CN103497248A - 一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法。本发明提供的第一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法,依次包括如下步骤:(1)取可以分泌抗体的细胞的细胞培养上清;(2)进行亲和层析;(3)进行阳离子交换层析;(4)进行阴离子交换层析。其特征在于:每个层析步骤后不进行缓冲液的置换,直接进行下一个层析步骤。本发明提供的方法具有步骤简化、提取纯度高,杂质含量低、抗体收率高等优点,对于实现抗体纯化的规模性生产具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法。
背景技术
治疗性抗体药物对其纯度有极高的要求,以保证其经注射手段对病患给药的安全性。对生物制药生产行业来说,以工业规模提纯药用级抗体的具有重大的经济效益。
抗体的纯化工艺一般来说是采用数个过滤及层析柱分离步骤,从细胞、不溶性物质和其它可溶的生化物质的混合物中分离所需的抗体。如深层过滤工艺可以高效经济地移除细胞、碎片或不溶性物质,经滤清处理的培养上清经过亲和层析及其他层析可以提纯得到抗体。
蛋白A基质的亲和层析常用于第一个纯化工艺步骤(从培养上清液选择性分离出所需抗体),然后进行离子交换层析(用来进一步精纯亲和层析所得的抗体,进一步移除残留的微量杂质,如宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA及亲和层析柱的析出物)。就一般工艺而言,亲和层析及离子交换层析都需要不同的操作条件。此外,采用高盐缓冲液洗脱离子交换层析柱会将其它杂质随同抗体一同洗脱,这还经常涉及到耗时的缓冲液置换,使得工艺流程时耗过长并导致产品流失。
发明内容
本发明的目的是提供一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法。
本发明提供的第一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法,依次包括如下步骤:
(1)取可以分泌抗体的细胞的细胞培养上清;
(2)进行亲和层析;
(3)进行阳离子交换层析;
(4)进行阴离子交换层析;
其特征在于:每个层析步骤后不进行缓冲液的置换,直接进行下一个层析步骤。
所述步骤(1)和所述步骤(2)之间还包括过滤收集滤液的步骤。所述过滤收集滤液的具体方法为:先用孔径为0.6-9μm的深层过滤器过滤并收集滤液,然后用孔径为0.1μm以下(孔径需确保目的抗体可以穿过)的过滤器过滤并收集滤液。如果滤液中的抗体浓度低于3mg/mL,可用30kDa的超滤膜进行渗滤浓缩。本步骤可以得到抗体浓度为3-10mg/mL、pH6.5-7.5、浊度低于10NTU的溶液。
所述亲和层析中,采用蛋白A亲和层析基质,用pH3.1-3.3的醋酸盐缓冲液洗脱以收集目标抗体。所述亲和层析中,柱床高度为15cm以上(如15-30cm)。所述亲和层析过程中,流速可为30-180cm/h。所述亲和层析过程中,上样后,可先用5倍以上柱床体积(如5-10倍柱床体积)的洗涤液(溶剂为水,含有20mM醋酸钠和150mM氯化钠;pH5.3-5.5)洗涤以去除杂质,然后用3倍以上柱床体积(如3-10倍柱床体积)的pH3.1-3.3的醋酸盐缓冲液(具体可为100mM醋酸盐缓冲液,所述醋酸盐缓冲液可为醋酸钠缓冲液或醋酸钾缓冲液)洗脱以收集目标抗体,在线监测OD280,收集抗体峰(即0.025AU以上的部分),得到过柱后溶液。本步骤可以得到pH3.2-3.8,抗体浓度不超过20mg/mL的过柱后溶液。
