CN1958608B - 抗禽流感特异性IgY的制备方法及其制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗禽流感特异性IgY的制备方法及其制剂，为解决现有抗禽流感产品耐药性和不能预防等问题，本发明中，先以多种方法制备禽流感抗原，再用制得的禽流感抗原对产蛋禽类进行注射免疫，制得抗禽流感免疫蛋，然后取其蛋黄制得抗禽流感特异性IgY粗提物，再经纯化、过滤处理后，即制得抗禽流感特异性IgY成品，具体可以是抗禽流感病毒特异性IgY、抗禽流感病毒多肽HA2特异性IgY、抗禽流感病毒受体特异性IgY；还可制备抗继发感染致病菌特异性IgY。将抗禽流感特异性IgY与抗继发感染致病菌特异性IgY按适当比例混合，可制得抗禽流感特异性复合IgY。利用抗禽流感特异性IgY或抗禽流感特异性复合IgY，配以99.99-80.0％的辅料，可制成各种具有治疗、预防禽流感双重功效的制剂。

Description

抗禽流感特异性IgY的制备方法及其制剂
技术领域
本发明涉及一种抗体及其新型制剂，特别是涉及一种抗禽流感特异性IgY及其新型制剂，属医疗卫生技术领域。
背景技术
禽流感是禽流行性感冒的简称(其英文为avian influenza，简称AI)，它是由甲型流感病毒(influenza A virus)引起的禽类感染病，主要发生在鸡、火鸡、珍珠鸟以及其它禽类，特别是迁徙类水禽如野鸭、天鹅等。近年来，禽流感在世界各地的侵袭日趋频繁，不但给这些国家的家禽养殖业带来沉重的打击，同时也严重威胁着人类的健康和生命。世界卫生组织已将禽流感列为A类动物疫病。
鉴于禽流感的严重危害性，科学家们一直在探索如何去预防和治疗禽流感，特别着重在疫苗上的研究。但是，由于禽流感病毒和人流感病毒一样，其抗原性会不断漂移与变异，而禽流感疫苗的研制速度不可能跟上病毒的变异速度，因此实际效果很不理想。目前世界各国抢购的【特敏福】、【乐感清】等药品对甲型流感有一定的治疗作用，在尚无专门针对禽流感的特效药的情况下，人们不得已先将其当成治疗禽流感的权宜选择。但是，该类药物对中枢神经系统有明显副作用，并且易出现耐药毒珠的传播，最近在印度尼西亚已出现了对【特敏福】耐药的禽流感病毒株；因而限制了其在临床上的应用。而且，这些药品都不可能用于预防禽流感。
技术内容
针对现有技术的上述缺陷，本发明要解决现有抗禽流感产品对中枢神经系统有明显副作用、易产生耐药性、预防效果不明显等问题，以提供一种抗禽流感病毒特异性IgY及其制剂。
为解决上述技术问题，本发明提供一种制备抗禽流感特异性IgY的方法，其中包括以下步骤：
(S1)制备禽流感抗原；
(S2)利用所述禽流感抗原，对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的抗禽流感免疫蛋；
(S3)取所述抗禽流感免疫蛋的蛋黄，制备抗禽流感特异性IgY粗提物；
(S4)对所述抗禽流感特异性IgY粗提物进行纯化，制得抗禽流感特异性IgY纯品；
(S5)对所述抗禽流感特异性IgY纯品进行过滤处理，以滤除各种细菌和病毒，得到抗禽流感特异性IgY成品。
本发明中，所述抗禽流感特异性IgY可为抗禽流感病毒特异性IgY，此时，在所述步骤(S1)中，可按以下步骤制备制备禽流感病毒抗原：
选定有代表性、最常出现的禽流感病毒株，包括A型禽流感病毒H5N1株、H5N2株、H7N7及H9N2株；
将所述H5N1、H5N2、H7N7和H9N2病毒株采用常规鸡胚尿囊法，分别在鸡胚尿囊中培养，收取含有病毒的尿囊液，以鸡红细胞法粗提，再用蔗糖密度梯度超速离心法或凝胶柱层析法纯化，得到纯化的四种禽流感病毒；
分别取所述纯化的四种禽流感病毒，分别加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，裂解30分钟，分别制得H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四种禽流感病毒裂解液；
取所述四种禽流感病毒裂解液中的至少两种，制成混合裂解液，再按1-10∶1-10的比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆器中以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制得含多种禽流感病毒裂解成份的病毒复合抗原
为制备抗禽流感病毒特异性IgY，在本发明的所述步骤(S1)中，还可按以下步骤制备制备禽流感疫苗抗原：
取现在的禽流感疫苗，加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，裂解30分钟，制得禽流感病毒裂解液；
按1-10∶1-10比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得疫苗式的禽流感复合抗原。
本发明中，所述抗禽流感特异性IgY还可为抗禽流感病毒多肽HA2特异性IgY，此时，在所述步骤(S1)中，可按以下步骤制备制备禽流感病毒多肽HA2抗原：
用RT-PCR方法从甲型禽流感RNA克隆血凝素(HA2)基因，去掉信号肽和穿膜区的片段；
先插入pGEM-T载体，测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接；
转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115；
在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株；挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜；
稀释后继续培养，待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时；
于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中HA的表达量，选表达量最高的时间收获，离心去除细胞沉淀，上清中即含大量表达产物；
经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时，以及SepHAcry1 S-200和SepHAcry1 S-100柱层析后，即获得纯化的禽流感HA2抗原；
以1-10∶1-10的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得含禽流感HA2表达蛋白的抗原。
本发明中，所述抗禽流感特异性IgY还可为抗禽流感病毒受体特异性IgY，此时，在所述步骤(S1)中，可按以下步骤制备制备禽流感病毒受体抗原：取流感病毒受体，将其中的「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」表达蛋白按1∶1比例混合，制成浓度200微克/mL溶液，然后以1-10∶1-10比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得病毒受体抗原。其中，所述流感病毒受体是通过以下步骤制得的：用RT-PCR方法分别从流感病毒受体，即「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」RNA克隆多肽抗原基因去掉信号肽和穿膜区的片段；先插入pGEM-T载体，测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接；转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115；在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株，挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜；稀释后继续培养，待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时；于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中受体蛋白的表达量，选表达量最高的时间收获，离心去除细胞沉淀，上清中即含大量表达产物；经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时，以及SepHAcry1S-200和SepHAcry1 S-100柱层析后，即分别获得纯化的流感病毒受体---「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」的抗原成分。
本发明还提供一种制备抗继发感染致病菌特异性IgY的方法，其中包括以下步骤：
