CN104546715B - 一种用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂及其制备方法,所述喷剂的成分包括：抗流感病毒抗体、抗致病菌抗体和氯已定。本发明通过改进配方和制备工艺,成功实现了氯已定与具有抗病毒功效的特异抗体配伍，起到协同作用，比各自单独使用效果更好，可用于预防上呼吸道病毒及细菌的感染和传播。

Description

一种用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种口腔喷剂，具体涉及一种用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂及其制备方法。

背景技术

上呼吸道感染简称上感，又称感冒,发生率较高,成人每年发生2～4次，儿童发生率更高，每年6～8次。全年皆可发病，冬春季较多。上呼吸道感染有70％～80％由病毒引起。包括鼻病毒、冠状病毒、腺病毒、流感病毒和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒等。另有20％～30％的上感由细菌引起。细菌感染可直接感染或继发于病毒感染之后，以溶血性链球菌为最常见，其次为流感嗜血杆菌、肺炎球菌、葡萄球菌等，偶或为革兰阴性细菌。各种导致全身或呼吸道局部防御功能降低的原因，如受凉、淋雨、气候突变、过度疲劳等可使原已存在于上呼吸道的或从外界侵入的病毒或细菌迅速繁殖，从而诱发呼吸道感染。老幼体弱，免疫功能低下或患有慢性呼吸道疾病的患者易感。

广谱抗菌剂氯已定又名洗必泰(Chlorhexidine)对革兰氏阳性菌比阴性菌的抗菌作用强，比季铵盐类阳离子表面活性剂强，对真菌也有效，对组织无刺激性，被广泛地用于皮肤消毒，冲洗伤口及手术器械的浸泡及消毒。

大多数中和抗体在体内与体外一样具有结合病毒并使病毒感染力减弱的能力，作用机制主要包括：1.通过凝集病毒，使病毒的结构失稳，抑制病毒对靶细胞的吸附；2.抑制病毒与靶细胞的黏附；3.阻止病毒侵入靶细胞；4.抑制病毒侵入后的效应。

喷剂为气压制剂，一般以局部应用为主，喷射的雾滴比较粗，但可以满足临床的需要。以压缩空气作动力，其喷出的微粒大小约在20～60μm，当人体吸入后能达到末端支气管；以惰性气体作动力喷出的微粒大小为10μm以下，吸入后可达到肺部深处。适合用于肺部吸入或直接喷至腔道黏膜、皮肤及空间消毒的制剂。

目前,市场上还没有既可以抵抗病毒又可以抵抗细菌的特效药物。一般情况下，氯已定能与蛋白结合而降低活性，也忌与生物学上常用的生理盐水、磷酸盐、碳酸盐、硼酸盐等接触，因可生成而沉淀而降低其活性。由于这些原因，限制了氯已定与其他生物活性配伍使用机会。

发明内容

本发明要解决的问题是,通过改进配方和制备工艺成功实现了氯已定与具有抗病毒功效的特异抗体配伍，起到协同作用，比各自单独使用效果更好，可用于预防上呼吸道病毒及细菌的感染和传播。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂,所述喷剂的成分包括：抗流感病毒抗体、抗致病菌抗体和氯已定。

优选的，所述抗流感病毒抗体和抗致病菌抗体的含量按效价计均为100-50000滴度，优选的，效价为1000-10000滴度。

优选的，所述氯已定的含量为0.001％-1％(w/v)，优选的，含量为0.01％-0.1％(w/v)。

优选的，所述喷剂的成分还包括：

(1)磷酸盐缓冲液：终浓度为5-200mM,pH值为6-8.5；

(2)聚乙二醇：终浓度1％-10％(w/v)；

(3)香精：终浓度0.001％-0.5％(v/v)。

一种制备用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂的方法，包括如下步骤:

(1)取适量抗体原液，用缓冲液稀释抗体至各效价为终产品中抗体效价的2-4倍，备用；所述终产品中所含抗体效价均为100-50000滴度，优选的，效价为1000-10000滴度；所述抗体原液为由流感病毒和致病菌混合抗原制备的抗体原液,或者是分别由流感病毒抗原和致病菌抗原制备两个抗体原液的混合液；