所述步骤(2)和所述步骤(3)之间还包括对亲和层析收集的过柱后溶液调pH的步骤。具体可采用120-140mM醋酸盐水溶液(所述醋酸盐水溶液具体可为醋酸钠水溶液或醋酸钾水溶液)调节pH至5.0-5.2。在调pH前,可先将亲和层析收集的过柱后溶液室温(20-25℃)孵育60分钟以灭活病毒。在调pH后,可用0.22μm过滤器过滤并收集滤液。本步骤可以得到电导率为7-8mS/cm,抗体浓度为2-5mg/mL的溶液。
所述阳离子交换层析中,采用SP-Sepharose Fast Flow基质,用pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液洗脱以收集目标抗体。所述阳离子交换层析中,柱床高度为10cm以上(如10-30cm)。所述阳离子交换层析过程中,流速可为30-180cm/h。所述阳离子交换层析过程中,上样后,可先用5倍以上柱床体积(如5-10倍柱床体积)的pH5.5-5.7、60-80mM醋酸盐缓冲液(所述醋酸盐缓冲液可为醋酸钠缓冲液或醋酸钾缓冲液)洗涤以去除杂质,然后用5倍以上柱床体积(如5-10倍柱床体积)的pH7.4-7.6、30-50mM磷酸盐缓冲液(所述磷酸盐缓冲液可为磷酸钠盐缓冲液或磷酸钾盐缓冲液)洗脱以收集目标抗体,在线监测OD280,收集抗体峰(即0.025AU以上的部分),得到过柱后溶液。本步骤可以得到pH7.3-7.7,抗体浓度20mg/ml以下的过柱后溶液。
所述阴离子交换层析中,采用Q-Sepharose Fast Flow基质,用pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液冲顶以收集目标抗体。所述阴离子交换层析中,柱床高度为10cm以上(如10-20cm)。所述阴离子交换层析过程中,流速可为30-180cm/h。所述阴离子交换层析过程中,上样后,用pH7.4-7.6、30-50mM磷酸盐缓冲液(所述磷酸盐缓冲液为磷酸钠盐缓冲液或磷酸钾盐缓冲液)洗涤,在线监测OD280,收集OD280高于0.025AU的峰,得到过柱后溶液。本步骤可得到pH7.3-7.7,抗体浓度为20mg/mL以下的过柱后溶液。所述阴离子交换层析中,将阳离子交换层析得到的过柱后溶液上样到阴离子交换层析柱,上样时目的抗体不会吸附到基质上,反而是让杂质吸附到基质上,因此上样时同时需监测OD280,收集流过柱子的抗体液,即OD280高于0.025AU的峰对应的过柱后溶液。
所述步骤(4)以后,还包括将阴离子交换层析收集的过柱后溶液用纳米膜过滤并收集滤液的步骤。
所述“可以分泌抗体的细胞的细胞培养上清”的制备方法具体如下:1、将可以分泌抗体的细胞35-37℃,溶氧30-60%,pH6.5-7.5培养10-15天。
本发明提供的第二种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法,依次包括如下步骤:
①取可以分泌抗体的细胞的细胞培养上清;
②进行亲和层析;
③进行链合离子交换层析;所述链合离子交换层析由阳离子交换层析和阴离子交换层析组成,阳离子交换层析的出样口与阴离子交换层析的上样口连通。
所述步骤①和所述步骤②之间还包括过滤收集滤液的步骤。所述过滤收集滤液的具体方法为:先用孔径为0.6-9μm的深层过滤器过滤并收集滤液,然后用孔径为0.1μm以下(孔径需确保目的抗体可以穿过)的过滤器过滤并收集滤液。如果滤液中的抗体浓度低于3mg/mL,可用30kDa的超滤膜进行渗滤浓缩。本步骤可以得到抗体浓度为3-10mg/mL、pH6.5-7.5、浊度低于10NTU的溶液。
