CN115925890A

CN115925890A - 一种抗新冠病毒中和抗体纯化方法

Info

Publication number: CN115925890A
Application number: CN202111143791.XA
Authority: CN
Inventors: 蔡如鑫; 陆游; 丁满生; 孔苏伟; 朱雨; 吴晓忠; 代虎; 沈红
Original assignee: Jiangsu T Mab Biopharma Co ltd
Current assignee: Jiangsu T Mab Biopharma Co ltd
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明提供了一种抗新冠病毒中和抗体的纯化方法，主要包括亲和层析、低pH值孵育、阴离子层析、阳离子层析、纳滤和超滤，以及过滤和分装六个步骤，使得抗体中的HCD、HCP和PrA三项杂质含量显著降低，安全性提高。方法操作简单，适于推广应用，为克服新冠病毒的抗体研究提供技术支持。

Description

一种抗新冠病毒中和抗体纯化方法

技术领域

本发明涉及抗体药物领域，具体而言，本发明涉及针对一种抗新型冠状病毒中和抗体的纯化方法。

背景技术

随着近年生物技术的快速发展，通过基因工程技术，将能够结合新冠病毒的抗体基因片段导入哺乳动物细胞，通过发酵培养及纯化，能快速得到高效结合新冠病毒的单克隆抗体，高效控制病毒的传播。新冠病毒抗体的纯化是得到高质量抗体的关键，本发明方法能够快速高效的纯化单克隆抗体且易于放大，有效减少抗体中的HCD、HCP和PrA三项杂质含量。

现有抗体技术中，主要采用新冠肺炎病毒灭活疫苗免疫健康禽类动物，当被免疫的所述禽类动物血清或卵黄内抗新冠肺炎抗体滴度达到要求时，收集血清或卵黄中的水溶性组分，纯化后得到。但这种方法可能导致抗体在有效性和安全性的问题，同时制备方法不稳定，复杂，能耗高，无法获得纯度较高，产量大的抗体(专利CN111574622A，2020-04-07申请)。本申请拟建立一套成熟稳定的纯化方法，为新冠病毒抗体的纯化问题提供技术支持。

发明内容

本公开提供一种抗新冠病毒中和抗体纯化方法，在传统的亲和层析、阴离子层析和阳离子层析基础上，采用新发明的缓冲液(Buffer，下同)进行平衡、淋洗、洗脱和调节pH，使得抗体中的HCD、HCP经过本方法的纯化后含量低于原样品中含量的0.01％，PrA经过纯化后含量低于原样品中含量的5％。

具体而言，本发明的新冠病毒中和抗体纯化方法，其包括：

将待纯化抗体依次经过层析柱1、层析柱2和层析柱3，其特征在于，层析柱1在上样前使用Buffer A平衡，在上样后使用Buffer A再平衡，使用Buffer B淋洗，使用Buffer C洗脱，使用Buffer E调节洗脱液pH；

层析柱2在上样前使用Buffer C冲洗，使用Buffer G平衡，在上样后使用Buffer G再平衡，收集洗脱液后使用Buffer E/Buffer F调节洗脱液pH，使用注射用水稀释洗脱液；

层析柱3在上样前使用Buffer J冲洗，使用Buffer B平衡，在上样后使用Buffer B再平衡，使用洗脱液(80％Buffer B+20％Buffer J)洗脱，使用Buffer B稀释。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述杂质为HCD、HCP和PrA。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述各Buffer配比如下：

Buffer A(十二水合磷酸二氢钠552g/100kg；二水合磷酸二氢钠72g/100kg；氯化钠584g/100kg)；

Buffer B(醋酸34g/100kg；三水合醋酸钠599g/100kg)；

Buffer C(醋酸285g/100kg；三水合醋酸钠36g/100kg)；

Buffer E(醋酸6005g/100kg)；

Buffer F(三(羟甲基)氨基甲烷228.6g/kg)；

Buffer G(三(羟甲基)氨基甲烷242.7g/100kg；发烟酸盐174g/100kg)；

Buffer J(醋酸28g/100kg；三水合醋酸钠614g/100kg；氯化钠

2922g/100kg)；

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述Buffer E调节洗脱液pH，使pH为3.65±0.05。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述Buffer E/Buffer F调节洗脱液pH，使pH为5.5±0.1。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述使用注射用水稀释洗脱液后电导为3～5mS/cm。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述使用Buffer B稀释后，蛋白浓度不超过15g/L。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述收集采用收集流穿模式。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述层析柱1的填料载量不超过47g/L，所述层析柱2和所述层析柱3的填料载量均不超过100g/L。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述层析柱1为亲和层析，所述层析柱2为阴离子层析，所述层析柱3为阳离子层析。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述层析柱1之后，所述层析柱2之前，需进行低pH值孵育。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述低pH值孵育需使用Buffer F调节pH至6.1±0.1。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述低pH值孵育需进行去颗粒和降低生物负荷过滤。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述过滤后使用注射用水稀释至电导≤5mS/cm，蛋白浓度≤15g/L。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述层析柱3之后，需进行纳滤和超滤。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述纳滤使用注射用水冲洗膜包，使用Buffer B平衡。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述超滤使用Buffer K(Histiding 49g/100kg，Histiding Hydrochloride 143.43g/100kg)平衡，样品回收后添加Buffer L(吐温20 2.4g/kg；蔗糖400g/kg；使用Buffer K配制)和Buffer K使吐温20含量为0.15g/L，蔗糖含量为50g/L，蛋白终浓度为50±5mg/ml。