(S21)按以下步骤制备继发感染致病菌抗原：将A簇B型溶血性链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、MRSA金黄色葡萄球菌、以及肺结核菌按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10比例混合，制得致病细菌混合物，再将这种致病细菌混合物按1-10∶1-10比例加入福氏佐剂，用高速匀浆器以8,000-30,000rpm处理，成为油包水乳液，即制得继发感染致病菌复合抗原；
(S22)利用所述继发感染致病菌抗原，对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的抗继发感染致病菌免疫蛋；
(S23)取所述抗继发感染致病菌免疫蛋的蛋黄，制备抗继发感染致病菌特异性IgY粗提物；
(S24)对所述抗继发感染致病菌特异性IgY粗提物进行纯化，制得抗继发感染致病菌特异性IgY纯品；
(S25)对所述抗继发感染致病菌特异性IgY纯品进行过滤处理，以滤除各种细菌和病毒，得到抗继发感染致病菌特异性IgY成品。
本发明还提供一种制备抗禽流感特异性复合IgY的方法，其中，取权利要求1-6中任一项所述方法制得的抗禽流感特异性IgY，并取权利要求8所述方法制得的抗继发感染致病菌特异性IgY，按1-10∶1-10的比例混合均匀，即制成抗禽流感特异性复合IgY。
本发明还提供一种抗禽流感制剂，其中包括：
含量为0.01-20.0％的按权利要求1-6中任一项所述方法制得的抗禽流感特异性IgY，或者是含量为0.01-20.0％的按权利要求9所述方法制得的抗禽流感特异性复合IgY；
以及含量为99.99-80.0％的辅料；
所述制剂是雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂、喷喉剂、口喷剂、口含片、口服液、胶囊、或注射剂。
本发明利用抗禽流感免疫球蛋白(IgY)保护局部粘膜(鼻腔、上呼吸道)细胞不受禽流感病毒的侵袭，这是阻断其感染的关键，对禽流感病毒的吸附直接起到封闭作用，是抗禽流感特异性IgY具有预防作用的机理之一。抗禽流感特异性IgY还可对禽流感病人被侵袭局部新释放的病毒进行中和，使其丧失再行扩散传播的能力，因而达到既可治疗又可防止禽流感传播的双重目的。
具体实施方式
IgY(Immunoglobulin of yolk，即蛋黄免疫球蛋白)属IgG类免疫球蛋白，具有中和抗体的作用，它能与相应抗原发生特异性结合，从而改变或抑制该抗原(如病毒)的状态或活性，阻止该抗原(如病毒)吸附于易感细胞；另又，IgY与其相应的病毒结合后，可形成免疫复合物，从而易被巨噬细胞所吞噬。
如前所述，禽流感感毒的抗原会不断漂移和变异，除了严重影响相关疫苗的实际效果外，也给抗禽流感特异性IgY的研制带来一定的困难，不可沿用常规的方法。
研究揭示，跟人流感病毒一样，禽流感病毒表面有二种多肽抗原，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。这二种抗原结构易发生改变，即漂移或变异。其中HA是由一个重链(HA1)和一个轻链(HA2)通过双硫链连接而成，它的抗体能抑制血凝及中和病毒，是最主要的保护性抗体。HA2多肽的羧基末端位于病毒包膜内，HA2多肽的氨基末端(即为融合体)藏于HA蛋白三维结构内部，当禽流感病毒接触易感细胞时，HA的双硫链断裂，而裂解成HA1和HA2，此时HA2的氨基末端即融合体会暴露，引起病毒包膜与易感细胞膜融合，于是病毒核壳体遂进入细胞浆内，进行增殖。HA2在各型及亚型之间属于保守蛋白，结构比较稳定、变异小，并且又是介导禽流感病毒包膜与易感细胞膜融合的蛋白成分；因此，本发明要针对禽流感病毒的变异性，提供一种新型的抗HA2的IgY抗体，利用这种特异性抗HA2多肽的特殊抗体阻止禽流感病毒包膜与易感细胞膜的融合，使禽流感病毒不能进入细胞内，从而达到预防和治疗禽流感的目的。
另外，通过大量试验研究发现，禽流感病毒和人流感病毒一样，在感染人体细胞时需要该病毒与靶细胞上的特异性受体结合，其中流感病毒A和B的特异性受体是「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」。根据这一特点，本发明提供一种抗感冒病毒受体的特异性IgY，只要通过喷施或口服、注射等形式让这种特殊抗体和体内的细胞膜表面的流感病毒特异性受体结合，禽流感病毒失去了受体，就不能和靶细胞结合了，也就自然不会感染人体了。
1、由于IgY属多克隆抗体，可以和多种病原体发生作用，这也是其优势之一；因此，可以制作一种抗多种亚型抗禽流感特异性IgY，而不是象目前的疫苗那样只针对某一种亚型的禽流感病毒起作用，从而可达到更理想的实际预防和治疗效果。
2、本发明中，根据最近几年亚洲国家和欧美国家证实的人类感染禽流感亚型情况筛选分析，选定有代表性的最常出现的禽流感病毒如下：A型禽流感病毒H5N1株、H5N2株、H7N7及H9N2株。
3、培养有代表性的禽流感病毒并提纯：本发明中，将H5N1、H5N2、H7N7和H9N2病毒株采用常规鸡胚尿囊法，分别在鸡胚尿囊中培养，然后收取含有病毒的尿囊液，然后以鸡红细胞法粗提，再用蔗糖密度梯度超速离心法或凝胶柱层析法纯化病毒。
4、制作抗原成份：本发明中采用四种方法制作新型的抗原成份。
4.1、病毒裂解法制作禽流感病毒抗原成份
分别取上述提纯的各种禽流感病毒分别加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，裂解30分钟，即分别得到上述各种流感病毒裂解液。经SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检验分析，浓缩胶4％，分离胶7％，240V，电泳30分钟，然后经考玛氏亮蓝染色，观察蛋白带；检测确定含有血凝素重链(HA1)、血凝素轻链(HA2)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、P蛋白(P1、P2、P3)、基质蛋白(M1、M2)和非结构蛋白(NS、NS2)。与EnamiM等人主持的实验结果一致。
4.2、基因工程重组法制作禽流感病毒多肽HA2抗原成份
用RT-PCR方法从甲型禽流感病毒RNA克隆血凝素(HA2)基因，去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T载体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中HA的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时，以及SepHAcry1 S-200和SepHAcry1 S-100柱层析后，即获得纯化的禽流感病毒HA2抗原。
4.3、基因工程重组法制作流感病毒受体抗原成份
用RT-PCR方法分别从流感病毒受体，即「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」RNA克隆多肽抗原基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T载体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中受体蛋白的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸馏水透析24小时，以及SepHAcry1 S-200和SepHAcry1 S-100柱层析后，即分别获得纯化的流感病毒受体---「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」的抗原成分。
4.4、直接应用目前现成的禽流感疫苗裂解加工后作为禽流感病毒抗原成份：这种疫苗已包含有H5N1禽流感病毒抗原成份，采用上述病毒裂解法裂解后，作为复合抗原的材料。
5、制作抗原
5.1、病毒裂解成分复合抗原
将通过上述裂解方法制备的H5N1、H5N2、H7N7以及H9N2等4种禽流感病毒裂解液，按1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合均匀，一般取1∶1∶1∶1，制成混合裂解液；也可以从H5N1、H5N2、H7N7、H9N2中选其中二种或三种先等量混合成病毒裂解液，也可以只选其中一种作为单一病毒裂解液。再将这三种病毒裂解液中的一种按1-10∶1-10的比例(一般取1∶1)加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制得含多种禽流感病毒裂解成份的病毒复合抗原。
5.2、禽流感病毒多肽HA2抗原
将按4.2中的基因工程重组禽流感病毒多肽HA2所述方法而制得的纯化的禽流感病毒HA2表达蛋白(200微克/mL)以1-10∶1-10的比例(一般按1∶1比例)加入福氏佐剂，置入高速匀浆器，采用8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得含禽流感病毒HA2表达蛋白的抗原。