所述亲和层析中,采用蛋白A亲和层析基质,用pH3.1-3.3的醋酸盐缓冲液洗脱以收集目标抗体。所述亲和层析中,柱床高度为15cm以上(如15-30cm)。所述亲和层析过程中,流速可为30-180cm/h。所述亲和层析过程中,上样后,可先用5倍以上柱床体积(如5-10倍柱床体积)的洗涤液(溶剂为水,含有20mM醋酸钠和150mM氯化钠;pH5.3-5.5)洗涤以去除杂质,然后用3倍以上柱床体积(如3-10倍柱床体积)的pH3.1-3.3的醋酸盐缓冲液(具体可为100mM醋酸盐缓冲液,所述醋酸盐缓冲液可为醋酸钠缓冲液或醋酸钾缓冲液)洗脱以收集目标抗体,在线监测OD280,收集抗体峰(即0.025AU以上的部分),得到过柱后溶液。本步骤可以得到pH3.2-3.8,抗体浓度不超过20mg/mL的过柱后溶液。
所述步骤②和所述步骤③之间,还包括对亲和层析收集的过柱后溶液调pH的步骤。具体可采用120-140mM醋酸盐水溶液(所述醋酸盐水溶液具体可为醋酸钠水溶液或醋酸钾水溶液)调节pH至5.0-5.2。在调pH前,可先将亲和层析收集的过柱后溶液室温孵育60分钟以灭活病毒。在调pH后,可用0.22μm过滤器过滤并收集滤液。本步骤可以得到电导率为7-8mS/cm,抗体浓度为2-5mg/mL的溶液。
所述链合离子交换层析中,阳离子交换层析采用SP-Sepharose Fast Flow基质,阴离子交换层析采用Q-Sepharose Fast Flow基质,用pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液洗脱冲顶以收集目标抗体。所述阳离子交换层析中,柱床高度为10cm以上(如10-30cm)。所述阴离子交换层析中,柱床高度为10cm以上(如10-20cm)。所述链合离子交换层析过程中,流速可为30-180cm/h。所述链合离子交换层析过程中,上样后,可先用5倍以上柱床体积(如5-10倍柱床体积)的pH5.5-5.7、60-80mM醋酸盐缓冲液(所述醋酸盐缓冲液可为醋酸钠缓冲液或醋酸钾缓冲液)洗涤以去除杂质,然后用5倍以上柱床体积(如5-10倍柱床体积)的pH7.4-7.6、30-50mM磷酸盐缓冲液(所述磷酸盐缓冲液可为磷酸钠盐缓冲液或磷酸钾盐缓冲液)洗脱以收集目标抗体,在线监测OD280,收集抗体峰(即0.025AU以上的部分),得到过柱后溶液。本步骤可得到pH7.3-7.7,抗体浓度为20mg/mL以下的过柱后溶液。
所述步骤③以后,还包括将链合离子交换层析收集的过柱后溶液用纳米膜过滤并收集滤液的步骤。
所述“可以分泌抗体的细胞的细胞培养上清”的制备方法具体如下:1、将可以分泌抗体的细胞35-37℃,溶氧30-60%,pH6.5-7.5培养10-15天。
以上任一所述方法中,所述抗体具体可为单克隆抗体。以上任一所述方法中,所述抗体可为人源化抗体或人-鼠嵌合抗体。以上任一所述方法中,所述可以分泌抗体的细胞为将抗体的编码基因导入出发细胞得到的重组细胞。具体可为将抗人肿瘤坏死因子-α(tumor necroesis factor-α,TNF-α)抗体的编码基因导入Sp2/0Ag14细胞得到的重组细胞或将抗人表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)抗体的编码基因导入Sp2/0Ag14细胞得到的重组细胞。
本发明涉及蛋白纯化工艺。具体来说,本发明涉及从至少包含一种杂质的哺乳动物细胞培养上清或细胞提取物所衍生的液体中提纯抗体的方法。这一方法包含从其它杂质中初步分离抗体及通过生物分离技术高效再生抗体,包括且不限于以下分离手法:亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、微滤、超滤、纳米过滤、低pH孵放等。这一纯化方法采用优选的操作条件,包括且不限于pH、离子强度、抗体浓度、流速等,用以免除耗时的工业生产步骤,如缓冲液置换、脱盐、分子排阻层析等。本发明提供的方法具有步骤简化、提纯度高、杂质含量低、抗体收率高等优点,对于实现抗体的规模性生产,特别是单克隆抗体的纯化,具有重大价值。
