CN104004090A

CN104004090A - 一种人免疫球蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN104004090A
Application number: CN201410259993.4A
Authority: CN
Inventors: 吕献忠; 苏峰
Original assignee: Xinjiang De Yuan Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Xinjiang De Yuan Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2014-06-12
Filing date: 2014-06-12
Publication date: 2014-08-27

Abstract

本发明提供了一种高纯度的人免疫球蛋白的制备方法，采用低温乙醇提取法和层析法交叉应用，联合去除杂蛋白，提纯免疫球蛋白，可以很好地提高制品蛋白纯度，同时采用S/D灭活法加DV50纳米膜联合去除病毒，使制品更加安全有效。

Description

一种人免疫球蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种人免疫球蛋白的制备方法，属于血液制品领域。

背景技术

人血浆蛋白制品是宝贵的人源性生物类药品。自从20世纪40年代Cohn教授建立了工业化规模分离血浆蛋白的低温乙醇法分离工艺以来，血液制品的开发，特别是临床应用、市场份额以及制品安全性和生产工艺均发生了质的飞跃。

然而与发达国家相比，无论在高技术研发或临床应用研究方面，我国还有很大差距。国内现采用的生产工艺大部分是低温乙醇分离法加低pH孵放灭活法和DV50纳米膜除病毒，采用双重灭活方式来保障制品的安全性。但是此工艺生产周期长，单位时间内制品产率和纯度偏低。

在如今血液制品需求量不断增加，市场缺口越来越大的形势下，开发出一种产率高、周期短的安全有效的人免疫球蛋白的制备方法显得至关重要。

发明内容

本发明主要针对上述所说的产率及纯度低、周期长的问题提供了一种人免疫球蛋白的制备方法。

本发明一种人免疫球蛋白的制备方法，其操作步骤包括：

1、血浆采集：收集具有高效价的原料血浆；

2、组分分离：将上述原料血浆用0.14mol/L氯化钠溶液稀释，并用pH为4.0的醋酸缓冲液调pH为7.10±0.04，降温至0℃开始喷入-15℃以下的95%的乙醇，使最终乙醇浓度达到12%(v/v)，控制温度在-2.5±0.5℃，用醋酸缓冲液调pH为7.10±0.04，搅拌2小时，加入硅藻土，压滤分离出上清液A，压滤时控制压力≤0.1MPa；

3、沉淀压滤：向上述上清液A中继续喷入-15℃以下的95%的乙醇，使最终乙醇浓度达到20%(v/v)，控制温度在-5.0±0.5℃，用pH为4.0的醋酸缓冲液调pH为6.80±0.04，搅拌2小时，静置两小时，按照硅藻土(Kg)=25×V反应液(L)/1000的公式加入硅藻土，压滤分离，收集沉淀物B；

4、沉淀溶解：每Kg沉淀用9L 0.01mol/L氯化钠溶液将沉淀物B溶解后，加pH为4.0的醋酸缓冲液调pH为5.00±0.04，喷入-15℃以下的95%的乙醇至最终乙醇浓度为17%，控制温度在-4.5~-5.5℃，搅拌2小时，静置6小时以上，对反应液进行压滤分离，压滤时压滤控制在≤0.1MPa，收集压滤液C，冷却至-3~-5℃；

5、超滤浓缩：用0.5mol/L盐酸溶液调压滤液C pH为3.8~4.0，使用5倍体积的2~8℃注射用水进行透析，透析至乙醇含量＜1%，浓缩至蛋白浓度＞3%，收集蛋白浓缩液D；

6、层析提纯：用pH为4.0的醋酸缓冲液调蛋白浓缩液D pH为4.00~4.50，然后用由1mol/L的磷酸溶液与1mol/L的NaOH溶液配制而成的磷酸—NaOH缓冲液调节电导率为0.15~0.17s/m，然后将蛋白液上预先用磷酸—NaOH缓冲液平衡好的Macrocap-Q离子交换柱进行层析提纯，收集层析蛋白液E；

7、透析浓缩：向层析蛋白液E中边搅拌边缓慢加入0.5mol/L盐酸液，调节pH至3.80~4.00，用6倍体积的2~8℃注射用水透析，透析至乙醇含量＜0.025%，将蛋白液浓缩至6%以上浓度，收集蛋白浓缩液F；

8、S/D灭活：将蛋白浓缩液F用1μm滤板于室温中进行过滤，之后加入磷酸三丁脂(TNBP)和吐温-80，使得最终浓度为0.3%TNBP和1%吐温-80，控制温度在24.0±1.0℃，缓慢搅拌6小时进行S/D灭活；

