CN104479047B - 一种中品肝素钠的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种中品肝素钠的提取方法。该中品肝素钠的提取方法，包括：溶解；酶解；去除蛋白；去除钙离子；沉淀；树脂吸附；洗脱；一次氧化；过滤、沉淀；二次氧化；过滤、沉淀；脱水、烘干；称量、包装。采用过氧化氢二次氧化法制备中品肝素钠，确立了酶解结合树脂吸附和氧化法制备肝素钠的新工艺，克服了粗品肝素钠纯化过程中残留杂蛋白难以去除的缺点；在粗品肝素钠溶液中加入胰蛋白酶对杂蛋白进行溶解，再结合树脂吸附及氧化除杂，提高了中品肝素钠的效价和收率。
Description
（一）技术领域
本发明属于生化行业领域，具体涉及一种中品肝素钠的提取方法。
（二）背景技术
肝素是1916年Mclean研究凝血机制时从肝脏组织中发现的一种酸性粘多糖。1939年，Brinkhousflj等证明了肝素具有抗凝血活性，从此，肝素作为天然抗凝血物质而受到世界各国的重视。肝素用于临床虽有60余年的历史，但到目前为止，还没有一种能够完全代替它的产品，所以它仍然是最重要的生化药物之一，也是我国主要的出口药物之一。肝素具有强抗凝作用，是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物，随着研究的深入，人们发现肝素不但有抗凝、抗血栓形成和调整血脂的作用，还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能。
（三）发明内容
本发明提供了一种中品肝素钠的提取方法，肝素和大多数粘多糖一样，在动物体内多以肝素钠--蛋白质复合物的形式存在，提取过程中由于肝素钠解离不完全使得粗品肝素钠中残留有一定数量的蛋白质，需进一步加工才可用于临床。中品肝素钠的提取就是对粗品肝素钠进行除杂和脱色。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种中品肝素钠的提取方法，其特殊之处在于：包括以下步骤：
（1）溶解：按照3%的肠衣盐水的体积：粗品肝素钠的亿单位10-15:1L/亿单位的比例，将粗品肝素钠溶于3%的肠衣盐水中，搅拌升温至35-40℃，反应；
（2）酶解：用NaOH调节溶液pH 至7.5-8.0，按16g/亿单位的比例向反应液中加入胰酶，控制温度在38-42℃反应；
（3）去除蛋白：调pH 至8.5，升温至55-65℃，按粗品肝素钠质量的20-30%加入氯化钙，反应，继续升温至90-95℃，停止加热，然后降温至35-45℃，进行离心；
（4）去除钙离子：保持溶液温度35-45℃，加入与氯化钙等量的无水碳酸钠，反应，过滤，收集滤液；
（5）沉淀：用盐酸调pH至7.0-7.5，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数38-42度，静置，上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀；
（6）树脂吸附：按照10%-15%浓度加2%肠衣盐水溶解，溶解后，溶液中按2%肠衣盐水的0.06-1% g/ml的比例加入亚硫酸钠，调节pH7.0-7.5，温度55-60℃，按照粗品肝素钠亿单位：树脂体积比1:10亿单位/L的比例加入树脂进行吸附，吸附，吸附结束后，过滤，收集树脂；
（7）洗脱：将所收集到的树脂，用与树脂体积比为1.2-1.5:1的饱和肠衣盐水进行洗脱，溶液中按饱和肠衣盐水的0.06-1% g/ml的比例加入亚硫酸钠，调节pH7.0-7.5，温度55-60℃，洗脱，洗脱结束后，收集洗脱液；
（8）合并、沉淀：将收集到的洗脱液合并，用食品级乙醇进行沉淀，上层乙醇度数38-42度，静置，上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀；
（9）一次氧化：将步骤（8）收集到的沉淀，用2%的肠衣盐水按10%-15%的浓度进行溶解，溶解后，调节pH10.5-11.0，温度25-30℃，加入H2O2进行氧化；
（10）过滤、沉淀：将溶液过滤，收集过滤液，用盐酸调pH7.0-7.5，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数38-42度，静置，上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀；