(2)取聚乙二醇，用纯净水将聚乙二醇调配成5-10倍于终浓度的溶液,优选的,制备成10-50％(w/v)的高浓度溶液,备用；所述聚乙二醇的终浓度为1-10％(w/v)；

(3)取氯已定，用纯净水稀释至终产品体积的50％或以上的体积，备用；所述氯已定的含量为0.001％-1％(w/v)，优选的，含量为0.01％-0.1％(w/v)；

(4)将步骤(2)制得的聚乙二醇水溶液和步骤(3)制得的氯已定水溶液预混合后再加入步骤(1)制得的抗体液，混匀，如果体积不到终产品的体积量，用纯净水定容至终产品的体积量；优选的，定容后加入终浓度0.1％(v/v)的香精，混匀；

(5)制备好的混合液经0.2μ-0.45μ滤膜过滤后灌装于口腔喷雾瓶中。优选的，所述抗体原液为鸡蛋抗体原液和山羊抗体原液的一种或两种。

优选的，所述鸡蛋抗体原液的制备方法包括如下步骤：

(1)用抗原乳化液连续免疫母鸡，每10-14天一次，免疫4-5次后收集鸡蛋，每连续收集1个月鸡蛋后需补充免疫一次，继续收集鸡蛋,分离出蛋黄；

(2)加入蛋黄重量1-10倍的0.1-10％甘露醇水溶液稀释蛋黄，离心，收集含抗体的上清液；

(3)将该上清液加到经上样缓冲液平衡的DEAE离子树脂柱，依次从低到高用0.1-1M浓度的NaCl缓冲液洗脱柱子，收集0.5-0.8M的NaCl洗脱的含IgY抗体流分；

(4)用PBS缓冲液调节或浓缩纯化抗体效价至1000滴度以上，分装后低温储存，备用。

优选的，所述山羊抗体原液的制备方法包括如下步骤：

(1)用抗原乳化液连续免疫山羊3-5次，每10-14天免疫一次，抽血并提取血清；

(2)加入1-5倍于血清量的30％PEG-6000溶液，静置1-12小时后高速离心，弃去上清，将沉淀用5-50倍体积量的PBS缓冲液溶解；

(3)将该沉淀溶解液通过活性炭柱过滤，收集抗体滤液；优选的，进一步用protein-A亲和柱纯化抗体；

(4)将步骤(3)制得的抗体液用PBS缓冲液调节或浓缩抗体效价至1000滴度以上，分装后低温储存，备用。

优选的，所述抗原乳化液的制备方法包括如下步骤：

将经裂解灭活的流感病毒和致病菌分别或二者组合与LPS、橄榄油、Tween80按照2：0.2:1:0.8的质量比例混合，然后用超声波乳化制得组合抗原乳化液。

优选的，所述裂解灭活的流感病毒包括：甲型流感病毒H0N1、H1N1、H2N2、H3N2及禽流感病毒H5N1、H9N2、H7N9中的一种或两种以上；

所述裂解灭活的致病菌包括：溶血性链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎球菌、葡萄球菌抗体中的一种或两种以上。

本发明具有的优点和积极效果是：本发明将氯已定和具有抗病毒功效的特异抗体配伍，通过改进配制程序，将稀释后的氯已定水溶液先与聚乙二醇水溶液混合后，再与含抗体的缓冲液混合，避免了氯已定与抗体蛋白或缓冲盐溶液接触生成沉淀而降低活性的问题，能够既抗病毒又抗细菌；制备得到的复合抗体口腔喷剂作为预防感冒的药物使用，其降低感染率高达80％，并且，氯已定和抗体配伍的功效，优于单独使用氯已定和抗体的效果之和，具有协同作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

实施例1

抗流感病毒及致病菌抗体原液的制备方法，包括如下步骤：

(1)将经裂解灭活的流感病毒抗原按H1N1：H2N2：H3N2＝2：1：2的质量比例混合后制得病毒组合抗原；

(2)将经裂解灭活的溶血性链球菌和肺炎球菌的菌体按1：1的质量比例混合后制得致病菌组合抗原；

(3)将步骤(1)得到的病毒组合抗原和步骤(2)得到的致病菌组合抗原按1：1的质量比例混合，再将混合后的抗原与LPS、橄榄油及Tween80按2:0.2：1:0.8的质量比例混合，然后用超声波乳化5min，制得病毒-细菌组合抗原乳化液；