附图说明
图1为实施例1中亲和层析的洗脱曲线。
图2为实施例1中阳离子交换层析的洗脱曲线。
图3为实施例1中阴离子交换层析的洗脱曲线。
图4为实施例1中表征抗体纯度的色谱图。
图5为实施例3中表征抗体纯度的色谱图。
图6为实施例5中链合离子交换层析的洗脱曲线。
图7为实施例5中表征抗体纯度的色谱图。
图8为各实施例纯化得到的抗体的SDS-PAGE图谱:泳道1–实施例1纯化得到的抗人TNF-α单抗,泳道2-实施例2纯化得到的抗人TNF-α单抗,泳道3–标准分子量对照,泳道4-实施例5纯化得到的抗人TNF-α单抗,泳道5-实施例6纯化得到的抗人TNF-α单抗,泳道6-实施例3纯化得到的抗人EGFR单抗,泳道7-实施例4纯化得到的抗人EGFR单抗。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。Sp2/0Ag14细胞购自ATCC(细胞编号CRL-1581)。
抗体纯度用高效液相分子排阻色谱法和还原SDS-PAGE检测,目标峰或条带身份根据商购分子量标准品确定。将100μg抗体(1mg/mL,100μL)上样到高效液相排阻色谱柱(Waters,目录号#WAT080013),以高效液相层析系统用流速0.5mL/min进行分离60分钟,分子量标准确品购自BioRad公司,目录号#151-1901。还原SDS-PAGE以常规方法用12%凝胶进行电泳,分子量标准确品购自Life Technologies,目录号#LC5925。宿主细胞蛋白的残留量和蛋白A的残留量使用ELISA试剂盒(SP2/0HCPELISA kit,Cygnus Technologies,US,目录号#F180;Protein A ELISA kit,CygnusTechnologies,US,目录号#F400)并按试剂盒说明书进行检测。
亲和层析的抗体回收率(%)=(亲和层析后得到的过柱后溶液中的抗体量[单位mg]÷用于亲和层析上样的溶液中的抗体量[单位mg])×100%。
阳离子交换层析的抗体回收率(%)=(阳离子交换层析后得到的过柱后溶液中的抗体量[单位mg]÷用于阳离子交换层析上样的溶液中的抗体量[单位mg])×100%。
阴离子交换层析的抗体回收率(%)=(阴离子交换层析后得到的过柱后溶液中的抗体量[单位mg]÷用于阴离子交换层析上样的溶液中的抗体量[单位mg])×100%。
链合离子交换层析的抗体回收率(%)=(阴离子交换层析后得到的过柱后溶液中的抗体量[单位mg]÷用于阳离子交换层析上样的溶液中的抗体量[单位mg])×100%。
将抗人TNF-α单抗的重链VH可变区DNA序列(US Patent no.7,070,775B2)插入载体pEgamma1(专利号CN1958615A)的HindIII和BamHI识别位点间,得到抗人TNF-α单抗重链的表达载体pEgamma1-TNF;将抗人TNF-α单抗的轻链VK可变区DNA序列(US Patentno.7,070,775B2)插入载体pEkappa(专利号CN1958615A)的HindIII和BamHI识别位点之间,得到抗人TNF-α单抗轻链的表达载体pEkappa-TNF。将10μg被BstXI限制性内切核酸酶线性化的pEkappa-TNF及30μg被PvuI限制性内切核酸酶线性化的pEgamma1-TNF,用电穿孔法(electroporation)去转染小鼠骨髓瘤Sp2/0Ag14细胞,得到分泌抗人TNF-α单抗的重组细胞。