（11）二次氧化：将步骤（10）收集到的沉淀，重复步骤（9）的操作，进行二次氧化；
（12）过滤、沉淀：重复步骤（10）的操作，将溶液进行过滤、沉淀；
（13）脱水、烘干：将步骤（12）收集到的沉淀，用95-100度乙醇进行脱水，脱水后的沉淀用双锥进行烘干，即得中品肝素钠；
（14）称量、包装：将中品肝素钠进行称量，按规格要求，将中品肝素钠进行包装得成品。
本发明的中品肝素钠的提取方法，步骤（1）反应时间为2-3小时，步骤（2）反应时间为4-5小时，步骤（6）吸附时间为4-5小时。
本发明的中品肝素钠的提取方法，所述步骤（3）去除蛋白：调PH 至8.5，升温至60℃，按肝素钠质量的20-30%加入氯化钙，反应0.5小时，继续升温至90-95℃，停止加热，然后降温至35-45℃，进行离心。
本发明的中品肝素钠的提取方法，所述步骤（6）树脂吸附：将步骤（5）所得沉淀，按照10%-15%浓度加2%肠衣盐水溶解，溶解后，溶液中按2%肠衣盐水的0.06-0.08% g/ml的比例加入亚硫酸钠，调节pH7.0-7.5，温度55-60℃，按照粗品肝素钠亿单位：树脂体积1:10亿单位/L的比例加入树脂进行吸附，吸附4-5小时，吸附结束后，过滤，收集树脂。
本发明的中品肝素钠的提取方法，所述步骤（7）洗脱：将步骤（6）所收集到的树脂，用与树脂体积比为1.2-1.5:1的饱和肠衣盐水进行洗脱，溶液中按饱和肠衣盐水的0.06-0.08% g/ml的比例加入亚硫酸钠，调节pH7.0-7.5，温度55-60℃，洗脱时间2小时，洗脱结束后，收集洗脱液，然后重复上述步骤，将树脂进行二次洗脱。
本发明的中品肝素钠的提取方法，所述步骤（9）一次氧化：将收集到的沉淀，用2%的肠衣盐水按10%-15%的浓度进行溶解，溶解后，调节pH10.5-11.0，温度25-30℃，加入溶液体积2%的H2O2进行氧化，H2O2分4次加入，加入时间分别为0小时、1小时、2小时、4小时，维持pH、温度，共氧化24小时。
本发明的有益效果：采用过氧化氢二次氧化法制备中品肝素钠，在此过程中采用低温离心技术解决了去除杂蛋白时沉淀不易滤除的困难，确立了酶解结合树脂吸附和氧化法制备肝素钠的新工艺，克服了粗品肝素钠纯化过程中残留杂蛋白难以去除的缺点；在粗品肝素钠溶液中加入胰蛋白酶对杂蛋白进行溶解，再结合树脂吸附及氧化除杂，提高了中品肝素钠的效价和收率。本发明在树脂吸附以及洗脱中加入了亚硫酸钠，大大提高了肝素钠的收率（提高至少30%），以及肝素钠溶液的澄清度和吸光度。
（四）具体实施方式
实施例1：
（1）溶解：粗品肝素钠2Kg，效价95 USP u/mg，折合粗品肝素钠1.9亿单位。用3%的肠衣盐水22.8L进行溶解，搅拌升温至38℃，反应2小时。
（2）酶解：步骤（1）结束后，用20%的NaOH调节溶液PH 7.5，加入胰酶30.4g，控制温度40℃，反应4小时。
（3）去除蛋白：步骤（2）结束后，调pH 至8.5，升温至60℃，加入氯化钙500g，反应0.5小时，继续升温至90℃，停止加热。然后降温至40℃左右，进行离心。
（4）去除钙离子：步骤（3）结束后，保持溶液温度40℃，加入无水碳酸钠500g，反应0.5小时，过滤，收集滤液。
（5）沉淀：将步骤（4）所得的过滤液，用6mol/L的盐酸调pH7.0，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数39度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（6）树脂吸附：将步骤（5）所得沉淀2.38Kg，加入2%的肠衣盐水23.8L进行溶解，溶解后，加入亚硫酸钠14.28g，调节pH7.0，温度58℃。检测溶液活性7810单位/mL，折合肝素钠1.859亿单位。加入树脂18.59L进行吸附，吸附4小时。吸附结束后，过滤，收集树脂。
（7）一次洗脱：将步骤（6）所收集到的树脂，加入22.3L的饱和肠衣盐水进行洗脱，加入亚硫酸钠13.38g，调节pH7.0，温度56℃，洗脱时间2小时，洗脱结束后，收集洗脱液。
（8）二次洗脱：步骤（7）结束后，加入24.2L的饱和肠衣盐水进行洗脱，加入亚硫酸钠14.52g，调节pH7.0，温度57℃，洗脱时间2小时，洗脱结束后，收集洗脱液。