5.3、利用现成禽流感疫苗制作禽流感病毒抗原
从香港卫生署购置禽流感疫苗，该疫苗具有预防H5N1禽流感病毒的作用。将这种疫苗混合均匀，如前所述先采用病毒裂解法裂解，再将这种裂解液按1-10∶1-10比例，一般按1∶1的比例，加入福氏佐剂，置入高速匀浆器，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得疫苗式的禽流感复合抗原。
5.4、流感病毒受体抗原
5.4.1向美国病毒中心(ATCC)购买流毒病毒受体-「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」先以1∶1比例混合，配成200微克/mL浓度溶液；然后，按1-10∶1-10比例，一般按1∶1比例，加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得病毒受体抗原。
5.4.2将按上述4.3基因工程重组流感病毒受体表达蛋白所述方法而制得的纯化的流感病毒受体—「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」表达蛋白按1∶1比例混合，制成浓度200微克/mL溶液，然后以1-10∶1-10比例，一般以1∶1比例，加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，采用8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得病毒受体抗原。
6、制备继发感染致病菌复合抗原
将A簇B型溶血性链球菌(2×109/mL)、肺炎链球菌(2×109/mL)、流感嗜血杆菌(2×109/mL)和MRSA金黄色葡萄球菌(2×109/mL)以及肺结核菌(2×109/mL)按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10比例，一般按等量比例，混合制备成致病细菌混合物，再将这种致病细菌混合物按1-10∶1-10比例(一般按1∶1比例)加入等量的福氏佐剂，用高速匀浆器以8,000-30,000rpm处理，成为油包水乳液，即制得继发感染致病菌复合抗原。
7、制备抗禽流感免疫蛋
将采用上述四种方法制备的四种抗原，即禽流感病毒裂解成分复合抗原、禽流感病毒多肽HA2抗原、禽流感疫苗抗原、以及流感病毒受体抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫，每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫的母鸡所产免疫蛋，并进行编码标记。
8、制备抗继发感染细菌免疫蛋
将采用上述方法制备的流感继发感染细菌复合抗原，对产蛋母鸡进行免疫，每隔二周再强化注射一次，计免疫三次，第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋。对所检取的免疫蛋进行编码标记。
以上免疫方法和注射频率可根据母鸡免疫应答情况适当调整和变化，也可应用上述同样的免疫技术，采用上述不同抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同蛋禽类进行免疫，得到相应的各种不同的免疫蛋。
9、抗禽流感特异性IgY和抗继发感染细菌的特异性IgY粗提物的制备
首先根据被免疫的禽类不同以及免疫所用抗原不同，将免疫蛋分类并标记编码。用流动水洗净免疫蛋，酒精擦洗消毒，打蛋机打碎免疫蛋，蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；按蛋黄液体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.0。
将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12-24小时；将稀释液于10,000rpm离心20分钟；取分离所得的上清置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCl2液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃静置8-12小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌；Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥。
通过上述步骤，可制得三种抗禽流感特异性IgY粗提物，分别是抗禽流感病毒特异性IgY粗提物、抗禽流感病毒多肽HA2特异性IgY粗提物、抗禽流感病毒受体特异性IgY粗提物；另外，还可制得一种抗继发感染细菌的特异性IgY粗提物。最后，对所制备的对应不同抗原的特异性IgY粗提物进行编码标记。
10、抗禽流感特异性IgY和抗继发感染细菌的特异性IgY的纯化
分别将以上五种粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸盐缓冲液)液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，即分别制得三种抗禽流感特异性IgY纯品和一种抗继发感染细菌的特异性IgY纯品。
11、采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌和病毒，确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌。其中，第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。
最后可制得三种抗禽流感特异性IgY，分别是抗禽流感病毒特异性IgY、抗禽流感病毒多肽HA2特异性IgY、抗禽流感病毒受体特异性IgY；还可制得一种抗继发感染细菌的特异性IgY。
利用上述抗禽流感特异性IgY、抗继发感染细菌的特异性IgY，可以再加入其它化学药品成份或中药成份，制成各种复方药品。
将上述各种不同的抗禽流感特异性IgY、或者抗继发感染细菌的特异性IgY、或者这些IgY与化学药品、中药等配成的复方成份，配以蒸馏水调配成浓度0.01-20.0％的溶剂；可制成各种新型雾化剂、口喷剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂、喷喉剂、注射剂等剂型。由于IgY能抵抗胃蛋白酶以及肠道胰蛋白和胰凝乳蛋白酶的破坏；因此，可制成口含片、口服液或胶囊等用于口服，同样能达到预防和治疗的效果。
也可将三种不同的抗禽流感特异性IgY其中一种和抗继发感染细菌的特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，制成一种抗禽流感特异性复合IgY，配以蒸馏水调配成浓度0.01-20.0％的复合溶剂，制成一种新型雾化剂。
将0.01-20.0％的抗禽流感特异性IgY，或者抗禽流感特异性IgY和抗继发感染细菌的特异性IgY混合而成的抗禽流感特异性复合IgY，以及这一系列IgY加上化学药、中药组成的复方成份，配以99.99-80.0％的辅料，可制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂、喷喉剂、口喷剂、口含片、口服液、胶囊以及注射剂等剂型，用于预防和治疗禽流感以及继发感染。
其中的抗流感病毒受体特异性IgY除了对各种型的禽流感病毒有特异性抑制作用外，经检测其对人流感病毒也具很高的抗体结合效价；这是因为禽流感病毒和人流感病毒两者的特异性受体是一样的。因此，可采用这种IgY或者再与抗继发感染细菌的特异性IgY混合制成抗人流感特异性复合IgY，或者再加上化学药、中药组成复方成份；将其配以99.99-80.0％的辅料，制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂、喷喉剂、口喷剂、口含片以及注射剂等剂型，用于预防和治疗人流感以及继发感染。
本发明利用抗禽流感病毒免疫球蛋白(IgY)保护局部粘膜(鼻腔、上呼吸道)细胞不受禽流感病毒的侵袭，这是阻断其感染的关键，对禽流感病毒的吸附直接起到封闭作用，是抗禽流感特异性IgY具有预防作用的机理之一。抗禽流感特异性IgY还可对禽流感病人被侵袭局部新释放的病毒进行中和，使其丧失再行扩散传播的能力，因而达到既可治疗又可防止禽流感传播的双重目的。这是其创新独到之处。
由于HA2是介导流感病毒膜与细胞内小体膜融合的蛋白成份，本发明制成一种抗禽流感病毒多肽HA2的IgY，这种抗HA2的抗体可以阻止禽流感病毒包膜与细胞内小体膜融合，乃至影响禽流感病毒与细胞膜融合，致使病毒核壳体不能进入细胞内，从而，对禽流感病毒产生有效的防止作用。这样，即使这种禽流感病毒的可变区(重链-HA1)发生了变异，如前所述，其保守区(轻链-HA2)是不变的，采用本发明的方法制备的抗禽流感病毒各个多肽抗原(包括保守区)的特异性IgY或者抗HA2表达蛋白的特异性IgY仍然会对其产生有效的阻遏作用。
