CN108178782A - 一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途 - Google Patents

一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氨基酸序列为Gly‑Met‑Ala‑Gln‑Met‑Ala‑Gly‑Pro‑Pro‑Gly‑Glu的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽在制备补铁保健品中的用途。有益效果为:本发明将鲻鱼鱼鳞铁螯合肽用于制备补铁保健品,该螯合肽与铁所生成的螯合物分子量小,能够顺利通过肠黏膜,大大提高了人体对铁离子的吸收率。

Description

一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途
技术领域
本发明涉及多肽的用途,特别是涉及一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途。
背景技术
铁是人类的必须的微量元素,参加血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化物酶及触酶的合成,与乙酰辅酶A、琥珀酸脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、细胞色素还原酶的活性密切相关。研究证明:缺铁或铁的利用不良时,将导致氧的运输、贮存、二氧化碳的运输及释放、电子的传递、氧化还原等代谢过程紊乱,产生病理变化,最后产生各种疾病。大分子蛋白质虽然也可以与铁离子结合,但铁螯合蛋白质分子量大,难以通过肠黏膜,不利于铁离子的吸收。生物活性肽是指由20个氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能,易消化吸收,食用安全性极高,是当前极具发展前景的功能因子,成为药物及保健品研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途,将鲻鱼鱼鳞铁螯合肽用于制备补铁保健品,可大大提高人体对铁离子的吸收率。
为了达到上述目的,本发明采取的技术方案为:将氨基酸序列为Gly-Met-Ala-Gln-Met-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽用于制备补铁保健品。该肽具有高的铁螯合活性,与铁所生成的螯合物分子量小,能够顺利通过肠黏膜,大大提高了人体对铁离子的吸收。
作为优选,补铁保健品的制备方法为:取12~13份香菇、20~27份乳酸亚铁、16~18份黄豆以及9~11份茯苓在60~100℃蒸煮24~30min,冷却至55~60℃,加入5~8份茶多酚和0.1~0.16份鲻鱼鱼鳞铁螯合肽,接着在25~30W下超声15~20s,再加入4~9份硒化卡拉胶,充分混匀,制粒得补铁保健品。工艺简单,原料易得,成本较低,制备的补铁保健品安全性高,能够有效促进人体对铁的吸收,具有良好的补铁效果。
作为优选,该鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法包括以下步骤:
鲻鱼鱼鳞的预处理:取鲻鱼鱼鳞,加入NaOH溶液脱除非胶原蛋白,再加入EDTA溶液,经浸泡、干燥得脱钙鱼鳞,该条件下,鱼鳞中非胶原蛋白和钙的去除率高,减少了产品铁螯合肽的灰分含量,提高了铁螯合肽的纯度,降低了产品的苦味和腥味;
鲻鱼鱼鳞胶原蛋白的制备:按照料液比1g:5~8mL向脱钙鱼鳞中加入0.5mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡3~5d,12000g离心20~25min后取上清液,加入NaCl至溶液终浓度为0.8~1.0mol/L,静置61~90min,15000g离心15~20 min得沉淀物,冷冻干燥即为鲻鱼鱼鳞胶原蛋白,提取条件温和,不会破坏胶原蛋白的结构,提高了制备的胶原蛋白的生物活性;
鲻鱼鱼鳞的酶解:按照料液比1g:15~20mL向胶原蛋白中加入超纯水,用盐酸调溶液pH到2.0~2.5,按照胶原蛋白质量的0.8%~1.2%向溶液中加入胃蛋白酶(酶活力≥1.6×105U/g),酶解3~5h后,将溶液升温至90℃~95℃,并于此温度保持10~15min后,冷却至室温;用NaOH调溶液pH到9~10,按照蛋白质量的1.0%~1.5%向溶液中加入碱性蛋白酶(2.0×105U/g),45~55℃酶解3~4h,得酶解产物,该条件下,酶的利用度高,单位酶产肽量大,产物的抑制效应小,大大提高了产品中铁螯合肽的提取率;
鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备:将制备的蛋白酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于3kDa部分,得超滤酶解液,超滤酶解液按照体积比加入到装有8~10倍AB-8大孔树脂的层析柱中,用5~8倍柱体积水洗脱除去杂质,然后用3~5倍柱体积的60%乙醇进行洗脱,乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物,胶原肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化,得到鲻鱼鱼鳞铁螯合肽,该条件下,所获得的铁螯合肽纯度高,品质好,为铁螯合肽的应用研究提供了良好的条件。