（9）合并、沉淀：将步骤（7）与步骤（8）收集到的洗脱液合并，用食品级乙醇进行沉淀，上层乙醇度数40度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（10）一次氧化：将步骤（9）收集到的沉淀2.25Kg，加入2%的肠衣盐水22.5L进行溶解,溶解后，调节pH10.5，温度27℃，加入H2O2450mL进行氧化，H2O2分4次加入，加入时间分别为0小时、1小时、2小时、4小时，维持pH、温度，共氧化24小时。
（11）过滤、沉淀：步骤（10）结束后，将溶液过滤，收集过滤液，用6mol/L的盐酸调pH7.0，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数38度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（12）二次氧化：将步骤（11）收集到的沉淀2.12Kg，加入2%的肠衣盐水21.2L进行溶解,溶解后，调节pH11.0，温度26℃，加入H2O2424mL进行氧化，H2O2分4次加入，加入时间分别为0小时、1小时、2小时、4小时，维持pH、温度，共氧化24小时。
（13）过滤、沉淀：步骤（12）结束后，将溶液过滤，收集过滤液，用6mol/L的盐酸调pH7.0，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数39度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（14）脱水、烘干：将步骤（13）收集到的沉淀1.95Kg，用97度乙醇进行脱水，脱水后的沉淀用双锥进行烘干，即得中品肝素钠。
（15）称量、包装：将步骤（14）中得到的中品肝素钠，进行称量，取样检测。按规格要求，将中品肝素钠进行包装。
实施例2：
（1）溶解：粗品肝素钠1.5Kg，效价88 USP u/mg，折合粗品肝素钠1.32亿单位。用3%的肠衣盐水14.52L进行溶解，搅拌升温至40℃，反应2.5小时。
（2）酶解：步骤（1）结束后，用20%的NaOH调节溶液pH 8.0，加入胰酶21.12g，控制温度41℃，反应4.5小时。
（3）去除蛋白：步骤（2）结束后，调PH 至8.5，升温至60℃，加入氯化钙300g，反应0.5小时，继续升温至93℃，停止加热。然后降温至40℃左右，进行离心。
（4）去除钙离子：步骤（3）结束后，保持溶液温度40℃，加入无水碳酸钠300g，反应0.5小时，过滤，收集滤液。
（5）沉淀：将步骤（4）所得的过滤液，用6mol/L的盐酸调pH7.5，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数38度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（6）树脂吸附：将步骤（5）所得沉淀1.65Kg，加入2%的肠衣盐水16.5L进行溶解，溶解后，加入亚硫酸钠11.55g，调节pH7.5，温度55℃。检测溶液活性7780单位/mL，折合肝素钠1.284亿单位。加入树脂12.84L进行吸附，吸附4小时。吸附结束后，过滤，收集树脂。
（7）一次洗脱：将步骤（6）所收集到的树脂，加入16.7L的饱和肠衣盐水进行洗脱，加入亚硫酸钠11.69g，调节pH7.0，温度58℃，洗脱时间2小时，洗脱结束后，收集洗脱液。
（8）二次洗脱：步骤（7）结束后，加入17.3L的饱和肠衣盐水进行洗脱，加入亚硫酸钠12.11g，调节pH7.0，温度57℃，洗脱时间2小时，洗脱结束后，收集洗脱液。
（9）合并、沉淀：将步骤（7）与步骤（8）收集到的洗脱液合并，用食品级乙醇进行沉淀，上层乙醇度数42度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（10）一次氧化：将步骤（9）收集到的沉淀1.55Kg，加入2%的肠衣盐水12.9L进行溶解,溶解后，调节pH11.0，温度26℃，加入H2O2258mL进行氧化，H2O2分4次加入，加入时间分别为0小时、1小时、2小时、4小时，维持pH、温度，共氧化24小时。
（11）过滤、沉淀：步骤（10）结束后，将溶液过滤，收集过滤液，用6mol/L的盐酸调pH7.0，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数40度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（12）二次氧化：将步骤（11）收集到的沉淀1.47Kg，加入2%的肠衣盐水12.3L进行溶解,溶解后，调节pH11.0，温度26℃，加入H2O2246mL进行氧化，H2O2分4次加入，加入时间分别为0小时、1小时、2小时、4小时，维持pH、温度，共氧化24小时。