另外，本发明所制得的抗禽流感病毒受体特异性IgY可以和人体内细胞膜表面固有的特异性流感病毒受体结合，这样，即使禽流感病毒入侵人体；但是，没有了受体，这些病毒就无法复制，势必死亡。由于不同亚型的禽流感病毒和人流感病毒其特异性受体是一样的；因此，这种特殊的抗流感病毒受体的IgY对各种不同亚型的或者变异了的禽流感病毒以及人流感病毒之抑制效果都是一样的，这也就以另一种巧妙的新方法解决了禽流感病毒以及人流感病毒型别很多又容易变异而难于对付的难题。
本发明的这一系列抗禽流感特异性IgY的这些特点，正好克服了禽流感疫苗对变异的禽流感病毒无效以及目前广泛使用的抗病毒药物对禽流感病毒实际杀灭作用不大、而对人体毒副作用又很大之不足。特别是，这种IgY具有不会诱发病毒产生突变的优点，也不会使禽流感病毒产生耐药性；因此，可以克服现有的【特敏福】、【乐感清】已出现耐药性的致命缺点。
本发明设计了四种不同的方法制作抗原，可根据不同情况选择其中一种，免疫产蛋禽类(鸡、鸭、鹅、鸵鸟等)，使其出现更强的免疫应答，产生种类更多、结合力更强而量又大的复合抗体。所制得的多种抗各种亚型禽流感病毒的特异性IgY，对各种常见的禽流感病毒，特别是变异了的禽流感病毒之预防作用明显超过一般禽流感疫苗。这是因为不同亚型的禽流感病毒，均有相同的HA2保守区，而本发明的抗HA2特异性IgY可专一抗HA2保守区；另外，无论哪种型的禽流感病毒都必须依靠特异性受体才能和靶细胞结合，而本发明的特殊的抗流感病毒IgY会有效抑制这种特异性受体；因此，这两种与众不同的特殊IgY对不同的亚型以及变异的禽流感病毒都会有抑灭作用。同时，人体受禽流感病毒感染后，致病菌会乘虚而入，势必引起继发感染；本发明制备的抗多种致病菌特异性复合IgY对引致继发感染的常见致病菌也有很好的免疫调理作用，特别是能有效杀灭普通杀菌药无能为力的耐药菌MRSA和肺结核菌，这是禽流感疫苗和一般抗病毒药物所做不到的。因此，这种特异性的复合IgY不仅可以从根本上预防和治疗不同国家出现的多种亚型的禽流病感病毒引致的禽流感；而且，即使当某一种禽流感病毒再又发生变异了，由这种变异的禽流感病毒所引起的新禽流感，本发明所制得的抗禽流感特异性IgY也能有效对付它。成为一种比一般禽流感疫苗更方便、更安全又有效得多的大面积预防禽流感的有力武器。
实验例
实验例1：用病毒裂解法制备的抗禽流感病毒特异性IgY
以学术合作研究形式由新加坡国立大学微生物实验室提供H5N1、H5N2、H7N7、H9N2禽流感病毒株，分别以常规鸡胚尿囊法培养，然后纯化分别得到H5N1病毒蛋白20mg、H5N2型病毒蛋白10mg、H7N7病毒蛋白10mg、H9N2病毒蛋白10mg。
1、分别取上述提纯的四种禽流感病毒分别加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，裂解30分钟，即分别得到上述各种流感病毒裂解液。经SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳)检验分析，浓缩胶4％，分离胶7％，240V，电泳30分钟。考玛氏亮蓝染色，观察蛋白带。检测确定含有血凝素重链(HA1)、血凝素轻链(HA2)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、P蛋白(P1、P2、P3)、基质蛋白(M1、M2)和非结构蛋白(NS、NS2)。与EnamiM等主持实验结果一致。由此可制得以上四种病毒的裂解液。
2、将以上四种病毒裂解液按1∶0.5∶0.5∶0.5的比例混合均匀，再按1∶1的比例加入福氏佐剂高速匀化制成禽流感病毒裂解成份复合抗原；最后，用这种复合抗原免疫产蛋母鸡，每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫的母鸡所产免疫蛋，并进行编码标记。并按以下方法提取：
2.1、首先用流动水洗净免疫蛋，酒精擦洗消毒，打蛋机打碎免疫蛋，蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；按蛋黄液体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.0。
2.2、将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-60C，静置12-24小时；将稀释液于10,000rpm离心20分钟；取分离所得的上清置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCl2液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，40C静置8-12小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌；Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥。即制备得到抗禽流感病毒特异性IgY粗提物干粉。
3、将粗提物干粉溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸盐缓冲液)液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析。即制得抗禽流感病毒特异性IgY纯品。
4、为了确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌；无论所制备的IgY粗制品或者IgY纯品，都必须经以下过滤除菌、除病毒工序才能出厂：
4.1、采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌和病毒，
4.2、第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。
实验例2：用基因工程重组HA2表达蛋白制备得到抗HA2特异性鸡IgY的活性检测
1、用RT-PCR方法从甲型禽流感病毒RNA克隆血凝素(HA2)基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T载体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。
2、待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中HA的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时，以及SepHAcry1 S-200和SepHAcry1 S-100柱层析后，即获得纯化的禽流感病毒HA2抗原。
3、将所制得的纯化的禽流感病毒HA2表达蛋白(200微克/mL)以1-10∶1-10的比例(一般按1∶1比例)加入福氏佐剂，置入高速匀浆器，采用8,000--30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得含禽流感病毒HA2表达蛋白的抗原。
4、将所制得的禽流感病毒HA2表达蛋白1.0mg按1∶1比例加入福氏佐剂，并置入高速匀浆器高速匀化，制备含HA2表达蛋白的抗原。
5、然后以这种禽流感病毒HA2表达蛋白的抗原采用试验例1同样的方法免疫产蛋母鸡并用同样方法制备得到抗禽流感病毒多肽HA2特异性IgY。
实验例3：用「禽流感疫苗复合抗原」制备得到抗禽流感病毒特异性鸭IgY
1、向香港卫生署购买禽流感疫苗50支，将这些禽流感疫苗混和后采用前述病毒裂解法制得裂解液，然后将这种裂解液按1∶1比例加入福氏佐剂，并置入高速匀浆器高速匀化，制备含H5N1、H5N2和H7N7、H9N2四种流感病毒抗原成份的疫苗式复合抗原。
2、采用前面所述的方法用这种「禽流感疫苗复合抗原」免疫产蛋母鸭，制备得到抗禽流感病毒特异性鸭IgY。再分别以H5N1、H5N2和H7N7、H9N2禽流感病毒作为检测抗原，用ELISA法检测这种抗禽流感病毒特异性鸭IgY对这四种不同抗原的抗体结合效价。
结果如下面所示：
  IgY   抗原   抗体结合效价
  抗禽流感病毒鸭IgY   H5N1禽流感病毒   1∶2,048
实验例4：用基因工程重组流感病毒受体表达蛋白矩抗原制备抗禽流感病毒受休特异性IgY
1、可向美国病毒中心(ATCC)购买现成的流感病毒受体—「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」，按1∶1比例混合，混合制成200微克/mL浓度溶液，然后以1-10∶1-10比例，一般以1∶1比例，加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，采用8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得病毒受体抗原。