(4)用该抗原乳化液连续免疫母鸡5次，每10天免疫一次，收集鸡蛋，每连续收集1个月鸡蛋后需补充免疫一次，将鸡蛋分离出蛋黄，加5倍量的1％甘露醇水溶液稀释蛋黄，10000rpm离心，收集含抗体的上清液；

(5)将该上清液加到PBS平衡过的DEAE离子树脂柱，依次用0.2M、0.4M、0.7M的NaCl洗脱柱子，收集0.7M的NaCl洗脱的流分，便得到纯度约90％的IgY抗体；

(6)用PBS缓冲液调纯化抗体效价至10000滴度，便制得抗流感病毒及致病菌抗体原液，分装后-20℃储存，备用。

实施例2

抗禽流感病毒及致病菌抗体原液的制备方法，包括如下步骤：

(1)将经裂解灭活的禽流感病毒抗原按H5N1：H9N2：H7N9＝2：1：2的质量比例混合后制得病毒组合抗原；

(2)将经裂解灭活的肺炎球菌和葡萄球菌菌体按1：1的质量比例混合后制得致病菌组合抗原；

(3)将步骤(1)制得的病毒组合抗原和步骤(2)制得的致病菌组合抗原按2：1的质量比例混合后再与LPS、橄榄油及Tween80按2:0.2：1:0.8的质量比例混合，之后用超声波乳化5min，制得病毒-细菌组合抗原乳化液；

(4)用该抗原乳化液连续免疫山羊4次，每两周免疫一次，提取血清；

(5)然后加入2倍于血清量的30％的PEG-6000，静置2h后10000rpm离心20min，弃去上清，将沉淀用20倍体积的PBS溶解；

(6)将该抗体溶解液通过活性炭柱过滤去除病毒及微生物；

(7)用PBS缓冲液调节纯化抗体效价至10000滴度，便制得抗禽流感病毒及致病菌抗体原液，分装后-20℃储存，备用。

实施例3

用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂-II的制备方法(以1L制备量为例)，包括如下步骤：

(1)取实施例1制得的抗体原液，用20mM(pH7.2)磷酸盐缓冲液稀释至效价为5000滴度，制备200ml备用；

(2)取市购PEG-4000共30g，用100ml纯净水调配成30％的水溶液，备用；

(3)取市购20％葡萄糖酸氯已定水溶液2ml，用700ml纯净水稀释，备用；

(4)将上述步骤(2)制得的PEG水溶液100ml和步骤(3)制得的氯已定水溶液700ml预混合，然后加入步骤(1)制得的抗体液200ml，混匀后再加薄荷香精1ml，混匀便得到用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂-II；

(5)将上述步骤(4)制得的用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂-II经0.2μ滤膜过滤后分装于口腔喷雾瓶，每瓶15ml。

实施例4

用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂-III的制备方法(以1L制备量为例)，包括如下步骤：

(1)取实施例1制得的抗体原液，用20mM(pH7.2)磷酸盐缓冲液稀释至效价为5000滴度，制备200ml备用；

(2)取实施例2制得的抗体原液，用20mM(pH7.2)磷酸盐缓冲液稀释至效价为5000滴度，制备200ml备用；

(3)取20g PEG-20000，用水调配成20％的水溶液，制备100ml备用；

(4)取20％葡萄糖酸氯已定水溶液2ml，用500ml纯净水稀释，备用；

(5)将上述步骤(3)制得的PEG水溶液100ml和步骤(4)制得的氯已定水溶液500ml预混合，然后再加入步骤(1)制得的抗体液200ml和步骤(2)制得的抗体液200ml，混匀后加柠檬香精1ml，再混合均匀，便得到用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂-III；

(6)将上述步骤(5)制得的用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂-III经0.2μ滤膜无菌过滤后分装于口腔喷雾瓶，每瓶15ml。