（13）过滤、沉淀：步骤（12）结束后，将溶液过滤，收集过滤液，用6mol/L的盐酸调pH7.5，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数39度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（14）脱水、烘干：将步骤（13）收集到的沉淀1.30kg，用97度乙醇进行脱水，脱水后的沉淀用双锥进行烘干，即得中品肝素钠。
（15）称量、包装：将步骤（14）中得到的中品肝素钠，进行称量，取样检测。按规格要求，将中品肝素钠进行包装。
实施例3：
（1）溶解：粗品肝素钠2.5Kg，效价98 USP u/mg，折合粗品肝素钠2.45亿单位。用3%的肠衣盐水31.85L进行溶解，搅拌升温至36℃，反应3小时。
（2）酶解：步骤（1）结束后，用20%的NaOH调节溶液pH7.5，加入胰酶39.2g，控制温度41℃，反应4.5小时。
（3）去除蛋白：步骤（2）结束后，调pH 至8.5，升温至60℃，加入氯化钙700g，反应0.5小时，继续升温至92℃，停止加热。然后降温至40℃左右，进行离心。
（4）去除钙离子：步骤（3）结束后，保持溶液温度40℃，加入无水碳酸钠700g，反应0.5小时，过滤，收集滤液。
（5）沉淀：将步骤（4）所得的过滤液，用6mol/L的盐酸调pH7.5，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数40度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（6）树脂吸附：将步骤（5）所得沉淀2.82Kg，加入2%的肠衣盐水25.6L进行溶解，溶解后，加入亚硫酸钠17.41g，调节pH7.5，温度58℃。检测溶液活性9260单位/mL，折合肝素钠2.37亿单位。加入树脂23.7L进行吸附，吸附4小时。吸附结束后，过滤，收集树脂。
（7）一次洗脱：将步骤（6）所收集到的树脂，加入30.8L的饱和肠衣盐水进行洗脱，加入亚硫酸钠21.56g，调节pH7.5，温度56℃，洗脱时间2小时，洗脱结束后，收集洗脱液。
（8）二次洗脱：步骤（7）结束后，加入32.7L的饱和肠衣盐水进行洗脱，加入亚硫酸钠22.89g，调节pH7.5，温度57℃，洗脱时间2小时，洗脱结束后，收集洗脱液。
（9）合并、沉淀：将步骤（7）与步骤（8）收集到的洗脱液合并，用食品级乙醇进行沉淀，上层乙醇度数41度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（10）一次氧化：将步骤（9）收集到的沉淀2.58Kg，加入2%的肠衣盐水21.5L进行溶解,溶解后，调节pH10.5，温度28℃，加入H2O2430mL进行氧化，H2O2分4次加入，加入时间分别为0小时、1小时、2小时、4小时，维持pH、温度，共氧化24小时。
（11）过滤、沉淀：步骤（10）结束后，将溶液过滤，收集过滤液，用6mol/L的盐酸调pH7.0，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数39度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（12）二次氧化：将步骤（11）收集到的沉淀2.39Kg，加入2%的肠衣盐水19.9L进行溶解,溶解后，调节pH11.0，温度27℃，加入H2O2398mL进行氧化，H2O2分4次加入，加入时间分别为0小时、1小时、2小时、4小时，维持PH、温度，共氧化24小时。
（13）过滤、沉淀：步骤（12）结束后，将溶液过滤，收集过滤液，用6mol/L的盐酸调pH7.0，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数39度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（14）脱水、烘干：将步骤（13）收集到的沉淀2.23kg，用97度乙醇进行脱水，脱水后的沉淀用双锥进行烘干，即得中品肝素钠。
（15）称量、包装：将步骤（14）中得到的中品肝素钠，进行称量，取样检测。按规格要求，将中品肝素钠进行包装。
实施例4
所用NaOH的浓度为30%，盐酸的浓度为8mol/L，其他与实施例1相同。
