CN104231065A - 兔血中球蛋白的纯化制备方法 - Google Patents
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Abstract
发明公开了一种兔血中球蛋白的纯化制备方法,主要包括如下工艺步骤:(1)兔血前处理;(2)滤出液脱盐;(3)兔血球蛋白的分离;(4)层析;(5)超滤。该方法操作简单,提取的球蛋白纯度高,所得兔血中球蛋白的纯度为98%。
Description
技术领域
本发明属于生物蛋白技术领域,具体涉及兔血中球蛋白的纯化制备方法。
背景技术
兔血含有很高的营养价值,可加工成多种产品,供食用、药用,或作为畜禽的动物性饲料。兔血可提取多种生物药物和生化试剂,如医用血清、血清抗原、凝血酶、亮氨酸、蛋白胨等,兔血医用价值高,但目前兔血提取技术仅限于实验室应用,无法达到纯化提取,且不能产业化提取和生产,对兔血的应用存在一定的局限性。球蛋白可有效提高人或机体的免疫力,具有极高的医学应用价值,现在主要是硫酸铵沉淀法,然后反透析提取,提取率及纯度都不高,本发明应用DEAE柱层析系统,提高了兔血球蛋白提取的纯度与产率。
发明内容
为了克服现有技术存在的技术缺陷,本发明提供一种兔血中球蛋白的纯化制备方法,该方法操作简单,提取的球蛋白纯度高。
兔血中球蛋白的纯化制备方法,主要包括如下工艺步骤:
(1) 兔血前处理
a. 将50L新鲜兔血按16:1的比例加入4.0%的枸橼酸钠(柠檬酸钠)溶液中,并搅匀;
b. 连续流离心机离心,离心力约为400g,离心上清为血浆,沉淀物为血球等细胞,收集上清;
c. 将收集的上清通过深层滤器,收集滤出液;
(2) 滤出液脱盐
采用G25脱盐层析,将20L的滤出液通过上样管路上样,待上样完成后切至进液管路,当紫外检测器检测到蛋白流出时,切换至收集管路,直至紫外检测器信号值为其峰值的1/10,切换至废液,直至紫外检测器信号为平,重复上样;
(3) 兔血球蛋白的分离
a. 冷沉淀:将G25脱盐柱的收集液置于4℃的环境中过夜,其会析出大量的沉淀物,该沉淀物即为兔凝血酶原和其他蛋白质的混合物;
b. 离心:将冷沉淀的溶液在4℃的条件下,离心约30min,收集上清液;
(4) 层析
a. 将步骤(3)中收集的上清液通过上样管路上样,待上样完成后切至进液管路,收集穿透液。
所述层析柱为450*200,填料为DEAE 6FF,装填高度为15cm,约需要22L填料,Buffer A:15mM HAc-NaAc,pH为 5.2;Buffer B:25mM NaAc ,pH为 4.5。
b. 将a中收集的穿透液用稀NaOH调节pH至7.0,通过上样管路上样,待上样完成后切至进液管路,收集二次穿透液。
所述层析柱为450*200,填料为DEAE 6FF,装填高度为15cm,约需要22L填料,Buffer A:15mM PB,pH 为7.0;Buffer B:Buffer A +500mM NaCl
(5) 超滤
将进液口放入兔血球蛋白洗脱液中,待兔血球蛋白洗脱液体积约为之前的1/10时,关闭超滤系统,并尽量将进液管路和回流管路中的兔血球蛋白洗脱液收集。
将膜包用0.1M NaOH冲洗30min后用水冲洗直至pH约为7,将膜包取出,置于保存液中。
通过本发明工艺步骤所得兔血中球蛋白的纯度为98%。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明进行详细的描述。
兔血中球蛋白的纯化制备方法,主要包括如下工艺步骤:
(1) 兔血前处理
a. 将50L新鲜兔血按16:1的比例加入4.0%的枸橼酸钠(柠檬酸钠)溶液中,并搅匀;
b. 连续流离心机离心,离心力约为400g,离心上清为血浆,沉淀物为血球等细胞,收集上清;
c. 将收集的上清通过深层滤器,收集滤出液;
(2) 滤出液脱盐
采用G25脱盐层析,将20L的滤出液通过上样管路上样,待上样完成后切至进液管路,当紫外检测器检测到蛋白流出时,切换至收集管路,直至紫外检测器信号值为其峰值的1/10,切换至废液,直至紫外检测器信号为平,重复上样;
(3) 兔血球蛋白的分离
a. 冷沉淀:将G25脱盐柱的收集液置于4℃的环境中过夜,其会析出大量的沉淀物,该沉淀物即为兔凝血酶原和其他蛋白质的混合物;
b. 离心:将冷沉淀的溶液在4℃的条件下,离心约30min,收集上清液;
(4) 层析
a. 将步骤(3)中收集的上清液通过上样管路上样,待上样完成后切至进液管路,收集穿透液。