进一步，本发明所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述HCD、HCP经过纯化后含量低于原样品中含量的0.01％，所述PrA经过纯化后含量低于原样品中含量的5％。

为更好理解本发明，首先定义一些属性。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

术语“亲和层析”也称为“亲和色谱”，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。

术语“阴离子层析”是离子交换层析的一种。离子交换层析是在生物大分子提纯中得到最广泛应用的方法之一。在一定pH条件下，根据蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。采用弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)作为离子交换剂用于蛋白质分离的离子交换层析为阴离子层析。

术语“阳离子层析”也是离子交换层析的一种。采用弱酸型的羧甲基纤维素(CM纤维素)作为离子交换剂用于蛋白质分离的离子交换层析为阳离子层析。

术语“纳滤”，是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程，纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右。与其他压力驱动型膜分离过程相比，出现较晚。它的出现可追溯到70年代末J.E.Cadotte的NS-3 0 0膜的研究，之后，纳滤发展得很快，膜组器于80年代中期商品化。纳滤膜大多从反渗透膜衍化而来，如CA、CTA膜、芳族聚酰胺复合膜和磺化聚醚砜膜等。

术语“超滤”，是以压力为推动力的膜分离技术之一。以大分子与小分子分离为目的，膜孔径在20－1000A°之间。中空纤维超滤器(膜)具有单位容器内充填密度高，占地面积小等优点。

所述方法使得抗体中的HCD、HCP和Pra三项杂质含量显著降低，重复性好、得率高，适合大规模生产。

具体实施方式

下面将更详细地描述本公开的示例性实施方式。本发明可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明实施例用到的关键设备如下表1所示：

表1关键设备

本发明实施例用到的关键试剂如下表2所示：

表2关键试剂

实施例1亲和层析

用4-5个CV的Buffer A平衡柱子，平衡完成后，将含有抗新冠病毒中和抗体的细胞上清液按柱保留时间不低于6min的流速进行上样。上样结束后，使用3-4CV的Buffer A进行再平衡，并确保填料载量不超过47g/L。待紫外信号平稳后，使用3-4CV的Buffer B进行淋洗。最后，使用Buffer C洗脱亲和层析柱，当紫外吸收值上升至0.5AU时收集亲和洗脱液，当紫外吸收值降至0.5AU时结束收集，使用Buffer E将pH调至3.65±0.05，得到亲和洗脱液M1F2，备用。亲和洗脱液M1F2中HCD、HCP和PrA含量如下表3。

表3 M1F2溶液杂质含量

实施例2低pH值孵育

M1F2溶液室温放置60min，进行病毒灭活。灭活完成后使用Buffer F将样品pH调至6.1±0.1。回调后，经去颗粒和降低生物负荷过滤至储罐中混匀，样品用注射用水稀释得到LPH溶液，使溶液电导≤5mS/cm，蛋白浓度≤15g/L。测量得到LPH溶液的pH为7.2±0.1，电导4.0±1.0mS/cm，LPH溶液中HCD、HCP和PrA含量如下表4。

表4 LPH溶液杂质含量

实施例3阴离子交换层析

使用2-4CV的Buffer C冲洗层析柱，使用4-6CV的Buffer G平衡层析柱，平衡完成后将收集灭活样品LPH溶液上样，柱保留时间不少于5min，且填料载量不超过100g/L，上样完成后用2-4CV的Buffer G再平衡层析柱。采用收集流穿的模式收集样品，当紫外吸收值达到0.5AU时开始收集流穿峰，当紫外吸收值降至0.5AU时停止收集。最后，将本步骤样品用Buffer E/Buffer F调节pH至5.5±0.1，注射用水稀释电导至3～5mS/cm，得到QF1溶液，混匀后在不超过25℃条件下暂存，暂存时间不超过48h，备用。测量得到QF1溶液电导4.0±1.0mS/cm，QF1溶液中HCD、HCP和PrA含量如下表5。

表5 QF1溶液杂质含量

实施例4阳离子交换层析

使用2-4CV的Buffer J对层析柱进行冲洗，然后用3-5CV的Buffer B平衡层析柱，将收集的QF1溶液以柱保留时间不少于6min的流速上样，填料载量不超过100g/L。其次，上样结束后，使用所述Buffer B进行再平衡，然后使用5-7CV的洗脱液(80％Buffer B+20％Buffer J)洗脱，当紫外吸收值吸收高于0.3AU时开始收集，降至0.5AU时停止收集。最后，使用Buffer B进行稀释，得到SF2溶液，蛋白浓度不超过15g/L，混匀后可在不超过25℃条件下暂存，暂存时间不超过48h，备用；SF2溶液中HCD、HCP和PrA含量如下表6。