实施例5
（1）溶解：粗品肝素钠2.5Kg，效价98 USP u/mg，折合粗品肝素钠2.45亿单位。用3%的肠衣盐水31.85L进行溶解，搅拌升温至36℃，反应3分钟。
（2）酶解：步骤（1）结束后，用30%的NaOH调节溶液pH7.5，加入胰酶39.2g，然后加入氯化锌20g、氯化钙5g控制温度41℃，反应0.4小时。
（3）去除蛋白：步骤（2）结束后，调pH 至8.5，升温至60℃，加入氯化钙700g，反应5min，继续升温至92℃，停止加热。然后降温至40℃左右，进行离心。
（4）去除钙离子：步骤（3）结束后，保持溶液温度40℃，加入无水碳酸钠700g，反应5min，过滤，收集滤液。
（5）沉淀：将步骤（4）所得的过滤液，用6mol/L的盐酸调pH7.5，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数40度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（6）树脂吸附：将步骤（5）所得沉淀2.82Kg，加入2%的肠衣盐水25.6L进行溶解，溶解后，加入亚硫酸钠256g，调节pH7.5，温度58℃。检测溶液活性9260单位/mL，折合肝素钠2.37亿单位。加入树脂23.7L进行吸附，吸附0.5小时。吸附结束后，过滤，收集树脂。
（7）一次洗脱：将步骤（6）所收集到的树脂，加入30.8L的饱和肠衣盐水进行洗脱，加入亚硫酸钠300g，调节pH7.5，温度56℃，洗脱时间2小时，洗脱结束后，收集洗脱液。
（8）二次洗脱：步骤（7）结束后，加入32.7L的饱和肠衣盐水进行洗脱，加入亚硫酸钠320g，调节pH7.5，温度57℃，洗脱时间0.4小时，洗脱结束后，收集洗脱液。
（9）合并、沉淀：将步骤（7）与步骤（8）收集到的洗脱液合并，用食品级乙醇进行沉淀，上层乙醇度数41度，静置4小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（10）一次氧化：将步骤（9）收集到的沉淀2.58Kg，加入2%的肠衣盐水21.5L进行溶解,溶解后，调节pH10.5，温度28℃，然后加入H2O2进行氧化，先在5分钟内缓慢滴加H2O220ml，然后5分钟内继续滴加H2O230mL,10分钟后加入H2O2100mL，30分钟后加入H2O2200ml，20分钟后加入H2O2250mL，尽量维持pH、温度，共氧化2.5小时。
（11）过滤、沉淀：步骤（10）结束后，将溶液过滤，收集过滤液，用6mol/L的盐酸调pH7.0，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数39度，静置1小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（12）二次氧化：将步骤（11）收集到的沉淀2.39Kg，加入2%的肠衣盐水19.9L进行溶解,溶解后，调节pH11.0，温度27℃，加入H2O2进行氧化，先在5分钟内缓慢滴加H2O220ml，然后5分钟内继续滴加H2O230mL,10分钟后加入H2O2100mL，30分钟后加入H2O2200ml，20分钟后加入H2O2250mL，尽量维持pH、温度，共氧化2.5小时。
（13）过滤、沉淀：步骤（12）结束后，将溶液过滤，收集过滤液，用6mol/L的盐酸调pH7.0，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数39度，静置1小时。上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀。
（14）脱水、烘干：将步骤（13）收集到的沉淀2.23kg，用97度乙醇进行脱水，脱水后的沉淀用双锥进行烘干，即得中品肝素钠。
（15）称量、包装：将步骤（14）中得到的中品肝素钠，进行称量，取样检测。按规格要求，将中品肝素钠进行包装。
本实施例相对于其他实施例而言，这个工艺时间更进一步缩短。
上述树脂为罗门哈斯树脂，肠衣盐是潍坊菜央子盐场生产，该产品中：氯化钠含量≥99.10%，水份含量≤0.30%，水不溶物含量 ≤0.03%，铁（Fe）mg/kg≤5.00，松散剂 mg/kg≤5.00。
Claims (6)
1.一种中品肝素钠的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）溶解：按照3%的肠衣盐水的体积：粗品肝素钠的亿单位10-15:1L/亿单位的比例，将粗品肝素钠溶于3%的肠衣盐水中，搅拌升温至35-40℃，反应；