将抗人EGFR单抗的重链VH可变区DNA序列(US Patent No.6,217,866B1)插入载体pEgamma1(专利号CN1958615A)的HindIII和BamHI识别位点间,得到抗人EGFR单抗重链的表达载体pEgamma1-EGFR;将抗人EGFR单抗的轻链VK可变区DNA序列(US PatentNo.6,217,866B1)插入载体pEkappa(专利号CN1958615A)的HindIII和BamHI识别位点之间,得到抗人EGFR单抗轻链的表达载体pEkappa-EGFR。将10μg被BstXI限制性内切核酸酶线性化的pEkappa-EGFR及30μg被PvuI限制性内切核酸酶线性化的pEgamma1-EGFR,用电穿孔法去转染小鼠骨髓瘤Sp2/0Ag14细胞,得到分泌抗人EGFR单抗的重组细胞。
实施例1和实施例2、分离纯化抗人TNF-α单抗
实施例1和实施例2描述了运用本发明提供的方法分离纯化抗人TNF-α单抗的工艺流程。抗人TNF-α单抗是指其可变区能够特异性吸附到人TNF-α的单克隆抗体。本实施例中从分泌抗人TNF-α单抗的重组细胞的培养上清中分离纯化抗人TNF-α单抗。
1、将分泌抗人TNF-α单抗的重组细胞在35-37℃(实施例1采用35℃、实施例2采用37℃),溶氧30-60%(实施例1采用溶氧30%,实施例2采用溶氧60%),pH6.5-7.5(实施例1采用pH6.5,实施例2采用pH7.5)培养10-15天(实施例1采用10天,实施例2采用15天)。
2、取完成步骤1的整个培养体系,先用孔径为0.6-9μm的深层过滤器过滤并收集滤液(本步骤的目的为:去除细胞、细胞碎片及不溶性物质),然后用孔径为0.1μm以下(实施例1和实施例2均采用0.1μm以下)的深层过滤器过滤并收集滤液(本步骤的目的为:去除微细颗粒)。通常深层过滤器过滤收集的滤液中的抗体浓度低于3mg/mL,需要用30kDa的超滤膜进行渗滤浓缩,收集不能通过超滤膜的液体,即为抗体浓度为3-10mg/mL的溶液(pH一般在6.5-7.5之间、浊度低于10NTU)。如果深层过滤器过滤收集的滤液中的抗体浓度已经为3mg/mL以上,则无需进行渗滤浓缩的步骤,该滤液即为抗体浓度为3-10mg/mL的溶液(pH6.5-7.5、浊度低于10NTU)。保存滤液于4℃。
3、取步骤2得到的溶液,恢复至室温(20-25℃)后采用蛋白A亲和层析基质(Ultra Plus,Merck Millipore,目录号#175118827)进行亲和层析。柱床高度为15cm以上(实施例1采用15cm,实施例2采用30cm)。亲和层析过程(流速为30-180cm/h,实施例1采用30cm/h,实施例2采用180cm/h):先用120mM磷酸水溶液洗涤柱子30分钟以上以去除热源,然后用平衡液(溶剂为水,含有20mM磷酸钠和150mM氯化钠;pH7.0)平衡柱子,然后将步骤2得到的溶液上样(以每升基质对应50克以下抗体的载量上样,以保证抗体均可以吸附到基质上),然后用5倍以上柱床体积(实施例1采用5倍柱床体积,实施例2采用10倍柱床体积)的洗涤液(溶剂为水,含有20mM醋酸钠和150mM氯化钠;pH5.3-5.5;实施例1采用pH5.3,实施例2采用pH5.5)洗涤以去除杂质,然后用3倍以上柱床体积(实施例1采用3倍柱床体积,实施例2采用10倍柱床体积)的醋酸盐缓冲液(pH3.1-3.3的100mM醋酸盐缓冲液;实施例1采用pH3.1的100mM醋酸钠缓冲液,实施例2采用pH3.3、100mM醋酸钾缓冲液)洗脱以收集抗体,在线监测OD280,收集抗体峰(即0.025AU以上的部分,实施例1的洗脱曲线见图1),得到过柱后溶液(过柱后溶液的pH一般在3.2-3.8之间,抗体浓度一般不超过20mg/mL)。