9、吸附纯化：收集灭活混合液G，上预先用0.16mol/L的NaCl平衡好的DEAE-纤维素柱，然后用0.21mol/L NaCl洗涤10次，再使用0.28mol/L NaCl洗脱3次，用0.45~1.0滤芯的澄清过滤器过滤蛋白洗脱液，收集过滤后的蛋白过滤液H；

10、超滤浓缩：将蛋白过滤液H用5倍体积的2~8℃注射用水进行透析，将蛋白液浓缩至10%以上浓度，收集蛋白浓缩液I；

11、半成品配置；

12、DV50纳米膜除病毒；

13、分装：将上步收集的蛋白液用1M碳酸氢钠溶液调整pH至6.4~7.4分装。

其中：所述的醋酸缓冲溶液的pH为4.0，冷乙醇是-15℃以下的95%的乙醇。

其中：所述的硅藻土的加量(Kg)=25×V反应液(L)/1000。

其中：所述的压滤时的压力控制在≤0.1MPa，超滤时用的注射用水的温度控制在2-8℃。

其中：步骤6层析提纯步骤中的磷酸-NaOH缓冲液是由1mol/L的磷酸溶液与1mol/L的NaOH溶液配制而成的。

其中：步骤8 S/D灭活步骤的温度控制在24.0±1.0℃，同时缓慢搅拌6小时以上。

其中：步骤9吸附纯化步骤的具体操作是：①平衡：将平衡液加入凝胶柱中，平衡液为0.16mol/L的NaCl；②洗涤：通过将洗涤液加入凝胶中来洗掉凝胶中的S/D灭活混合液和部分杂蛋白，洗涤液为0.21mol/L NaCl；④洗脱：通过将洗脱液加入凝胶中来洗脱凝胶上吸附的蛋白，洗脱液为0.28mol/L NaCl。

其中：该制备方法可以用来制备乙型肝炎人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白。

其中在整个工艺流程中通过加入乙醇来控制乙醇浓度，在不同的乙醇浓度沉淀不同类型的蛋白，而压滤中加入定量的硅藻土是因为定量的硅藻土可以形成很细小的过滤网，将蛋白和某些病毒吸附在硅藻土中，同时控制压力是为了防止压力太大对过滤膜造成破坏，导致过滤膜有漏洞。当乙醇浓度控制在12%~17%时能够沉淀大部分的杂蛋白和少部分的免疫球蛋白，当乙醇浓度控制在25%时能够沉淀所有的免疫球蛋白和一部分其他蛋白，因此合理的控制乙醇浓度能够有效的分离目标蛋白，并且提高收率，经研究发现，在第一步分离的过程中，当控制乙醇浓度在12%时具有较好的分离杂蛋白的效果。

在整个工艺中先是根据蛋白质在不同浓度的冷乙醇中有着不同溶解度的性质，采用低温乙醇提取法去除掉大部分的白蛋白、杂蛋白和部分病毒，第一步提纯免疫球蛋白；再通过一次离子层析，吸附杂蛋白，流出免疫球蛋白，第二步提纯免疫球蛋白；最后通过二次层析，吸附免疫球蛋白，流出杂蛋白和S/D灭活液，通过洗脱层析柱，第三步提纯免疫球蛋白。

在步骤8中，先是使用1μm滤板过滤蛋白液，去除可能被包裹在蛋白颗粒中的病毒，然后加入由最终浓度为0.3%TNBP和1%吐温-80组成的S/D灭活液，使蛋白液充分接触灭活液，控制温度和时间，可以有效地灭活蛋白液中脂包膜类病毒，同时不影响蛋白质的性质。

在步骤12中，采用DV50纳米膜过滤，可以有效的去除在步骤8中没有灭活的非脂包膜病毒，可以很好地保证制品的安全性。

本发明与现有技术相比，不但制品纯度高、收率好而且更加安全、生产周期大大缩短，具有广阔的市场应用前景。

具体实施方式

实施例1：采用本发明制备人免疫球蛋白

1、血浆采集：收集具有高效价的原料血浆，其狂犬病表面抗体效价应≥8IU/ml；

6、层析提纯：用pH为4.0的醋酸缓冲液调蛋白浓缩液D pH为4.00~4.50，然后用由1mol/L的磷酸溶液与1mol/L的NaOH溶液配制而成的磷酸-NaOH缓冲液调节电导率为0.15~0.17s/m，然后将蛋白液上预先用磷酸-NaOH缓冲液平衡好的Macrocap-Q离子交换柱进行层析提纯，收集层析蛋白液E；

11、半成品配置：向蛋白浓缩液I中加入注射用水，加入麦芽糖使麦芽糖含量为20~50g/L，用1mol/L盐酸调节pH6.4~7.4，狂犬病表面抗体效价≥100IU/ml，乙肝表面抗体效价≥1.0IU/（每g蛋白质）；

