CN102268090A - 一种暹罗鳄血液提取物及其提取方法和用途 - Google Patents
一种暹罗鳄血液提取物及其提取方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种暹罗鳄鱼血液提取物及其提取方法，该提取物是以新鲜鳄鱼动脉血为原料，通过如下步骤提取：a.将鳄鱼血进行抗凝处理，分离血浆；b.饱和硫酸铵法粗提免疫球蛋白；c.DEAE-52阴离子交换层析纯化免疫球蛋白，即得。所提取得的暹罗鳄血液提取物与HIV-1整合酶结合具有特异性，实验证明具有抗HIV-1活性和抗甲型H1N1流感病毒活性的作用，可用于治疗艾滋病和甲型H1N1流感。
Description
技术领域
本发明涉及一种鳄鱼血液提取物及其提取方法和用途，属医药技术领域。
背景技术
鳄鱼血富含多种生物活性成分，是宝贵的生物资源，蕴藏着巨大的开发潜力和利用价值。我国古代称鳄鱼为“鼍龙”，又名鮀鱼(《神农本草经》)、土龙(《续博物志》)。暹罗鳄鱼是鳄鱼的一种，主要分布于泰国中部、柬埔寨、马来西亚、印度尼西亚婆罗洲(旧称加里曼丹)东部等地。
现代对鳄鱼的深入研究从未停止，鳄鱼血的研究在全球是广泛共识的。目前主要被用于三个方面的研究利用中：1、抗菌、抗病毒，2、抗肿瘤，3运动医学。研究结果表明，鳄鱼是地球上唯一不患癌症的动物，是目前爬行动物中最长寿的一种。它具有超强的生命力和‘长生不老’的生命特征。鳄鱼血具有杀菌、抗辐射、抗衰老的作用，同时，它还是一种全新的、强力的、唯一的对人体无任何伤害的超级补体。它在本世纪必定会为人类的健康做出重大的贡献。因此如何利用现有的资源开发鳄鱼血，是一项值得研究的项目。
发明内容
本发明目的在于提供一种暹罗鳄血液提取物；本发明的第二个目的是提供一种暹罗鳄血液提取物的提取方法；本发明的第三个目的是提供一种暹罗鳄血液提取物在药物制备中的新用途。
本发明目的是通过如下技术方案实现的。
本发明所述暹罗鳄血液提取物是以新鲜鳄鱼动脉血为原料，通过如下步骤提取的：
a.将鳄鱼血进行抗凝处理，分离血浆；
b.饱和硫酸铵法粗提免疫球蛋白；
c.DEAE-52阴离子交换层析纯化免疫球蛋白，即得。
所述步骤a可按如下方法操作：
取经检验合格的新鲜鳄鱼动脉血，用3.5％～4％的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1∶8～10混合抗凝，静置0.5～1.5h，将抗凝血置于冷冻离心机，在2～10℃转速3000r/min下，离心8～15min，收集上清液，得到血浆。
所述步骤b可按如下方法操作：
1)取血浆，加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液，边加边搅拌，使成为30％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置0.5～1.5h；
2)在2～10℃转速10000r/min下，离心15～25min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白原，得到上清液；
3)在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液，使(NH4)2SO4终浓度为50％，充分混合，静置1.5～2.5h；
4)在2～10℃转速10000r/min下，离心15～25min，得到蛋白沉淀；
5)于蛋白沉淀中加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置1.5～2.5h；
6)在2～10℃转速10000r/min下，离心15～25min，分别取蛋白沉淀，上清液；
7)重复步骤5)和6)2～3次，收集末次沉淀物即为免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除盐，-20℃保存。
所述步骤c可按如下方法操作：
将溶解的免疫球蛋白粗提物经DEAE-52(中文名称：二乙氨基乙基纤维素)进行纯化，柱长15cm，直径1cm，盐梯度洗脱，缓冲液为pH7.2的buffer A(50mMPB+2M NaCL)(MPB代表醋酸盐缓冲液∶乙睛＝5∶95)，洗脱时NaCl浓度由0至1.0mol·L-1，洗脱流速为0.3mL·min-1，每管1.5mL，收集蛋白峰，即得。
本发明所述暹罗鳄血液提取物优选如下方法提取：
a.将鳄鱼血进行抗凝处理，分离血浆：
取经检验合格的新鲜鳄鱼动脉血，用3.8％的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1∶9混合抗凝，静置1h，将抗凝血置于冷冻离心机，在6℃转速3000r/min下，离心10min，收集上清液，得到血浆；
b.饱和硫酸铵法粗提免疫球蛋白：
1)取血浆，加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液，边加边搅拌，使成为30％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置1h；