4、将步骤3得到的溶液室温(20-25℃)孵育60分钟以灭活病毒,然后用120-140mM醋酸盐水溶液(实施例1采用120mM醋酸钠水溶液,实施例2采用140mM醋酸钾水溶液)调节pH至5.0-5.2(实施例1采用pH5.0,实施例2采用pH5.2)(滴加速度每分钟不超过起始液体积的1/20),然后用0.22μm过滤器过滤并收集滤液。得到的滤液电导率一般为7-8mS/cm,抗体浓度为2-5mg/mL,保存于4℃。
5、取步骤4得到的滤液,恢复至室温(20-25℃)后,采用GE Healthcare公司的SP-Sepharose Fast Flow基质(目录号#17-0729)进行阳离子交换层析。柱床高度为10cm以上(实施例1采用10cm,实施例2采用30cm)。阳离子交换层析过程(流速为30-180cm/h,实施例1采用30cm/h,实施例2采用180cm/h):先用0.1M氢氧化钠水溶液洗涤柱子30分钟以上以去除热源,然后用pH5.0-5.2、40-50mM醋酸盐缓冲液(实施例1采用pH5.0、40mM的醋酸钠缓冲液,实施例2采用pH5.2、50mM的醋酸钾缓冲液)平衡柱子,然后上样步骤4得到的滤液(以每升基质对应40克以下抗体的载量上样,以保证抗体均可以吸附到基质上),然后用5倍以上柱床体积(实施例1采用5倍柱床体积,实施例2采用10倍柱床体积)的pH5.5-5.7、60-80mM醋酸盐缓冲液(实施例1采用pH5.5、60mM的醋酸钠缓冲液,实施例2采用pH5.7、80mM的醋酸钾缓冲液)洗涤以去除杂质,然后用5倍以上柱床体积(实施例1采用5倍柱床体积,实施例2采用10倍柱床体积)的pH7.4-7.6、30-50mM磷酸盐缓冲液(实施例1采用pH7.4、30mM的磷酸钠盐缓冲液,实施例2采用pH7.6、50mM的磷酸钾盐缓冲液)洗脱以收集抗体,在线监测OD280,收集抗体峰(即0.025AU以上的部分,实施例1的洗脱曲线见图2),得到过柱后溶液(过柱后溶液的pH一般在7.3-7.7之间,抗体浓度为10mg/mL以下),保存于4℃。
6、取步骤5得到的过柱后溶液,恢复至室温(20-25℃)后,采用GE Healthcare公司的Q-Sepharose Fast Flow基质(目录号#17-0510)进行阴离子交换层析。柱床高度为10cm以上(实施例1采用10cm,实施例2采用20cm)。阴离子交换层析过程(流速为30-180cm/h,实施例1采用30cm/h,实施例2采用180cm/h):先用0.1M氢氧化钠水溶液洗涤柱子30分钟以上以去除热源,然后用pH7.4-7.6、30-50mM磷酸盐缓冲液(实施例1采用pH7.4、30mM的磷酸钠盐缓冲液,实施例2采用pH7.6、50mM的磷酸钾盐缓冲液)平衡柱子,然后上样步骤5得到的溶液(以每升基质对应3000克以下抗体的载量上样,以保证杂质能充分地吸附到基质上),然后用pH7.4-7.6、30-50mM磷酸盐缓冲液(实施例1采用pH7.4、30mM的磷酸钠盐缓冲液,实施例2采用pH7.6、50mM的磷酸钾盐缓冲液)顶出残留柱内的抗体液,在线监测OD280,收集OD280高于0.025AU的过柱后溶液(实施例1中的洗脱曲线见图3)。过柱后溶液的pH一般在7.3-7.7之间,抗体浓度为10mg/mL以下,保存于4℃。
实施例1中,亲和层析的抗体回收率、阳离子交换层析的抗体回收率和阴离子交换层析的抗体回收率均大于90%,步骤7得到的滤液中的抗体纯度为99.54%(色谱图见图4,以峰面积计算抗体纯度,即目标峰面积相对于所有峰面积总和的百分比),宿主细胞蛋白的残留量为0.006%,蛋白A的残留量为0.00008%。
实施例2中,亲和层析的抗体回收率、阳离子交换层析的抗体回收率和阴离子交换层析的抗体回收率均大于90%,步骤7得到的滤液中的抗体纯度为高于99.5%,宿主细胞蛋白的残留量低于0.01%,蛋白A的残留量低于0.01%。
实施例3和实施例4、分离纯化抗人EGFR单抗