2、采用基因工程重组流感病毒受体表达蛋白，具体操作方法如下。
2.1、用RT-PCR方法分别从流感病毒受体—「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」RNA克隆多肽抗原基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T载体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中受体蛋白的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时，以及SepHAcry1 S-200和SepHAcry1 S-100柱层析后，即分别获得纯化的流感病毒受体—「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」抗原成分。
2.2、将制得的纯化的两种流感病毒受体—「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」表达蛋白先按1∶1比例混合制成200微克/mL浓度溶液，然后以1-10∶1-10比例，一般以1∶1比例，加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，采用8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得病毒受体抗原。
2.3、然后以这种流感病毒受体表达蛋白的抗原采用试验例1同样的方法免疫产蛋母鸡并用同样方法制备得到抗流感病毒受体特异性IgY。
实验例5：抗流感继发感染特异性鸡IgY
1、由新加坡国立大学微生物试验室提供用常规方法培养好的A簇B型溶血性链球菌，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌，MRSA金黄色葡萄球菌、肺结核菌。将以上五种致病菌按1∶1∶1∶0.5∶0.5的比例混合，制成10mL菌液再加入10mL福氏佐剂然后置入高速匀浆器高速匀化，制得继发感染细菌复合抗原20mL。
2、采用本文前叙同样方法以这种含全菌的复合抗原免疫母鸡，并用同样方法制备抗流感继发感染特异性IgY。然后将其与上述实验例1制备的抗禽流感病毒特异性IgY按1∶1的比例混合均匀，制得抗禽流感和继发感染特异性复合IgY。
3、最后，分别以H5N1、H5N2和H7N7、H9N2禽流感病毒以及A簇B型溶血性链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、MRSA金黄色葡萄球菌、肺结核菌作为检测抗原，用ELISA法检测这种复合IgY对这些抗原的抗体效价。
结果如下：
Figure G051B6846220051103D000151
从以上检测结果显示，按本文所述的方法所制备的抗禽流感和继发感染特异性复合IgY，对四种个亚型禽流感病毒，以及常见的几种继发感染致病菌都有较高的抗体结合效价。
实验例6：抗禽流感特异性IgY和抗继发感染细菌的特异性IgY的含量检测
应用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯凝胶)电泳测定法，分别对按以上工艺所制取的不同的抗禽流感特异性IgY和抗继发感染细菌的特异性IgY粗提物进行检测，结果含IgY 45-52％。IgY粗提物经二次过柱后，得到纯IgY。经SDS-PAGE分析，纯度达到PAGE纯，如下表所示：
  IgY纯品   纯IgY含量
  抗禽流感特异性IgY   99.99％
  抗继发感染细菌的特异性IgY   99.99％
实验例7：各种不同抗禽流感特异性IgY和抗继发感染细菌的特异性复合IgY的活性检测
1、采用本发明人发明的特殊免疫启动方法和改进的工艺技术所制得的抗禽流感特异性IgY和抗继发感染细菌的特异性IgY，采用「ELISA法」(酶联免疫吸附试验)进行活性检测。
2、检测结果显示，所制得的各种不同抗禽流感特异性IgY，其中以裂解病毒抗原免疫所制的I型「抗禽流感病毒特异性IgY」对前述4种有代表性的H5N1、H5N2和H7N7以及H9N2禽流感病毒的抗体结合效价都达到了1∶2048以上。而以HA2表达蛋白抗原免疫所制得的II型「抗HA2特异性IgY」对H5N1、H5N2、H7N和H9N2禽流感病毒的抗体结合效价也达到1∶1,024以上；而以禽流感疫苗抗原免疫所制得的III型「抗禽流感病毒特异性IgY」对H5N1、H5N2、H7N和H9N2等四种禽流感病毒的抗体结合效价也达到1∶1024以上；而以流感病毒受体抗原免疫所制得的IV型抗流感病毒受体特异性IgY对H5N1、H5N2、H7N和H9N2等四种禽流感病毒的抗体结合效价也达到1∶1024以上。另外，如前所述，鉴于禽流感病毒和人流感病毒两者的特异性受体是一样的；因此，以流感病毒受体抗原免疫所制得的抗流感病毒受体特异性IgY对人流感病毒的抗体结合效价也很高，试验结果同样达到1∶1024。其次，抗继发感染细菌的特异性IgY对有代表性的肺炎双球菌、A簇B型溶血型链球菌、MRSA金黄色葡萄球菌、肺结核菌、流感嗜血杆菌的抗体效价则稍低一些，但都在1∶512以上。详见下表所示：
四种抗禽流感特异件IgY效价检测结果
Figure G051B6846220051103D000161
抗继发感染细菌的特异性IgY效价检测结果
(注：检测用样本浓度为1mg/mL)
实施例
实施例1：用病毒裂解法制备抗流感病毒特异性鸡IgY
1、首先选定以下4种禽流感病毒：H5N1株、H5N2株、H7N7株、H9N2株。
2、将以上H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四种流感病毒株分别采用下文所述常规鸡胚尿囊法，分别在鸡胚尿囊中培养；收取含有病毒的尿囊液，然后以下文所述鸡红细胞法粗提；再用下文所述蔗糖密度梯度超速离心法纯化病毒，分别得到提纯的H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四种流感病毒悬浮液。
3、鸡胚尿囊法按以下方法操作：用70％酒精消毒鸡胚卵气室上部的卵壳，并在其上打1.0cm长的洞；加一滴无菌液体石蜡在胚体上方的壳膜上；用1mL的结核菌素注射器，将0.1-0.2mL的病毒标本注入尿囊腔，继而用无菌胶布封住开口；置33-35℃孵箱培养2-4天；置于4℃6-18h；用75％酒精消毒气室部卵壳，扩大蛋壳上的开口，用装上纯型的18号针头的注射器抽取含有病毒的尿囊液置50mL的离心管中。
4、鸡红细胞粗提方法按以下方法操作：首先将上述收取的尿囊液于4,000rpm离心30分钟以去除杂物碎片，去沉淀；每升尿囊液加入甲醛化的红细胞到最终度为2.5-3.5％，混合均匀，置于4℃约10小时；2,000rpm离心10分钟，去上清；0℃生理盐水洗红细胞2次(在冰浴中进行)，每次半分钟；2,000rpm在4℃离心5分钟，去上清；在沉淀的红细胞中加入原尿囊液体积五分之一的pH7.6、0.01M磷酸盐缓冲盐水，搅匀，置于37℃水浴3小时，2,000rpm离心10分钟，得上液，即为粗提的流感病毒悬浮液。
5、用蔗糖密度梯度超速离心法纯化流感病毒，具体方法如下：取上述粗提的流感病毒悬浮液1.0mL，轻轻加到40％和60％不连续密度梯度的蔗糖液上面，经100,000g离心2小时，取蔗糖层中间区带液，加入pH7.2、0.01M磷酸盐缓冲盐水1.0mL，混匀，透析除糖，即得纯流感病毒悬浮液。
6、分别取提纯的H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四种流感病毒液各1.0mL(浓度4.0万HAU，相当于病毒蛋白200微克)，分别加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，于37℃裂解30分钟，即分别得到上述4种流感病毒裂解液。
7、将这4种流感病毒裂解液按1.0∶0.5∶0.5∶1.0的比例混合均匀，制成混合裂解液，再按1∶1的比例在混合裂解液中加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制成含多种流感病毒裂解成份的病毒复合抗原，计150mL。
8、以这种复合抗原免疫健康的产蛋母鸡50只，每只肌内注射1mL，每隔二周注射一次，共计三次。
9、第一次注射后第20天开始检取免疫蛋，至第7个月将所检得的7，500只免疫蛋用流动水冲净，75％乙醇消毒，晾干破碎蛋壳，以蛋黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀，用1.0N HCI调pH至5.5-6.0，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，于10,000rpm离心20分钟，取上清进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCI2液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃过夜10小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌，Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥；即制得抗禽流感病毒特异性IgY粗提物750克。