2)在6℃转速10000r/min下，离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白原，得到上清液；
3)在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液，使(NH4)2SO4终浓度为50％，充分混合，静置2h；
4)在6℃转速10000r/min下，离心20min，得到蛋白沉淀；
5)于蛋白沉淀中加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置2h；
6)在6℃转速10000r/min下，离心20min，分别取蛋白沉淀，上清液；
7)重复步骤5)和6)2次，收集末次沉淀物即为免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除盐，-20℃保存。
c.DEAE-52阴离子交换层析纯化免疫球蛋白：
将溶解的免疫球蛋白粗提物经DEAE-52(二乙氨基乙基纤维素)进行纯化，柱长15cm，直径1cm，盐梯度洗脱，缓冲液为pH7.2的buffer A(50mMPB+2M NaCL)，洗脱时NaCl浓度由0至1.0mol·L-1，洗脱流速为0.3mL·min-1，每管1.5mL，收集蛋白峰，即得。
本发明所述饱和硫酸铵溶液和0.01ml/L、pH值7.0的磷酸盐缓冲液(简称PBS)可按常规的方法配制，也可按本发明提供的如下方法配制：
饱和硫酸铵溶液的配制：称(NH4)2SO4(AR级别)400～425重量份，以50～80℃蒸馏水500体积份溶解，搅拌20min，趁热过滤；冷却后以15N NH4OH的浓氨水调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。
0.01ml/L、pH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)的配制：称7.9重量份NaCl，0.2重量份KCl，0.24重量份KH2PO4和1.8重量份K2HPO4，溶于800体积份蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.0，最后加蒸馏水定容至10000体积份，4℃保存即可。0.24重量份KH2PO4可用1.44重量份Na2HPO4代替。
本发明所述重量份/体积份的单位对应关系为g/ml。
本发明所述鳄鱼指暹罗鳄。
本发明所述暹罗鳄血液提取物可制备成注射制剂：肌肉注射剂、静脉注射剂、冻干粉针剂等。
本发明所述暹罗鳄血液提取物采用饱和硫酸铵法提取，并用DEAE-52阴离子交换层析纯化，所提取得的免疫蛋白提取物与HIV-1整合酶结合具有特异性，实验证明具有抗HIV-1活性和抗甲型H1N1流感病毒活性的作用，可用于治疗艾滋病和甲型H1N1流感。
附图说明
图1e样品结合HIV-1整合酶蛋白比较图谱(注：整合酶蛋白(全长)BIA结合值为9808.9RU。)
图2DEAE-52阴离子交换层析纯化免疫球蛋白所得蛋白峰
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1利用BIAcore技术对本发明鳄鱼血提取物与HIV-1整合酶的结合进行研究
1.样品的制备
(1)95％乙醇分别提取样品e1、e2、e3、e7、e8
①鳄鱼血的抗凝处理、红细胞和血浆的分离
取经检验合格的新鲜鳄鱼动脉血，用3.8％的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1∶9混合抗凝，静置1h，将抗凝血置于冷冻离心机，在2～10℃转速3000r/min下，离心10min，收集上清液，得到血浆e1。
②95％乙醇提取
取血浆e1，加入95％乙醇，在0～4℃，搅拌，2h，转速3000r/min下，离心10min，分别得到上清液为e2，沉淀为e3。沉淀e3再加入95％乙醇，搅拌离心得到e7，重复一次，得到e8。
(2)饱和硫酸铵法提取
按实施例1所述方法分别提取样品e4、e5、e6。
2.实验方法
(1)整合酶靶蛋白与芯片表面耦联
①活化：将NHS与EDC混合离心后上样，活化芯片表面的葡聚糖。
②耦联蛋白：将靶蛋白上样与芯片耦联。
③封闭：将封闭液离心后上样，以封闭芯片表面未与蛋白结合的部位。
(2)SPR分析：将准备好的样品上样进行SPR检测。一个SPR循环包括待检样品的注入(结合期)，缓冲液流经芯片表面(解离期)，洗脱与芯片表面靶蛋白结合的样品(再生期)。每一时期的响应值RU(1RU的响应值等价于芯片表面结合物质的浓度改变了1pg/mm2)实时检测，经SPR分析最终得出各种样品与靶蛋白结合值的大小及图谱。
3、实验结果
结果见表1、图1。
表1 鳄鱼血提取物与HIV-1整合酶蛋白结合的RU值
BIA结果显示e样品与HIV-1整合酶结合为特异性。采用本发明硫酸铵法提取的免疫蛋白e6和e4与HIV-1整合酶蛋白结合的RU值要显著优于95％乙醇提取的e7和e8，其中免疫蛋白e6的结合效果最强。
实验例2 MAGI-test检测本发明鳄鱼血提取物抗HIV-1活性
1.样品的制备
样品e1、e2、e3、e4、e5、e7、e8的提取方法同实验例1。
2.实验方法
(1)96孔细胞培养板接种TZMbl细胞，6000～8000cells/孔，37℃、5％CO2培养24h，细胞约50％成层。