对比例1

用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂-I的制备方法(以1L制备量为例)，包括如下步骤：

(1)取实施例1制得的抗体原液，用20mM(pH7.2)磷酸盐缓冲液稀释至效价为5000滴度，制备200ml备用；

(2)取市购PEG-4000共30g，用100ml纯净水调配成30％的水溶液，备用；

(3)将上述步骤(1)制得的抗体液200ml和步骤(2)制得的PEG水溶液100ml预混合，之后加入20mM(pH7.2)磷酸盐缓冲液700ml，混匀后再加薄荷香精1ml，混匀，便得到用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂-I；

(4)将上述步骤(3)制得的用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂-I经0.2μ滤膜过滤后分装于口腔喷雾瓶，每瓶15ml。

对比例2

氯已定口腔喷剂的制备方法(以1L制备量为例)，包括如下步骤：

(1)取20％葡萄糖酸氯已定水溶液2ml，用500ml纯净水稀释，备用；

(2)取20g PEG-20000，用纯净水调配成20％的水溶液，制备100ml备用；

(3)将上述步骤(1)制得的氯已定水溶液500ml和步骤(2)制得的PEG水溶液100ml预混合，然后再加入400ml纯净水，混匀后加柠檬香精1ml，再混合均匀，便得到氯已定口腔喷剂；

(4)将上述步骤(3)制得的氯已定口腔喷剂经0.2μ滤膜无菌过滤后分装于口腔喷雾瓶，每瓶15ml。

实施例5

比较不同配方上呼吸道感染口腔喷剂在预防感冒(包括病毒性和细菌性感冒)中的效果：

在感冒高发期，从幼儿园挑选4-5岁志愿者(经家长同意)100名(不分性别)，如表1所示，随机分成5组，每组各20名儿童。给组1-4的儿童分别用实施例3和4，对比例1和2所制备的口腔喷剂，给组5(对照组)儿童用生理盐水口腔喷剂，所有儿童每天喷口腔4次，每次3-4喷，连续进行20天，每天观察每组儿童有否感冒症状：发烧、咽喉肿痛、咳嗽、流鼻涕等，并记录。试验结果如表1所示：

表1.比较不同配方上呼吸道感染口腔喷剂的预防感冒功效：

注：感染率＝感冒人数/实验人数。

降低感染率＝[对照组感染率-实验组感染率]/对照组感染率。

上述结果显示：组1-4的口腔喷剂均有不同程度的预防感冒作用，尤其是，实施例4的复合抗体口腔喷剂降低感染率高达80％。而且实施例3的功效(降低感染率67％)大于对比例1(降低感染率47％)+对比例2(降低感染率13％)的总和，这说明抗体与氯已定的混合使用有协同作用，比单独使用效果更好。

以上所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.一种用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂，其特征在于：所述喷剂的成分包括：抗流感病毒抗体、抗致病菌抗体和氯已定；所述抗流感病毒抗体和抗致病菌抗体的含量按效价计均为1000-10000滴度；所述氯已定含量为0.01％-0.1％w/v；

所述的用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂由包括如下步骤的方法制得：

(1)取适量抗体原液，用缓冲液稀释抗体至各效价为终产品中抗体效价的2-4倍，备用；所述终产品中所含抗体效价均为1000-10000滴度；所述抗体原液为由流感病毒和致病菌混合抗原制备的抗体原液，或者是分别由流感病毒抗原和致病菌抗原制备两个抗体原液的混合液；

(2)取聚乙二醇，用纯净水将聚乙二醇调配成5-10倍于终浓度的溶液，制备成10-50％w/v的高浓度溶液，备用；所述聚乙二醇的终浓度为1-10％w/v；

(3)取氯已定，用纯净水稀释至终产品体积的50％或以上的体积，备用；所述氯已定的含量为0.01％-0.1％w/v；

(4)将步骤(2)制得的聚乙二醇水溶液和步骤(3)制得的氯已定水溶液预混合后再加入步骤(1)制得的抗体液，混匀，如果体积不到终产品的体积量，用纯净水定容至终产品的体积量；