10、将以上IgY粗提物先后过离子交换树脂柱和凝胶层析柱层析，即制得抗禽流感病毒特异性IgY纯品150克。
实施例2：用病毒裂解法制备抗流感病毒特异性鹅IgY
1、首先选定以下4种流行性感冒病毒：H5N1株、H5N2株、H7N7株、H9N2株。
2、将H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四种流感病毒株分别采用常规鸡胚尿囊法，分别在鸡胚尿囊中培养；收取含有病毒的尿囊液，然后以鸡红细胞法粗提；再用凝胶柱层析法纯化病毒，分别得到提纯的H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四种流感病毒悬浮液，具体操作如下。
3、分别用鸡胚尿囊法培养以上4种流感病毒，步骤如下详述：70％酒精消毒鸡胚卵气室上部的卵壳，并在其上打1.0cm长的洞；加一滴无菌液体石蜡在胚体上方的壳膜上；用1mL的结核菌素注射器，将0.1-0.2mL的病毒标本注入尿囊腔，继而用无菌胶布封住开口；置33-35℃孵箱培养2-4天；置于4℃6-18h；用75％酒精消毒气室部卵壳，扩大蛋壳上的开口，用装上纯型的18号针头的注射器抽取含有病毒的尿囊液置50mL的离心管中。
4、分别用鸡红细胞粗提以上4种流感病毒，步骤如下：首先将收取的尿囊液于4,000rpm离心30分钟以去除杂物碎片，去沉淀；每升尿囊液加入甲醛化的红细胞到最终度为2.5-3.5％，混合均匀，置于4℃约10小时；2,000rpm离心10分钟，去上清；0℃生理盐水洗红细胞2次(在冰浴中进行)，每次半分钟；2,000rpm在4℃离心5分钟，去上清；在沉淀的红细胞中加入原尿囊液体积五分之一的pH7.6、0.01M磷酸盐缓冲盐水，搅匀，置于37℃水浴3小时，2,000rpm离心10分钟，得上液，即为粗提的流感病毒悬浮液。
5、别用柱层析法纯化以上4种流感病毒，步骤如下：取上述混悬液3-5mL加样于SepHAdex G200凝胶层析柱(3×50cm)；用0.05M、pH7.4、PBS液洗脱；流速15-20mL/小时；每管收集5.0mL；于280nm测定洗脱曲线，并用血凝滴度测定流感病毒洗脱峰；收集病毒洗脱液，即为提纯的流感病毒液。
6、分别取提纯的H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四种流感病毒液各10mL(浓度4.0万HAU，相当于病毒蛋白2,000微克)，分别加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，于37℃裂解30分钟，即分别得到上述4种流感病毒裂解液。
7、将这4种流感病毒裂解液按1.0∶0.5∶0.5∶1.0的比例混合均匀，制成混合裂解液，再按1∶1的比例在混合裂解液中加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制成含多种流感病毒裂解成份的病毒复合抗原，计2,250mL。
8、选具高免疫应答能力的良种100只母鹅，采用上述含多种流感病毒裂解成份的病毒复合抗原，计1,500mL分别对母鹅进行免疫，每次注射5mL抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次，于第一次注射后第七个月，把这些鹅所产的蛋标记后按常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附试验)检测所制得的IgY的效价，选出其中能制得IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鹅，再用这批鹅所产的蛋孵出优良鹅种，待其长大至2-3个月，选出其中50只作为优选的高免疫应答能力的特种母鹅。
9、采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种母鹅进行免疫，每只母鹅每次注射量达5mL抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；每一次免疫20天后，检取母鹅所产免疫蛋至第7个月终止，共计检得免疫鹅蛋7,500只。
10、将所制备的免疫蛋分别用流动水冲净，75％乙醇消毒、晾干，破碎蛋壳以卵黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀用1.0N HCI液调pH至5.5-6.0，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，于10,000rpm离心20分钟，取上清进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCI2液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃过夜10小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌，UltiporVFTM DV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥，即制得抗流感病毒特异性鹅IgY粗提物2,200克。
11、将以上IgY粗提物，先后过离子交换树脂柱和凝胶层析柱层析，即制得抗流感病毒特异性鹅IgY纯品400克。
实施例3：用基因工程法制备抗禽流感病毒多肽HA2特异性鸵鸟IgY
1、用RT-PCR方法从甲型流感病毒RNA克隆血凝素(HA2)基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T载体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中HA的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸馏水透析24小时，以及SepHAcry1 S-200和SepHAcry1 S-100柱层析后，即获得纯化的流感病毒HA2抗原2,100mL。
2、选具高免疫应答能力的良种母鸵鸟50只，用上述纯化的流感病毒HA2抗原1,500mL，对母鸵鸟分别免疫，每次注射10mL抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次，于第一次注射后第七个月，把这些鸵鸟所产的蛋标记后按常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附试验)检测所制得的IgY的效价，选出其中能制得IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鸵鸟，再用这批鸵鸟所产的蛋孵出优良鸵鸟种，待其长大至2-3个月，选择其中10只作为优选的高免疫应答能力的特种产蛋鸵鸟。
3、采用以上述方法制作的HA2表达蛋白抗原300mL，应用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种产蛋鸵鸟进行免疫，每只鸵鸟每次注射量达8-10mL抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫20天后，检取鸵鸟所产免疫蛋共100只。
4、将所检取的100只免疫的鸵鸟蛋分别用流动水冲净，75％乙醇消毒、晾干，破碎蛋壳以卵黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀用1.0N HCI液调节pH至5.5-6.0，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，于10,000rpm离心20分钟，取上清进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCI2液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃过夜；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌，Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥，即制得抗HA2特异性鸵鸟IgY粗提物1,000克。
5、将以上IgY粗提物分别先后过离子交换树脂柱和凝胶柱层析，即制得抗HA2特异性鸵鸟IgY纯品200克。