(2)样品处理：将样品稀释为适合的浓度，4-5个梯度。
(3)病毒稀释：从液氮罐内取出病毒，溶化后用含20μg/mL DEAE的培养基稀释病毒。
(4)加样：取出96孔细胞培养板，轻轻吸去培养基，快速加入100μL/孔待测样品(每个浓度待测样品设4个复孔)，然后加入100μL病毒稀释液。同时设立病毒对照组(只加入DMEM培养基和病毒稀释液，100μL/孔)和细胞对照组(只加入DMEM和含20μg/mLDEAE的DMEM培养基，100μL/孔)。37℃，5％CO2培养48h。
(5)48h后固定、染色、显微镜计数蓝斑。
(6)按照公式1计算鳄鱼血提取物对病毒的抑制率
3、实验结果
结果见表2、表3、表4。
表2样品e1、e2、e3的HIV-1病毒抑制率
表3样品e4、e5、e6、e7、e8的HIV-1病毒抑制率
研究结果显示，e1、e2样品有毒性，不能抑制HIV-1病毒；采用本发明硫酸铵法提取的e4、e5、e6的HIV-1病毒抑制率要显著优于95％乙醇提取的e7和e8，其中免疫蛋白e6的HIV-1病毒抑制效果最明显。表4是第21管收集的免疫蛋白e6的HIV-1病毒抑制结果。
表4第21管收集的免疫蛋白e6的HIV-1病毒抑制结果
实验例3ELISA方法研究鳄鱼血样品抗甲型H1N1流感病毒活性
1.样品的制备
样品e1、e2、e3、e4、e5、e7、e8的提取方法同实验例1。
2.实验方法
(1)将MDCK细胞1.5x104/孔铺于96孔板，放置37℃5％CO2培养箱中培养24小时使之贴壁生长。
(2)检测鳄鱼血提取物对甲型流感的治疗效果：用50TCID50的甲型流感病毒100μL/孔感染MDCK细胞，1h后，弃病毒液，用PBS洗2次，加入不同浓度的鳄鱼血提取物(最大无毒剂量开始)，同时设置阳性药物对照组、不加药的病毒对照组(VC)、正常细胞对照组(CC)，均为4个复孔。
(3)ELISA法检测药效：35℃培养箱培养18-22h后，弃上清后将细胞用80％的丙酮固定，一抗用鼠源抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，二抗用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，再加入显色液和终止液，则病毒感染程度越严重，检测到的病毒核蛋白越多，则测定的OD值越大。据此我们将药物作用于细胞，用此方法检测病毒感染细胞情况即可知药物的药效。用酶标仪测定各孔的OD值(492nM)，根据公式2计算出鳄鱼血提取物对细胞的保护率。
3、实验结果
结果见表5、表6。
表5样品e4、e5、e6、e7、e8、达菲、莲花清瘟胶囊抗甲型H1N1流感病毒效果对比
研究结果显示，e8样品有毒性，不能抑制甲型H1N1流感病毒；采用本发明硫酸铵法提取的e4、e5、e6的HIV-1病毒抑制率要显著优于95％乙醇提取的e7、e8和莲花清瘟胶囊。表6是第20管收集的免疫蛋白e6的抗甲型H1N1流感病毒结果。
表6第20管收集的免疫蛋白e6的抗甲型H1N1流感病毒结果。
下述实施例均能实现上述实验例所述效果。
具体实施方式
实施例1本发明暹罗鳄血液提取物
a.将鳄鱼血进行抗凝处理，分离血浆：
取经检验合格的新鲜鳄鱼动脉血，用3.8％的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1∶9混合抗凝，静置1h，将抗凝血置于冷冻离心机，在6℃转速3000r/min下，离心10min，收集上清液，得到血浆e1；
b.饱和硫酸铵法粗提免疫球蛋白：
1)取血浆e1，加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液，边加边搅拌，使成为30％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置1h；
2)在6℃转速10000r/min下，离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白原，得到上清液；
3)在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液，使(NH4)2SO4终浓度为50％，充分混合，静置2h；
4)在6℃转速10000r/min下，离心20min，得到蛋白沉淀e4；
5)于蛋白沉淀e4中加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置2h；
6)在6℃转速10000r/min下，离心20min，分别取蛋白沉淀，上清液；
7)重复步骤5)和6)2次，收集上清液，透析，浓缩，得到e5，收集末次沉淀物即为免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除盐，-20℃保存。
c.DEAE-52阴离子交换层析纯化免疫球蛋白：
将溶解的免疫球蛋白粗提物，经DEAE-52进行纯化，柱长15cm，直径1cm，盐梯度洗脱，缓冲液为pH7.2的buffer A，洗脱时NaCl浓度由0至1.0mol·L-1，洗脱流速为0.3mL·min-1，每管1.5mL，收集蛋白峰(如图2所示)，得纯化免疫球蛋白e6，即本发明暹罗鳄血液提取物。