所述层析柱为450*200,填料为DEAE 6FF,装填高度为15cm,约需要22L填料。Buffer A:15mM HAc-NaAc,pH为 5.2;Buffer B:25mM NaAc ,pH为 4.5。
b. 将a中收集的穿透液用稀NaOH调节pH至7.0,通过上样管路上样,待上样完成后切至进液管路,收集二次穿透液。
所述层析柱为450*200,填料为DEAE 6FF,装填高度为15cm,约需要22L填料。Buffer A:15mM PB,pH 为7.0;Buffer B:Buffer A +500mM NaCl
(5) 超滤
将进液口放入兔血球蛋白洗脱液中,待兔血球蛋白洗脱液体积约为之前的1/10时,关闭超滤系统,并尽量将进液管路和回流管路中的兔血球蛋白洗脱液收集。
将膜包用0.1M NaOH冲洗30min后用水冲洗直至pH约为7,将膜包取出,置于保存液中。
此外,本发明并不局限于上述实施方式,基于相同手段所达到的技术效果,都属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.兔血中球蛋白的纯化制备方法,其特征在于:主要包括如下工艺步骤:
(1) 兔血前处理
a. 将50L新鲜兔血按16:1的比例加入4.0%的枸橼酸钠(柠檬酸钠)溶液中,并搅匀;
b. 连续流离心机离心,离心力约为400g,离心上清为血浆,沉淀物为血球等细胞,收集上清;
c. 将收集的上清通过深层滤器,收集滤出液;
(2) 滤出液脱盐
采用G25脱盐层析,将20L的滤出液通过上样管路上样,待上样完成后切至进液管路,当紫外检测器检测到蛋白流出时,切换至收集管路,直至紫外检测器信号值为其峰值的1/10,切换至废液,直至紫外检测器信号为平,重复上样;
(3) 兔血球蛋白的分离
a. 冷沉淀:将G25脱盐柱的收集液置于4℃的环境中过夜,其会析出大量的沉淀物,该沉淀物即为兔凝血酶原和其他蛋白质的混合物;
b. 离心:将冷沉淀的溶液在4℃的条件下,离心约30min,收集上清液;
(4) 层析
a. 将步骤(3)中收集的上清液通过上样管路上样,待上样完成后切至进液管路,收集穿透液;
所述层析柱为450*200,填料为DEAE 6FF,装填高度为15cm,约需要22L填料,Buffer A:15mM HAc-NaAc,pH为5.2;Buffer B:25mM NaAc ,pH为 4.5;
b. 将a中收集的穿透液用稀NaOH调节pH至7.0,通过上样管路上样,待上样完成后切至进液管路,收集二次穿透液;
所述层析柱为450*200,填料为DEAE 6FF,装填高度为15cm,约需要22L填料,Buffer A:15mM PB,pH 为7.0;Buffer B:Buffer A +500mM NaCl
(5) 超滤
将进液口放入兔血球蛋白洗脱液中,待兔血球蛋白洗脱液体积约为之前的1/10时,关闭超滤系统,并尽量将进液管路和回流管路中的兔血球蛋白洗脱液收集;
将膜包用0.1M NaOH冲洗30min后用水冲洗直至pH约为7,将膜包取出,置于保存液中。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107136304A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-09-08 | 青岛康大食品有限公司 | 一种添加兔血球蛋白的宠物食品及其制备方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1419566A (zh) * | 2000-03-30 | 2003-05-21 | 阿默森生物科学有限公司 | 生产lgG的方法 |
CN102268090A (zh) * | 2011-07-13 | 2011-12-07 | 北京洪源澳达生物技术发展有限公司 | 一种暹罗鳄血液提取物及其提取方法和用途 |
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赵彦鼎: "层析工艺在血浆蛋白纯化中的应用", 《WWW.DOCIN.COM/P-656360767》 * |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN107136304A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-09-08 | 青岛康大食品有限公司 | 一种添加兔血球蛋白的宠物食品及其制备方法 |
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