实施例4：用禽流感疫苗作抗原制备抗禽流感病毒特异性火鸡IgY
1、取禽流感疫苗50支(每支300μg/1.5mL)将其混和均匀，加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，于37℃裂解30分钟，即得到流感病毒裂解液。
2、再将这种裂解液按1∶1的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制成疫苗式复合抗原，计150mL。再以这种复合抗原免疫健康的产蛋火鸡50只，每只肌内注射1mL，每隔二周注射一次，共计三次。
3、第一次注射后第20天开始检取免疫蛋，至第50天，共检取1,200只免疫蛋；将其用流动水冲净，75％乙醇消毒，晾干破碎蛋壳，以蛋黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀，用1.0N HCI调pH至5.5-6.0，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，于10,000rpm离心20分钟，取上清进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCI2液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃过夜；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌，Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥；即制得抗禽流感病毒特异性IgY粗提物120克。
4、将以上IgY粗提物先后过离子交换树脂柱和凝胶层析柱层析，即制得一种以禽流感疫苗作抗原的抗禽流感病毒特异性IgY纯品25克。
实施例5：制备抗继发感染细菌的特异性IgY
1、制备继发感染致病菌复合抗原：将A簇B型溶血性链球菌(2×109/mL)、肺炎链球菌(2×109/mL)、流感嗜血杆菌(2×109/mL)和金黄色葡萄球菌(2×109/mL)等量比例混合制备成致病细菌混合物，再将致病细菌混合物按1∶1比例加入等量的福氏佐剂，用高速匀浆器以8,000rpm处理，即得油包水的混合菌体抗原即继发感染致病细菌复合抗原。
2、制备抗继发感染细菌免疫蛋：应用所制备的流感继发感染细菌复合抗原，免疫产蛋母鸡5只；每只肌肉注射1mL。每隔二周再强化注射一次，计免疫三次，第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，至第7个月，共计检取7,500只免疫蛋。
3、制备抗继发感染细菌的特异性IgY粗提物
将所检取的免疫蛋用流动水洗净，酒精擦洗消毒，再用打蛋机打碎免疫蛋，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；按蛋黄液体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.0。
将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12-24小时；将稀释液于10,000rpm离心20分钟；取分离所得的上清置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCl2液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃静置8-12小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌；Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥，即制得抗继发感染细菌的特异性IgY粗提物，计700克。
4、抗继发感染细菌的特异性IgY的纯化；采用专利公开号为1307061的专利技术将所制得的抗继发感染细菌的特异性IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01MPB(磷酸盐缓冲液)液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，即制得抗继发感染细菌的特异性IgY纯品150克。
实施例6：用按实验例1-4详述的方法所制备的四种抗禽流感特异性IgY中的任意一种和抗继发感染细菌的特异性IgY按2∶1比例混合成抗禽流感特异性复合IgY 200g(抗禽流感特异性IgY 133.33g、抗继发特异性IgY 66.66g)，以此作为主要原料制成一种抗禽流感和继发感染常压喷雾剂。
抗禽流感特异性复合IgY            200g
甘油                             4,000g
PEG400                        5,000g
薄荷脑                        200g
香精                          80g
乙醇                          2,000mL
蒸馏水                        加至200升
抗禽流感特异性复合IgY溶于160升蒸馏水中，加入甘油混匀。薄荷脑、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混匀，在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤，补加蒸馏水至全量，用0.1mol、NaOH流液调pH至7.0。将药液灌入常压喷瓶中，每支20mL，全检合格后包装即得10,000支抗禽流感特异性复合IgY常压喷雾剂。
实施例7：用按实施例3详述的方法所制备的抗禽流感病毒多肽HA2蛋白特异性驼鸟IgY 100g，作为主要原料制成一种应用基因工程的抗禽流感常压喷雾剂。
抗流感特异性IgY                  100g
甘油                             2,000g
PEG400                           2,500g
薄荷脑                           100g
香精                             30g
乙醇                             1,000mL
蒸馏水                           加至100升
将抗HA2蛋白特异性驼鸟IgY溶于80升蒸馏水中，加入甘油混匀。薄荷脑、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混匀，在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤，补加蒸馏水至全量，用0.1mol、NaOH溶液调pH至7.0，灌装。将药液灌入常压喷瓶中，每支20mL，全检合格后包装即得10,000支抗流感IgY常压喷雾剂。
实施例8：用按实施例1详述的方法制备抗禽流感病毒特异性IgY 1.0克，用按实施例5详述的方法制备抗继发感染细菌的特异性IgY 1.0克，按1∶1比例混合成抗流感特异性复合IgY 2.0克，以这种复合IgY为主要原料，制成一种口含片。
抗流感特异性复合IgY          2.0g
羧甲基纤维素                 5.0g
硬脂酸镁                     0.6g
阿斯巴甜                  1.2g
薄荷香精                  0.8g
香橙香精                  1.0g
乙醇(30％浓度)            1,000mL
山梨糖醇                  加至溶解羧甲基纤维素成1％乙醇溶液
共制成                    1,000片
制备工艺如下：
1、山梨糖醇与阿斯巴甜充分混合均匀，过60目筛两次备用；
2、羧甲基纤维素分散于30％乙醇中制成1％乙醇溶液。
3、将1项用适量2项制软材，14目筛网制粒，60℃通风干燥，18目筛整粒。用40目筛筛出适量细粉与IgY充分混匀并喷入薄荷、香橙香精搅匀，再拌入硬脂酸镁，一起与整批颗粒混合均匀，密闭4小时以上供压片每片0.6g。检验合格后，供包装，全验出厂。
实施例9：用按实施例1详述的方法制备抗禽流感病毒特异性IgY 5.0g，并制成一种预防和治疗流感的新型注射剂。
抗流感病毒特异性纯IgY            5g
Pluronic F68                     10g
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)              10g
PEG400                           110g