(5)制备好的混合液经0.2μm-0.45μm滤膜过滤后灌装于口腔喷雾瓶中。

2.根据权利要求1所述的用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂，其特征在于：所述喷剂的成分还包括：

(1)磷酸盐缓冲液：终浓度为5-200mM，pH值为6-8.5；

(2)香精：终浓度0.001％-0.5％v/v。

3.一种权利要求1所述的用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

(1)取适量抗体原液，用缓冲液稀释抗体至各效价为终产品中抗体效价的2-4倍，备用；所述终产品中所含抗体效价均为1000-10000滴度；所述抗体原液为由流感病毒和致病菌混合抗原制备的抗体原液，或者是分别由流感病毒抗原和致病菌抗原制备两个抗体原液的混合液；

(2)取聚乙二醇，用纯净水将聚乙二醇调配成5-10倍于终浓度的溶液，制备成10-50％w/v的高浓度溶液，备用；所述聚乙二醇的终浓度为1-10％w/v；

(3)取氯已定，用纯净水稀释至终产品体积的50％或以上的体积，备用；所述氯已定的含量为0.01％-0.1％w/v；

(4)将步骤(2)制得的聚乙二醇水溶液和步骤(3)制得的氯已定水溶液预混合后再加入步骤(1)制得的抗体液，混匀，如果体积不到终产品的体积量，用纯净水定容至终产品的体积量；

(5)制备好的混合液经0.2μm-0.45μm滤膜过滤后灌装于口腔喷雾瓶中。

4.根据权利要求3所述的用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中定容后加入香精的终浓度为0.1％v/v。

5.根据权利要求3所述的用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂的制备方法，其特征在于：所述抗体原液为鸡蛋抗体原液和山羊抗体原液的一种或两种。

6.根据权利要求5所述的用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂的制备方法，其特征在于：所述鸡蛋抗体原液的制备方法包括如下步骤：

(1)用抗原乳化液连续免疫母鸡，每10-14天一次，免疫4-5次后收集鸡蛋，每连续收集1个月鸡蛋后需补充免疫一次，继续收集鸡蛋,分离出蛋黄；

(2)加入蛋黄重量1-10倍的0.1-10％甘露醇水溶液稀释蛋黄，离心，收集含抗体的上清液；

(3)将该上清液加到经上样缓冲液平衡的DEAE离子树脂柱，依次从低到高用0.1-1M浓度的NaCl缓冲液洗脱柱子，收集0.5-0.8M的NaCl洗脱的含IgY抗体流分；

(4)用PBS缓冲液调节或浓缩纯化抗体效价至1000滴度以上，分装后低温储存，备用。

7.根据权利要求5所述的用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂的制备方法，其特征在于：所述山羊抗体原液的制备方法包括如下步骤：

(1)用抗原乳化液连续免疫山羊3-5次，每10-14天免疫一次，抽血并提取血清；

(2)加入1-5倍于血清量的30％PEG-6000溶液，静置1-12小时后高速离心，弃去上清，将沉淀用5-50倍体积量的PBS缓冲液溶解；

(3)将该沉淀溶解液通过活性炭柱过滤，收集抗体滤液；

(4)将步骤(3)制得的抗体液用PBS缓冲液调节或浓缩抗体效价至1000滴度以上，分装后低温储存，备用。

8.根据权利要求6或7所述的用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂的制备方法，其特征在于：所述抗原乳化液的制备方法包括如下步骤：

将经裂解灭活的流感病毒和致病菌分别或二者组合与LPS、橄榄油、Tween80按照2：0.2:1:0.8的质量比例混合，然后用超声波乳化制得组合抗原乳化液。

9.根据权利要求8所述的用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂的制备方法，其特征在于：

所述裂解灭活的流感病毒包括：甲型流感病毒H0N1、H1N1、H2N2、H3N2及禽流感病毒H5N1、H9N2、H7N9中的一种或两种以上；

所述裂解灭活的致病菌包括：溶血性链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎球菌、葡萄球菌抗体中的一种或两种以上。

10.根据权利要求7所述的用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中收集抗体滤液后用protein-A亲和柱纯化抗体。