实施例3和实施例4描述了运用本发明提供的方法分离纯化抗人EGFR单抗的工艺流程。抗人EGFR单抗是指其可变区能够特异性吸附到人EGFR的单克隆抗体。本实施例中从分泌抗人EGFR单抗的重组细胞的培养上清中分离纯化抗人EGFR单抗。
1、用分泌抗人EGFR单抗的重组细胞代替分泌抗人TNF-α单抗的重组细胞,其它实施例3的步骤1同实施例1的步骤1,其它实施例4的步骤1同实施例2的步骤1。
2、实施例3的步骤2同实施例1的步骤2,实施例4的步骤2同实施例2的步骤2。
3、实施例3的步骤3同实施例1的步骤3,实施例4的步骤3同实施例2的步骤3。
4、实施例3的步骤4同实施例1的步骤4,实施例4的步骤4同实施例2的步骤4。
5、实施例3的步骤5同实施例1的步骤5,实施例4的步骤5同实施例2的步骤5,得到的抗体溶液浓度为20mg/mL以下。
6、实施例3的步骤6同实施例1的步骤6,实施例4的步骤6同实施例2的步骤6,得到的抗体溶液浓度为20mg/mL以下。
7、实施例3的步骤7同实施例1的步骤7,实施例4的步骤7同实施例2的步骤7。
实施例3中,亲和层析的抗体回收率、阳离子交换层析的抗体回收率和阴离子交换层析的抗体回收率均大于90%,步骤7得到的滤液中的抗体纯度为99.83%(色谱图见图5),宿主细胞蛋白的残留量为0.096%,蛋白A的残留量为0.0005%。
实施例4中,亲和层析的抗体回收率、阳离子交换层析的抗体回收率和阴离子交换层析的抗体回收率均大于90%,步骤7得到的滤液中的抗体纯度高于99.5%,宿主细胞蛋白的残留量低于0.1%,蛋白A的残留量低于0.01%。
实施例5和实施例6、分离纯化抗人TNF-α单抗
1、实施例5的步骤1同实施例1的步骤1,实施例6的步骤1同实施例2的步骤1。
2、实施例5的步骤2同实施例1的步骤2,实施例6的步骤2同实施例2的步骤2。
3、实施例5的步骤3同实施例1的步骤3,实施例6的步骤3同实施例2的步骤3。
4、实施例5的步骤4同实施例1的步骤4,实施例6的步骤4同实施例2的步骤4。
5、链合离子交换层析
取步骤4得到的滤液,恢复至室温(20-25℃)后,采用GE Healthcare公司的SP-Sepharose Fast Flow基质进行阳离子交换层析(柱床高度为10cm以上,实施例5采用10cm,实施例6采用30cm),紧接着采用GE Healthcare公司的Q-Sepharose FastFlow基质进行阴离子交换层析(柱床高度为10cm以上,实施例5采用10cm,实施例6采用20cm),阳离子交换层析柱的出样口与阴离子交换层析柱的上样口连通。链合离子交换层析过程(流速为30-180cm/h,实施例5采用30cm/h,实施例6采用180cm/h):先用0.1M氢氧化钠水溶液洗涤柱子30分钟以上以去除热源,然后用pH5.0-5.2、40-50mM醋酸盐缓冲液(实施例5采用pH5.0、40mM的醋酸钠缓冲液,实施例6采用pH5.2、50mM的醋酸钾缓冲液)平衡柱子,然后上样步骤4得到的滤液(上样量依实施例1步骤5阳离子层析的上样量),然后用5倍以上柱床体积(实施例5采用5倍柱床体积,实施例6采用10倍柱床体积)的pH5.5-5.7、60-80mM醋酸盐缓冲液(实施例5采用pH5.5、60mM的醋酸钠缓冲液,实施例6采用pH5.7、80mM的醋酸钾缓冲液)洗涤以去除杂质,然后用5倍以上柱床体积(实施例5采用5倍柱床体积,实施例6采用10倍柱床体积)的pH7.4-7.6、30-50mM磷酸盐缓冲液(实施例5采用pH7.4、30mM的磷酸钠盐缓冲液,实施例6采用pH7.6、50mM的磷酸钾盐缓冲液)洗脱以收集抗体,在线监测OD280,收集OD280高于0.025AU的过柱后溶液(实施例5的洗脱曲线见图6)。过柱后溶液的pH一般在7.3-7.7之间,抗体浓度为10mg/mL以下,保存于4℃。