聚山梨醇酯-80                    10g
注射用水                         加至1,000mL
1、注射用水，加入Pluronic和PVP，加热溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混匀；在搅拌下加入上述混合液中；再加0.1％针用活性炭，60℃搅拌15min；脱炭过滤；滤液密闭加热100℃30min，冷却至室温备用。
2、取经活性炭处理过的灭菌注射用水，于灭菌容器中加入抗流感病毒特异性纯IgY冻干粉溶解，继续搅拌下，以细流加于上述混合液中，用0.1mol的NaOH溶液调节pH至6.0～7.5，用脱炭灭菌注射用水补足全量。
3、已灭菌的0.45μm串联0.22μm微孔滤膜除菌过滤。于无菌灌封机中灌封于无菌容器中。每支2mL含纯抗流感病毒特异性纯IgY冻干粉5mg。灯检、检漏、印字、包装即得500支IgY注射剂。规格5mg/2mL。
实施例10：抗禽流感IgY手揿定量压力喷雾罐的制作
按以下配方调配200升抗禽流感特异性IgY组合溶液：
抗禽流感特异性IgY             300g
阿斯巴甜                      240g
香橙香精                      600g
水蜜桃香精                    200g
薄荷香精                      1,400g
蒸馏水                        加至200升
1、先取蒸馏水180升，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入复合IgY；接着加蒸馏水至200升，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1mol NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；
2、溶液调配好后，必须在压力罐生产在线灌装手动定量压力喷雾罐20000支，每支喷雾罐灌足10ml后，必须再充入压力氮气或者氟里昂作为助推剂(抛射剂)，装上定量阀门，密封，即得。
实施例11：制备抗继发感染细菌的特异性IgY常压喷雾剂
采用抗继发感染细菌的特异性IgY 50g，作为主要原料制成一种抗继发感染常压喷雾剂。
抗继发感染细菌的特异性IgY        50g
甘油                             1,000g
PEG400                           1,250g
薄荷脑                           50g
香精                             15g
乙醇                             5000mL
蒸馏水                           加至50升
将抗继发感染细菌的特异性IgY溶于蒸馏水中，加入甘油混匀。薄荷脑、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混匀，在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤，补加蒸馏水至全量，用0.1mol、NaOH流液调pH至6.5。将药液灌入常压喷瓶中，每支20ml，全检合格后包装即得2,500支抗继发感染IgY常压喷雾剂。检、检漏、印字、包装即得500支IgY注射剂。规格5mg/2ml。

Claims (4)

1.一种制备抗禽流感特异性IgY的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(S1)取流感病毒受体，所述流感病毒受体为「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」，将所述「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神经氨酸」按1∶1比例混合，制成浓度200微克/mL溶液，然后以1-10∶1-10比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得流感病毒受体抗原；
(S2)利用所述流感病毒受体抗原，对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的抗禽流感免疫蛋；
(S3)取所述抗禽流感免疫蛋的蛋黄，制备抗禽流感特异性IgY粗提物；
(S4)对所述抗禽流感特异性IgY粗提物进行纯化，制得抗禽流感特异性IgY纯品；
(S5)对所述抗禽流感特异性IgY纯品进行过滤处理，以滤除各种细菌和病毒，得到抗禽流感特异性IgY成品。
2.根据权利要求1所述的制备抗禽流感特异性IgY的方法，其特征在于，
在所述步骤(S3)中，按以下步骤制备抗禽流感特异性IgY粗提物；取所述抗禽流感免疫蛋的蛋黄，搅拌均匀；按蛋黄液体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0N盐酸溶液调pH至5.5-6.0；进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12-24小时；将稀释液于10,000rpm离心20分钟，取分离所得的上清置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCl2液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃静置8-12小时；8,000rpm离心20分钟，取上清，再经0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌，Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去病毒，再冷冻干燥，即制得抗禽流感病毒特异性IgY粗提物；
在所述步骤(S4)中，按以下步骤对所述抗禽流感特异性IgY粗提物进行纯化：取所述抗禽流感特异性IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01M磷酸盐缓冲液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，可制得抗禽流感特异性IgY纯品；
在所述步骤(S5)中，按以下步骤对所述抗禽流感特异性IgY纯品进行过滤处理：用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门氏菌等细菌；用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感、肠病毒在内的多种病毒。
3.一种制备抗禽流感特异性复合IgY的方法，其特征在于，取权利要求1或2所述方法制得的抗禽流感特异性IgY，并取抗继发感染致病菌特异性IgY，按1-10∶1-10的比例混合均匀，即制成抗禽流感特异性复合IgY；其中所述抗继发感染致病菌特异性IgY采用以下步骤制得：
(S21)按以下步骤制备继发感染致病菌抗原：将A簇B型溶血性链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、MRSA金黄色葡萄球菌、以及肺结核菌按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10比例混合，制得致病细菌混合物，再将这种致病细菌混合物按1-10∶1-10比例加入福氏佐剂，用高速匀浆器以8,000-30,000rpm处理，成为油包水乳液，即制得继发感染致病菌复合抗原；
(S22)利用所述继发感染致病菌抗原，对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的抗继发感染致病菌免疫蛋；
(S23)取所述抗继发感染致病菌免疫蛋的蛋黄，制备抗继发感染致病菌特异性IgY粗提物；
(S24)对所述抗继发感染致病菌特异性IgY粗提物进行纯化，制得抗继发感染致病菌特异性IgY纯品；
(S25)对所述抗继发感染致病菌特异性IgY纯品进行过滤处理，以滤除各种细菌和病毒，得到抗继发感染致病菌特异性IgY成品。
4.一种抗禽流感制剂，其特征在于，其中包括：
含量为0.01-20.0％的按权利要求1或2所述方法制得的抗禽流感特异性IgY，或者是含量为0.01-20.0％的按权利要求4所述方法制得的抗禽流感特异性复合IgY；
以及含量为99.99-80.0％的辅料；
所述制剂是雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂、喷喉剂、口喷剂、口含片、口服液、胶囊或注射剂。
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