实施例2本发明暹罗鳄血液提取物
a.将鳄鱼血进行抗凝处理，分离血浆：
取经检验合格的新鲜鳄鱼动脉血，用3.6％的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1∶8混合抗凝，静置0.5h，将抗凝血置于冷冻离心机，在4℃转速3000r/min下，离心9min，收集上清液，得到血浆。
b.饱和硫酸铵法粗提免疫球蛋白：
1)取血浆，加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液，边加边搅拌，使成为30％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置1.5h；
2)在4℃转速10000r/min下，离心15min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白原，得到上清液；
3)在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液，使(NH4)2SO4终浓度为50％，充分混合，静置1.5h；
4)在4℃转速10000r/min下，离心25min，得到蛋白沉淀；
5)于蛋白沉淀中加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置2h；
6)在4℃转速10000r/min下，离心15min，分别取蛋白沉淀，上清液；
7)重复步骤5)和6)2次，收集末次沉淀物即为免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除盐，-20℃保存。
c.DEAE-52阴离子交换层析纯化免疫球蛋白：
将溶解的免疫球蛋白粗提物经DEAE-52进行纯化，柱长15cm，直径1cm，盐梯度洗脱，缓冲液为pH7.2的buffer A，洗脱时NaCl浓度由0至1.0mol·L-1，洗脱流速为0.3mL·min-1，每管1.5mL，收集蛋白峰，即得。
实施例3本发明暹罗鳄血液提取物
a.将鳄鱼血进行抗凝处理，分离血浆：
取经检验合格的新鲜鳄鱼动脉血，用3.7％的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1∶9混合抗凝，静置1.5h，将抗凝血置于冷冻离心机，在6℃转速3000r/min下，离心14min，收集上清液，得到血浆。
b.饱和硫酸铵法粗提免疫球蛋白：
1)取血浆，加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液，边加边搅拌，使成为30％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于6℃下静置1h；
2)在6℃转速10000r/min下，离心25min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白原，得到上清液；
3)在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液，使(NH4)2SO4终浓度为50％，充分混合，静置1.5h；
4)在6℃转速10000r/min下，离心25min，得到蛋白沉淀；
5)于蛋白沉淀中加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置2h；
6)在6℃转速10000r/min下，离心15min，分别取蛋白沉淀，上清液；
7)重复步骤5)和6)3次，收集末次沉淀物即为免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除盐，-20℃保存。
c.DEAE-52阴离子交换层析纯化免疫球蛋白：
将溶解的免疫球蛋白粗提物经DEAE-52进行纯化，柱长15cm，直径1cm，盐梯度洗脱，缓冲液为pH7.2的buffer A，洗脱时NaCl浓度由0至1.0mol·L-1，洗脱流速为0.3mL·min-1，每管1.5mL，收集蛋白峰，即得。
实施例4本发明暹罗鳄血液提取物
a.将鳄鱼血进行抗凝处理，分离血浆：
取经检验合格的新鲜鳄鱼动脉血，用3.9％的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1∶9混合抗凝，静置1h，将抗凝血置于冷冻离心机，在8℃转速3000r/min下，离心12min，收集上清液，得到血浆。
b.饱和硫酸铵法粗提免疫球蛋白：
1)取血浆，加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液，边加边搅拌，使成为30％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于8℃下静置0.5h；
2)在8℃转速10000r/min下，离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白原，得到上清液；
3)在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液，使(NH4)2SO4终浓度为50％，充分混合，静置2h；
