝胶先后用PBS，含20％乙醇的PBS洗涤后2-8℃保存。

溴化氰活化琼脂糖凝胶偶联五步蛇毒素完毕后用PBS洗涤流出的液体共250毫升，用凯氏定氮法测得蛋白浓度为1.2mg/ml，洗涤流出液蛋白总量为280mg。

偶联到琼脂糖凝胶的蛇毒蛋白量＝2000mg-280mg＝1720mg，每毫升凝胶偶联17mg蛇毒。

其中，EDTA处理过的的五步蛇毒溶液的制备方法为：取10毫升五步蛇毒(凯氏定氮法测得蛋白浓度为203mg/m1)加91.5毫升pH7.4，50mM磷酸钠，100mM氯化钠，1mM EDTA缓冲液，配成每毫升含20毫克毒素的蛋白溶液置冰浴备用。

c)EDTA处理过的五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶亲和层析纯化抗五步蛇毒血清

偶联EDTA处理过的五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶倒入柱高25em直径2.5cm的层析柱中，用pH7.4 PBS洗涤除去乙醇后，1升抗五步蛇毒血清上亲和层析柱，上样速度为10ml/min，上样完毕，接着先后用200毫升pH7.4 PBS和200毫升含0.5M NaCl pH7.4 PBS洗涤，洗涤速度为10ml/min；目的蛋白用pH3.0，0.1M醋酸洗脱，洗脱速度为2.5ml/min，收集洗脱的蛋白峰，用2N氢氧化钠调pH至4.5，2-8℃储存备用。

实施例4

a)溴化氰活化琼脂糖凝胶制备

100克Sepharose 4B凝胶用60％丙酮洗涤后悬浮于1000毫升60％丙酮中，置-15℃。加14毫升1M溴化氰(溶于丙酮中)到Sepharose 4B悬液中，在冰浴下快速搅拌，同时滴加14毫升三乙胺(TEA)溶液(1.5M溶于60％丙酮)。3分钟后整个反应混合物迅速倒入冰浴预冷的1000毫升洗涤溶液中(丙酮∶0.1N盐酸为1∶1)。搅拌均匀后置2-8℃冰箱保存。

b)苯甲基磺酰氟和EDTA处理过的五步蛇毒素偶联溴化氰活化琼脂糖凝胶制备

溴化氰活化琼脂糖凝胶悬液倒入柱高25cm直径5cm的层析柱中，凝胶先后用冰纯水、pH7.4，50mM磷酸，0.15M氯化钠缓冲液洗涤后加入浓度为20mg/ml偶联苯甲基磺酰氟和EDTA处理过的的五步蛇毒溶液(制备方法见下面描述)100毫升(总蛋白量2000mg)，密封后置360度旋转摇床室温旋转反应4小时。反应完毕，用PBS洗涤凝胶至无蛋白流出后，加入含0.1M甘氨酸的PBS，继续在360度旋转摇床上旋转反应2小时以封闭未结合蛇毒的活性位点。封闭完毕后凝胶先后用PBS，含20％乙醇的PBS洗涤后2-8℃保存。

溴化氰活化琼脂糖凝胶偶联五步蛇毒素完毕后用PBS洗涤流出的液体共250毫升，用凯氏定氮法测得蛋白浓度为1.2mg/ml，洗涤流出液蛋白总量为300mg。

偶联到琼脂糖凝胶的蛇毒蛋白量＝2000mg-300mg＝1700mg，每毫升凝胶偶联17mg蛇毒。

其中，苯甲基磺酰氟和EDTA处理过的的五步蛇毒溶液的制备方法为：取10毫升五步蛇毒(凯氏定氮法测得蛋白浓度为203mg/m1)加91.5毫升pH7.4，50mM磷酸钠，100mM氯化钠，1mM EDTA缓冲液，配成每毫升含20毫克毒素的蛋白溶液，加91.5微升100mM苯甲基磺酰氟(PMSF，临用前将PMSF溶于DMSO，配成100mM浓度)混匀后置冰浴备用。

c)苯甲基磺酰氟和EDTA处理过的五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶亲和层析纯化抗五步蛇毒血清

偶联苯甲基磺酰氟和EDTA处理过的五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶倒入柱高25cm直径2.5em的层析柱中，用pH7.4 PBS洗涤除去乙醇后，1升抗五步蛇毒血清上亲和层析柱，上样速度为10ml/min，上样完毕，接着先后用200毫升pH7.4 PBS和200毫升含0.5M NaClpH7.4 PBS洗涤，洗涤速度为10ml/min；目的蛋白用pH3.0，0.1M醋酸洗脱，洗脱速度为2.5ml/min，收集洗脱的蛋白峰，用2N氢氧化钠调pH至4.5，2-8℃储存备用。