（2）酶解：用NaOH调节溶液pH 至7.5-8.0，按16g/亿单位的比例向反应液中加入胰酶，控制温度在38-42℃反应；
（3）去除蛋白：调pH 至8.5，升温至55-65℃，按粗品肝素钠质量的20-30%加入氯化钙，反应，继续升温至90-95℃，停止加热，然后降温至35-45℃，进行离心；
（4）去除钙离子：保持溶液温度35-45℃，加入与氯化钙等量的无水碳酸钠，反应，过滤，收集滤液；
（5）沉淀：用盐酸调pH至7.0-7.5，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数38-42度，静置，上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀；
（6）树脂吸附：按照10%-15%浓度加2%肠衣盐水溶解，溶解后，溶液中按2%肠衣盐水的0.06-1% g/ml的比例加入亚硫酸钠，调节pH7.0-7.5，温度55-60℃，按照粗品肝素钠亿单位：树脂体积比1:10亿单位/L的比例加入树脂进行吸附，吸附，吸附结束后，过滤，收集树脂；
（7）洗脱：将所收集到的树脂，用与树脂体积比为1.2-1.5:1的饱和肠衣盐水进行洗脱，溶液中按饱和肠衣盐水的0.06-1% g/ml的比例加入亚硫酸钠，调节pH7.0-7.5，温度55-60℃，洗脱，洗脱结束后，收集洗脱液；
（8）合并、沉淀：将收集到的洗脱液合并，用食品级乙醇进行沉淀，上层乙醇度数38-42度，静置，上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀；
（9）一次氧化：将步骤（8）收集到的沉淀，用2%的肠衣盐水按10%-15%的浓度进行溶解，溶解后，调节pH10.5-11.0，温度25-30℃，加入H2O2进行氧化；
（10）过滤、沉淀：将溶液过滤，收集过滤液，用盐酸调pH7.0-7.5，用食品级乙醇进行沉淀，控制上层乙醇度数38-42度，静置，上层待回收乙醇抽入复沉罐中，收集下层沉淀；
（11）二次氧化：将步骤（10）收集到的沉淀，重复步骤（9）的操作，进行二次氧化；
（12）过滤、沉淀：重复步骤（10）的操作，将溶液进行过滤、沉淀；
（13）脱水、烘干：将步骤（12）收集到的沉淀，用95-100度乙醇进行脱水，脱水后的沉淀用双锥进行烘干，即得中品肝素钠；
（14）称量、包装：将中品肝素钠进行称量，按规格要求，将中品肝素钠进行包装得成品。
2.根据权利要求1所述的中品肝素钠的提取方法，其特征在于：步骤（1）反应时间为2-3小时，步骤（2）反应时间为4-5小时，步骤（6）吸附时间为4-5小时。
3.根据权利要求1或2所述的中品肝素钠的提取方法，其特征在于：所述步骤（3）去除蛋白：调pH 至8.5，升温至60℃，按粗品肝素钠质量的20-30%加入氯化钙，反应0.5小时，继续升温至90-95℃，停止加热，然后降温至35-45℃，进行离心。
4.根据权利要求1或2所述的中品肝素钠的提取方法，其特征在于：所述步骤（6）树脂吸附：将步骤（5）所得沉淀，按照10%-15%浓度加2%肠衣盐水溶解，溶解后，溶液中按2%肠衣盐水的0.06-0.08% g/ml的比例加入亚硫酸钠，调节pH7.0-7.5，温度55-60℃，按照粗品肝素钠亿单位：树脂体积1:10亿单位/L的比例加入树脂进行吸附，吸附4-5小时，吸附结束后，过滤，收集树脂。
5.根据权利要求1或2所述的中品肝素钠的提取方法，其特征在于：所述步骤（7）洗脱：将步骤（6）所收集到的树脂，用与树脂体积比为1.2-1.5:1的饱和肠衣盐水进行洗脱，溶液中按饱和肠衣盐水的0.06-0.08% g/ml的比例加入亚硫酸钠，调节pH7.0-7.5，温度55-60℃，洗脱时间2小时，洗脱结束后，收集洗脱液，然后重复上述步骤，将树脂进行二次洗脱。
6.根据权利要求1或2所述的中品肝素钠的提取方法，其特征在于：所述步骤（9）一次氧化：将收集到的沉淀，用2%的肠衣盐水按10%-15%的浓度进行溶解，溶解后，调节pH10.5-11.0，温度25-30℃，加入溶液体积2%的H2O2进行氧化，H2O2分4次加入，加入时间分别为0小时、1小时、2小时、4小时，维持pH、温度，共氧化24小时。
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