4)在8℃转速10000r/min下，离心20min，得到蛋白沉淀；
5)于蛋白沉淀中加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置2h；
6)在8℃转速10000r/min下，离心20min，分别取蛋白沉淀，上清液；
7)重复步骤5)和6)2次，收集末次沉淀物即为免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除盐，-20℃保存。
c.DEAE-52阴离子交换层析纯化免疫球蛋白：
将溶解的免疫球蛋白粗提物经DEAE-52进行纯化，柱长15cm，直径1cm，盐梯度洗脱，缓冲液为pH7.2的buffer A，洗脱时NaCl浓度由0至1.0mol·L-1，洗脱流速为0.3mL·min-1，每管1.5mL，收集蛋白峰，即得。
Claims (11)
1.一种暹罗鳄血液提取物，其特征在于该提取物是以新鲜鳄鱼动脉血为原料，通过如下步骤提取：
a.将鳄鱼血进行抗凝处理，分离血浆；
b.饱和硫酸铵法粗提免疫球蛋白；
c.DEAE-52阴离子交换层析纯化免疫球蛋白，即得。
2.如权利要求1所述的暹罗鳄血液提取物，其特征在于所述步骤a按如下方法操作：
取经检验合格的新鲜鳄鱼动脉血，用3.5％～4％的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1∶8～10混合抗凝，静置0.5～1.5h，将抗凝血置于冷冻离心机，在2～10℃转速3000r/min下，离心8～15min，收集上清液，得到血浆。
3.如权利要求1所述的暹罗鳄血液提取物，其特征在于所述步骤b按如下方法操作：
1)取血浆，加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液，边加边搅拌，使成为30％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置0.5～1.5h；
2)在2～10℃转速10000r/min下，离心15～25min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白原，得到上清液；
3)在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液，使(NH4)2SO4终浓度为50％，充分混合，静置1.5～2.5h；
4)在2～10℃转速10000r/min下，离心15～25min，得到蛋白沉淀；
5)于蛋白沉淀中加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置1.5～2.5h；
6)在2～10℃转速10000r/min下，离心15～25min，分别取蛋白沉淀，上清液；
7)重复步骤5)和6)2～3次，收集末次沉淀物即为免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除盐，-20℃保存。
4.如权利要求1所述的暹罗鳄血液提取物，其特征在于所述步骤c按如下方法操作：
将溶解的免疫球蛋白粗提物经DEAE-52进行纯化，柱长15cm，直径1cm，盐梯度洗脱，缓冲液为pH7.2的buffer A，洗脱时NaCl浓度由0至1.0mol·L-1，洗脱流速为0.3mL·min-1，每管1.5mL，收集蛋白峰，即得。
5.如权利要求1所述的暹罗鳄血液提取物，其特征在于该提取物是以新鲜鳄鱼动脉血为原料，通过如下步骤提取：
a.将鳄鱼血进行抗凝处理，分离血浆：
取经检验合格的新鲜鳄鱼动脉血，用3.8％的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1∶9混合抗凝，静置1h，将抗凝血置于冷冻离心机，在6℃转速3000r/min下，离心10min，收集上清液，得到血浆；
b.饱和硫酸铵法粗提免疫球蛋白：
1)取血浆，加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液，边加边搅拌，使成为30％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置1h；
2)在6℃转速10000r/min下，离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白原，得到上清液；
3)在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液，使(NH4)2SO4终浓度为50％，充分混合，静置2h；
4)在6℃转速10000r/min下，离心20min，得到蛋白沉淀；
5)于蛋白沉淀中加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置2h；
6)在6℃转速10000r/min下，离心20min，分别取蛋白沉淀，上清液；
7)重复步骤5)和6)2次，收集末次沉淀物即为免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除盐，-20℃保存；