实施例5.五步蛇蛇毒LD50试验

选择体重18-20克小鼠进行蛇毒毒力试验，每6只分成一组，所需组数则根据试验需要而定。采用Bliss简化几率单位法测定蛇毒毒力，以半数致死量LD50表示。五步蛇蛇毒根据预初试验的结果把剂量调节至使用最高剂量时小鼠的死亡率接近100％，最小剂量时小鼠的死亡率接近0％，在最高剂量和最低剂量之间添加3-5个剂量组，各剂量组之间的比值衡定。注射蛇毒后观察48小时，记录小鼠的成活状况。本发明所用的五步蛇毒素的LD50为0.78mg毒素/kg小鼠体重。

实施例6.抗五步蛇毒抗体中和活性测定

抗五步蛇毒素中和效价测定按国际通用的中和试验法进行动物试验，其方法是把毒素和抗血清作用一定时间后，再给动物注射，借助动物体的反应情况来判定抗血清的效价。本发明所用的动物试验方法是以动物死亡为反应指征，以小白鼠注射抗蛇毒血清与蛇毒混合液后，动物的生存死亡情况，确定血清的效价。

为了确定血清的中和剂量范围，5LD50剂量的五步蛇蛇毒与不同浓度的血清混合成1毫升体积后在37℃水浴箱中放置1小时，取0.4毫升这种混合液体注射到小鼠的腹腔内，每个浓度注射一只小鼠，观测小鼠在48小时内存活状态。通过这种预初试验获得小鼠100％存活和100％死亡所用的血清的浓度范围。

根据血清ED50范围初步测定试验获得的小鼠100％存活和100％死亡所用的血清的浓度，将ED50所用的血清G浓度在这个范围进行分组，每组试验的小鼠为6只，体重在20克。免疫血清效价的测定采用固定蛇毒剂量、改变血清剂量的方法，即取0.5毫升浓度蛇毒溶液(蛇毒以LD50或mg为单位)加入0.5毫升含不同浓度的血清，混合后置37℃1小时，取0.4毫升注射小白鼠腹腔内作中和反应测定之，以含血清最低浓度量动物不死亡为中和终点，用改良寇氏法计算ED50计算1毫升血清中和蛇毒量。

本发明检测了抗五步蛇毒血清(对比例)、用五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶亲和层析纯化抗五步蛇毒血清(实施例1)以及EDTA和PMSF处理过的五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶亲和层析纯化抗五步蛇毒血清(实施例2)抗五步蛇毒素的中和活性，其结果见下表：

从上述结果可知，按现行生产工艺制备的抗五步蛇毒血清其活性为每100毫克蛋白能中和2.1毫克五步蛇毒，用五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶亲和层析纯化抗五步蛇毒血清的中和五步蛇毒素的能力明显提高，每100毫克蛋白可以中和16.0毫克毒素，其比活性是为抗五步蛇血清F(ab’)2的7.6倍；用苯甲基磺酰氟处理过的五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶亲和层析纯化抗五步蛇毒血清中和活性也明显提高，每100毫克蛋白可以中和18.9毫克五步蛇毒素；用EDTA处理过的五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶亲和层析纯化抗五步蛇毒血清中和活性也提高了，每100毫克蛋白可以中和17.8毫克五步蛇毒素；用苯甲基磺酰氟和EDTA处理过的五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶亲和层析纯化抗五步蛇毒血清中和活性最高，每100毫克蛋白可以中和20.3毫克五步蛇毒素，其比活性是用五步蛇毒素偶联琼脂糖凝胶亲和层析纯化抗五步蛇毒血清的1.27倍，是常规工艺生产抗五步蛇血清的9.7倍。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (25)

1.一种高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于包括：a）溴化氰活化多糖类载体，b) 五步蛇毒素偶联溴化氰活化多糖类载体，c) 采用亲和层析的方法提纯抗五步蛇毒血清F(ab’)2；

其中，所述a）溴化氰活化多糖类载体的步骤为：溴化氰溶于丙酮并配制成1M浓度，取所需量溴化氰溶液加入到多糖类载体同时快速搅拌，在3分钟之内滴加溶于60%丙酮溶液中浓度为0.5-3.0M 有机碱中，滴加完毕后搅拌1-5分钟，搅拌结束后反应物立即倒入冰浴制冷的洗涤溶液中，置冰箱保存，其中，所述洗涤溶液中丙酮：0.1M盐酸为1:1；