12、DV50纳米膜除病毒；

实施例2：比较本工艺制备的狂犬病人免疫球蛋白与传统乙醇分离制备工艺，所得狂犬病人免疫球蛋白产品的主要参数：

因此本方法制备的产品质量和收率要优于传统乙醇分离所制备的产品。

实施例3：本制备方法灭活病毒工艺与低pH孵放灭活病毒工艺比较

因此本工艺所用的病毒灭活方法与传统低pH病毒灭活方法相比效果更好。

Claims

1.一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）血浆采集：收集具有高效价的原料血浆；

（2）组分分离：将上述原料血浆用0.14mol/L氯化钠溶液稀释，并用醋酸缓冲液调pH为7.10±0.04，降温至0℃开始喷入冷乙醇，使最终乙醇浓度达到12%(v/v)，控制温度在-2.5±0.5℃，用醋酸缓冲液调pH为7.10±0.04，搅拌2小时，加入硅藻土，压滤分离出上清液A；

（3）沉淀压滤：向上述上清液A中继续喷入冷乙醇，使最终乙醇浓度达到20%(v/v)，控制温度在-5.0±0.5℃，用醋酸缓冲液调pH为6.80±0.04，搅拌2小时，静置两小时，加入硅藻土，压滤分离，收集沉淀物B；

（4）沉淀溶解：每Kg沉淀用9L 0.01mol/L氯化钠溶液将沉淀物B溶解后，加醋酸缓冲液调pH为5.00±0.04，喷入冷乙醇至最终乙醇浓度为17%，控制温度在-4.5~-5.5℃，搅拌2小时，静置6小时以上，对反应液进行压滤分离，收集压滤液C，冷却至-3~-5℃；

（5）超滤浓缩：用0.5mol/L盐酸溶液调压滤液C pH为3.8~4.0，使用5倍体积的注射用水进行透析，透析至乙醇含量＜1%，浓缩至蛋白浓度＞3%，收集蛋白浓缩液D；

（6）层析提纯：用醋酸缓冲液调蛋白浓缩液D pH为4.00~4.50，然后用磷酸-NaOH缓冲液调节电导率为0.15~0.17s/m，然后将蛋白液上预先用磷酸-NaOH缓冲液平衡好的Macrocap-Q离子交换柱进行层析提纯，收集层析蛋白液E；

（7）透析浓缩：向层析蛋白液E中边搅拌边缓慢加入0.5mol/L盐酸液，调节pH至3.80~4.00，用6倍体积的注射用水透析，透析至乙醇含量＜0.025%，将蛋白液浓缩至6%以上浓度，收集蛋白浓缩液F；

（8）S/D灭活：将蛋白浓缩液F用1μm滤板于室温中进行过滤，之后加入磷酸三丁脂(TNBP)和吐温-80，使得最终浓度为0.3%TNBP和1%吐温-80，进行S/D灭活；

（9）吸附纯化：收集灭活混合液G，上预先用平衡液平衡好的DEAE-纤维素柱，进行洗涤液洗涤10次，洗脱液洗脱3次，用0.45~1.0um滤芯的澄清过滤器过滤蛋白洗脱液，收集过滤后的蛋白过滤液H；

（10）超滤浓缩：将蛋白过滤液H用5倍体积的注射用水进行透析，将蛋白液浓缩至10%以上浓度，收集蛋白浓缩液I；

（11）半成品配置；

（12）DV50纳米膜除病毒；

（13）分装：将上步收集的蛋白液用1M碳酸氢钠溶液调整pH至6.4~7.4分装。

2. 根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：所述的醋酸缓冲溶液的pH为4.0，冷乙醇是-15℃以下的95%的乙醇。

3.根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：所述的硅藻土的加量(Kg)=25×V反应液(L)/1000。

4.根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：所述的压滤时的压力控制在≤0.1MPa，超滤时用的注射用水的温度控制在2-8℃。

5.根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（6）层析提纯步骤中的磷酸-NaOH缓冲液是由1mol/L的磷酸溶液与1mol/L的NaOH溶液配制而成的。

6.根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（8） S/D灭活步骤的温度控制在24.0±1.0℃，同时缓慢搅拌6小时以上。

7.根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于步骤（9）吸附纯化步骤的具体操作是：①平衡：将平衡液加入凝胶柱中，平衡液为0.16mol/L的NaCl；②洗涤：通过将洗涤液加入凝胶中来洗掉凝胶中的S/D灭活混合液和部分杂蛋白，洗涤液为0.21mol/L NaCl；④洗脱：通过将洗脱液加入凝胶中来洗脱凝胶上吸附的蛋白，洗脱液为0.28mol/L NaCl。

8.根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于该制备方法可以用来制备乙型肝炎人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白。