c.DEAE-52阴离子交换层析纯化免疫球蛋白：
将溶解的免疫球蛋白粗提物经DEAE-52进行纯化，柱长15cm，直径1cm，盐梯度洗脱，缓冲液为pH7.2的buffer A，洗脱时NaCl浓度由0至1.0mol·L-1，洗脱流速为0.3mL·min-1，每管1.5mL，收集蛋白峰，即得。
6.一种暹罗鳄血液提取物的提取方法，其特征在于该方法是以新鲜鳄鱼动脉血为原料，通过如下步骤提取：
a.将鳄鱼血进行抗凝处理，分离血浆；
b.饱和硫酸铵法粗提免疫球蛋白；
c.DEAE-52阴离子交换层析纯化免疫球蛋白，即得。
7.如权利要求6所述的提取方法，其特征在于所述步骤a按如下方法操作：
取经检验合格的新鲜鳄鱼动脉血，用3.5％～4％的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1∶8～10混合抗凝，静置0.5～1.5h，将抗凝血置于冷冻离心机，在2～10℃转速3000r/min下，离心8～15min，收集上清液，得到血浆。
8.如权利要求6所述的提取方法，其特征在于所述步骤b按如下方法操作：
1)取血浆，加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液，边加边搅拌，使成为30％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置0.5～1.5h；
2)在2～10℃转速10000r/min下，离心15～25min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白原，得到上清液；
3)在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液，使(NH4)2SO4终浓度为50％，充分混合，静置1.5～2.5h；
4)在2～10℃转速10000r/min下，离心15～25min，得到蛋白沉淀；
5)于蛋白沉淀中加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置1.5～2.5h；
6)在2～10℃转速10000r/min下，离心15～25min，分别取蛋白沉淀，上清液；
7)重复步骤5)和6)2～3次，收集末次沉淀物即为免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除盐，-20℃保存。
9.如权利要求6所述的提取方法，其特征在于所述步骤c按如下方法操作：
将溶解的免疫球蛋白粗提物经DEAE-52进行纯化，柱长15cm，直径1cm，盐梯度洗脱，缓冲液为pH7.2的buffer A，洗脱时NaCl浓度由0至1.0mol·L-1，洗脱流速为0.3mL·min-1，每管1.5mL，收集蛋白峰，即得。
10.如权利要求6所述的提取方法，其特征在于是以新鲜鳄鱼动脉血为原料，通过如下步骤提取：
a.将鳄鱼血进行抗凝处理，分离血浆：
取经检验合格的新鲜鳄鱼动脉血，用3.8％的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1∶9混合抗凝，静置1h，将抗凝血置于冷冻离心机，在6℃转速3000r/min下，离心10min，收集上清液，得到血浆；
b.饱和硫酸铵法粗提免疫球蛋白：
1)取血浆，加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液，边加边搅拌，使成为30％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置1h；
2)在6℃转速10000r/min下，离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白原，得到上清液；
3)在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液，使(NH4)2SO4终浓度为50％，充分混合，静置2h；
4)在6℃转速10000r/min下，离心20min，得到蛋白沉淀；
5)于蛋白沉淀中加0.01mol/L、pH值7.0的PBS缓冲溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4℃下静置2h；
6)在6℃转速10000r/min下，离心20min，分别取蛋白沉淀，上清液；
7)重复步骤5)和6)2次，收集末次沉淀物即为免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除盐，-20℃保存；
c.DEAE-52阴离子交换层析纯化免疫球蛋白：
将溶解的免疫球蛋白粗提物经DEAE-52进行纯化，柱长15cm，直径1cm，盐梯度洗脱，缓冲液为pH7.2的buffer A，洗脱时NaCl浓度由0至1.0mol·L-1，洗脱流速为0.3mL·min-1，每管1.5mL，收集蛋白峰，即得。
11.如权利要求1-5所述任意一种暹罗鳄血液提取物在制备治疗艾滋病或甲型H1N1流感药物中的应用。
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