所述有机碱为三乙胺（TEA）、二甲氨基吡啶（DAP）中的一种或它们的混合物；

所述b)五步蛇毒素偶联溴化氰活化多糖类载体的步骤为：用pH7.0-8.0 10-200 mM磷酸钠、150 mM氯化钠缓冲液洗涤步骤a）中得到的溴化氰活化多糖类载体后，加入五步蛇毒素，在室温中震摇反应2-6小时，然后用pH7.0-8.0的10-200 mM磷酸钠、150 mM氯化钠及100mM甘氨酸缓冲液洗涤凝胶并留置；

所述五步蛇毒素用乙二胺四乙酸(EDTA) 及苯甲基磺酰氟(PMSF)处理的五步蛇毒素；

所述c)采用亲和层析的方法提纯抗五步蛇毒血清F(ab’)2的步骤为：首先将步骤b）中得到的五步蛇毒素偶联溴化氰活化多糖类载体装入层析柱，第二步是上样，样品为抗五步蛇毒血清，第三步是用洗涤缓冲液洗涤，第四步是用洗脱缓冲液洗脱蛋白。

2.根据权利要求1所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述多糖类载体为琼脂糖凝胶。

3.根据权利要求2所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述多糖类载体为2%-6%琼脂糖浓度的凝胶。

4.根据权利要求3所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述多糖类载体为4%琼脂糖浓度的凝胶。

5.根据权利要求4所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述多糖类载体为Sepharose CL4B FF或Bestarose 4B的一种或它们的混合物。

6.根据权利要求1所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述有机碱浓度为1.0-2.0M。

7.根据权利要求6所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述有机碱浓度为1.5M。

8.根据权利要求1所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述溴化氰(CNBr)的加入量为5mg CNBr/1g凝胶-40mg CNBr/1g凝胶。

9.根据权利要求8所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述溴化氰(CNBr)的加入量为10mg CNBr/1g凝胶-30mg CNBr/1g凝胶。

10.根据权利要求9所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述溴化氰(CNBr)的加入量为15mg CNBr/1g凝胶-25mg CNBr/1g凝胶。

11.根据权利要求1所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述五步蛇毒素中的蛋白浓度为5-50 mg/ml。

12.根据权利要求11所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：五步蛇毒素中的蛋白浓度为10-40 mg/ml。

13.根据权利要求12所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：五步蛇毒素中的蛋白浓度为15-25 mg/ml。

14.根据权利要求1所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述的五步蛇毒素加EDTA处理，EDTA添加的浓度为0.1 mM-50 mM；所述的五步蛇毒素加PMSF处理，PMSF添加的浓度为0.01 mM-10 mM。

15.根据权利要求14所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：EDTA添加浓度为0.5 mM-20 mM；PMSF添加的浓度为0.05 mM-1 mM。

16.根据权利要求15所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：EDTA添加浓度为1 mM-2 mM；PMSF添加的浓度为0.1 mM-0.2 mM。

17.根据权利要求1所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述层析柱柱高为1 cm-50 cm。

18.根据权利要求17所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述层析柱柱高为5 cm- 35 cm。

19.根据权利要求18所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述层析柱柱高为15-25 cm。

20.根据权利要求1所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：

所述上样样品是免疫了五步蛇毒抗原的马血浆或血清、兔血浆或血清、羊血浆或血清、羊驼血浆或血清、其它哺乳动物的血浆或血清、哺乳动物血浆或血清经加工后获得的IgG或F(ab’)2片段中的一种或它们的混合物；

所述上样样品的pH控制在5-10之间；所述上样的速度为1-100 cm柱高/小时。

21.根据权利要求20所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述上样样品的pH控制在6-9之间；所述上样的速度为5-50 cm柱高/小时。

22.根据权利要求21所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述上样样品的pH控制在7-8之间；所述上样的速度为10-20 cm柱高/小时。

23.根据权利要求1所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：

所述洗涤缓冲液为磷酸缓冲液、Tris缓冲液、碳酸钠缓冲液或其它缓冲液中的一种或它们的混合物；

所述洗涤缓冲液的pH控制在4-9之间；

所述洗脱缓冲液为甘氨酸盐酸缓冲液、醋酸缓冲液中的一种或它们的混合物；

所述洗脱缓冲液的pH控制在2.5-3.3之间。

24.根据权利要求23所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述洗涤缓冲液的pH控制在5-8之间；所述洗脱缓冲液的pH控制在2.6-3.1之间。

25.根据权利要求24所述的高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法，其特征在于：所述洗涤缓冲液的pH控制在6-7之间；所述洗脱缓冲液的pH控制在2. 7-3.0之间。