表6 SF2溶液杂质含量

实施例5纳滤与超滤

将纳滤系统清洁消毒，使用注射用水冲洗膜包，使用Buffer B进行平衡，将所得样品恒压(2bar)过滤收集至精纯间。

将超滤系统和膜包清洁消毒，使用Buffer K润洗平衡，控制回流流量40-60L/min，跨膜压TMP 0.6-1.0bar，维持浓度在该范围内进行7-10倍体积的透析置换，置换至BufferK中。置换完成后，回流流量为20-30L/min，TMP保持不变，确保回收后浓度不低于60mg/ml，样品命名为UF2。回收样品添加Buffer L和Buffer K，使样品中吐温20含量为0.15g/L，蔗糖含量为50g/L，终浓度为50±5mg/ml。原液密度为1.0339g/L。UF2溶液中HCD、HCP和PrA含量如下表7。

表7 UF2溶液杂质含量

与表1相比，HCD残留量为纯化前残留量的0.239/2794.872*100％＝0.00855％，低于0.01％；

HCP残留量为纯化前残留量的0.1/1861.2*100％＝0.00537％，低于0.01％；

PrA残留量为纯化前残留量的0.095/2.941*100％＝3.23％，低于5％。

实施例6过滤与分装

将超滤所得UF2样品经0.22μm滤膜过滤分装至一次性原液储液袋中，即得新冠抗体蛋白原液。

本发明通过抗体工程，提供了一种抗新冠病毒重组中和单克隆抗体的纯化方法，该方法包括亲和层析，阳离子层析，阴离子层析，纳滤和超滤，使HCD、HCP和PrA杂质显著减少。本发明方法适用于高表达量、高亲和活性的抗新冠中和抗体纯化，为新型冠状病毒的疾病控制提供技术支持。

Claims

1.一种减少新冠抗体中杂质的方法，包括将待纯化抗体依次经过层析柱1、层析柱2和层析柱3，其特征在于，层析柱1在上样前使用Buffer A平衡，在上样后使用Buffer A再平衡，使用Buffer B淋洗，使用Buffer C洗脱，使用Buffer E调节洗脱液pH；

2.如权利要求1所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述杂质为HCD、HCP和PrA。

3.如权利要求1所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述各Buffer配比如下：

Buffer B(醋酸34g/100kg；三水合醋酸钠599g/100kg)；

Buffer C(醋酸285g/100kg；三水合醋酸钠36g/100kg)；

Buffer E(醋酸6005g/100kg)；

Buffer F(三(羟甲基)氨基甲烷228.6g/kg)；

Buffer G(三(羟甲基)氨基甲烷242.7g/100kg；发烟酸盐174g/100kg)；

Buffer J(醋酸28g/100kg；三水合醋酸钠614g/100kg；氯化钠2922g/100kg)。

4.如权利要求1所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述Buffer E调节洗脱液pH，使pH为3.65±0.05。

5.如权利要求1所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述Buffer E/BufferF调节洗脱液pH，使pH为5.5±0.1。

6.如权利要求1所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述使用注射用水稀释洗脱液后电导为3～5mS/cm。

7.如权利要求1所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述使用Buffer B稀释后，蛋白浓度不超过15g/L。

8.如权利要求1所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述收集采用收集流穿模式。

9.如权利要求1所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述层析柱1的填料载量不超过47g/L，所述层析柱2和所述层析柱3的填料载量均不超过100g/L。

10.如权利要求1所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述层析柱1为亲和层析，所述层析柱2为阴离子层析，所述层析柱3为阳离子层析。

11.如权利要求1所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述层析柱1之后，所述层析柱2之前，需进行低pH值孵育。

12.如权利要求11所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述低pH值孵育需使用Buffer F调节pH至6.1±0.1。

13.如权利要求12所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述低pH值孵育需进行去颗粒和降低生物负荷过滤。

14.如权利要求13所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述过滤后使用注射用水稀释至电导≤5mS/cm，蛋白浓度≤15g/L。

15.如权利要求1所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述层析柱3之后，需进行纳滤和超滤。

16.如权利要求15所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述纳滤使用注射用水冲洗膜包，使用Buffer B平衡。

17.如权利要求16所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述超滤使用BufferK(Histiding 49g/100kg，Histiding Hydrochloride 143.43g/100kg)平衡，样品回收后添加Buffer L(吐温20 2.4g/kg；蔗糖400g/kg；使用Buffer K配制)和Buffer K使吐温20含量为0.15g/L，蔗糖含量为50g/L，蛋白终浓度为50±5mg/ml。

18.如权利要求2所述减少新冠抗体中杂质的方法，其特征在于，所述HCD、HCP经过纯化后含量低于原样品中含量的0.01％，所述PrA经过纯化后含量低于原样品中含量的5％。