实施例5中,亲和层析的抗体回收率、链合离子交换层析的抗体回收率均大于90%,步骤6得到的滤液中的抗体纯度为100%(色谱图见图7),宿主细胞蛋白的残留量为0.009%,蛋白A的残留量为0.0001%。
实施例6中,亲和层析的抗体回收率、链合离子交换层析的抗体回收率均大于90%,步骤6得到的滤液中的抗体纯度高于99.5%,宿主细胞蛋白的残留量低于0.01%,蛋白A的残留量低于0.01%。
实施例1纯化得到的抗人TNF-α单抗、实施例2纯化得到的抗人TNF-α单抗、实施例5纯化得到的抗人TNF-α单抗、实施例6纯化得到的抗人TNF-α单抗、实施例3纯化得到的抗人EGFR单抗、实施例4纯化得到的抗人EGFR单抗的SDS-PAGE图谱见图8。抗体经还原后,由双硫键链接的抗体轻链及重链分开了,所以每个泳道均显示两条带。
Claims (8)
1.一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法,依次包括如下步骤:
(1)取可以分泌抗体的细胞的细胞培养上清;
(2)进行亲和层析;
(3)进行阳离子交换层析;
(4)进行阴离子交换层析;
其特征在于:每个层析步骤后不进行缓冲液的置换,直接进行下一个层析步骤。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(1)和所述步骤(2)之间还包括过滤收集滤液的步骤。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述亲和层析中,采用蛋白A亲和层析基质,用pH3.1-3.3的醋酸盐缓冲液洗脱以收集目标抗体。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法,其特征在于:所述步骤(2)和所述步骤(3)之间,还包括对亲和层析收集的过柱后溶液调pH的步骤。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法,其特征在于:所述阳离子交换层析中,采用SP-Sepharose Fast Flow基质,用30-50mM、pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液洗脱以收集目标抗体。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法,其特征在于:所述阴离子交换层析中,采用Q-Sepharose Fast Flow基质,用30-50mM、pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液洗脱冲顶以收集目标抗体。
7.一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法,依次包括如下步骤:
①取可以分泌抗体的细胞的细胞培养上清;
②进行亲和层析;
③进行链合离子交换层析;所述链合离子交换层析由阳离子交换层析和阴离子交换层析组成,阳离子交换层析的出样口与阴离子交换层析的上样口连通。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于:所述阳离子交换层析中采用SP-Sepharose Fast Flow基质,所述阴离子交换层析中采用Q-Sepharose Fast Flow基质,所述链合离子交换层析用30-50mM、pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液洗脱冲顶以收集目标抗体。
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