作为优选,凝胶柱层析过程为:将上述胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10~20mg/mL的溶液,经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分,其中,具有最高铁螯合活性的峰为凝胶层析酶解物,该过程利用不同分子量大小的物质在层析柱中流动速度的不同实现了物质的分离,操作简单,且不影响产物的品质。
作为优选,反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化过程为:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90~100μg/mL的溶液,利用RP-HPLC进行纯化,其中,RP-HPLC条件为:进样量15~20μL,色谱柱为Zorbax C18(250×4.6mm,5μm),流动相为40%甲醇,洗脱速度为0.8~1.0mL/min,紫外检测波长为220nm。该过程利用反向高效液相色谱制备出超高纯度的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:本发明将鲻鱼鱼鳞铁螯合肽用于制备补铁保健品,该螯合肽与铁所生成的螯合物分子量小,能够顺利通过肠黏膜,大大提高了人体对铁离子的吸收率;所公开的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法条件温和,铁螯合肽的提取率高,纯度大,苦味和腥味小,生物活性好,使鲻鱼鱼鳞变废为宝,具有良好的社会经济效益。
附图说明
图1是本发明的葡聚糖凝胶LH-20层析图;
图2是葡聚糖凝胶LH-20制备酶解物的RP-HPLC分析;
图3是本发明制备的铁螯合肽的ESI/MS检测。
具体实施方式
以下结合实施例和附图作进一步详细描述:
实施例1:鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法,包括以下步骤:
1)鲻鱼鱼鳞的预处理:取鲻鱼鱼鳞,按照料液比1g:8mL向鲻鱼鱼鳞中加0.1mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡6h,过滤,脱除非胶原蛋白,处理后鱼鳞用蒸馏水反复洗涤至pH为6.5,沥干,按照料液比1g:13mL加入0.5mol/L EDTA溶液(pH为7.4),于4℃下浸泡4天,每天更换1次EDTA溶液,脱除鱼鳞中的钙,干燥、粉碎,得脱钙鱼鳞;
2)鲻鱼鱼鳞胶原蛋白的制备:按照料液比1g:6mL向脱钙鱼鳞中加入0.5mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡4d,12000g离心20min后取上清液,加入NaCl至溶液终浓度为0.9mol/L,静置75min,15000g离心18min得沉淀物,冷冻干燥即为鲻鱼鱼鳞胶原蛋白;
3)鲻鱼鱼鳞的酶解:按照料液比1g:18mL向胶原蛋白中加入超纯水,用HCl调溶液pH到2.0,按照胶原蛋白质量的1.1%向溶液中加入胃蛋白酶(酶活力≥1.6×105U/g),酶解4h后,将溶液升温至90℃,并于此温度保持12min后,冷却至室温,用NaOH调溶液pH到9.5,按照蛋白质量的1.2%向溶液中加入碱性蛋白酶(2.0×105U/g),于温度48℃下酶解3.5h,得酶解产物;
4)鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备:将制备的蛋白酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于3kDa部分,得超滤酶解液,超滤酶解液按照体积比加入到装有9倍AB-8大孔树脂的层析柱中,用6倍柱体积水洗脱除去杂质,然后用4倍柱体积的60%乙醇进行洗脱,乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇,经冷冻干燥得胶原肽混合物,胶原肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化,得到鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。
其中,凝胶柱层析过程为:将上述胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为20mg/mL的溶液,经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分,其中,具有最高铁螯合活性的峰为凝胶层析酶解物,如图1所示。
反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化过程为:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成50μg/mL的溶液,利用RP-HPLC进行纯化(所述RP-HPLC条件为:进样量15μL;色谱柱为ZorbaxC18(250×4.6mm,5μm);流动相:40%甲醇;洗脱速度0.9mL/min;紫外检测波长220nm),根据对铁的螯合活性得一个高铁螯合活性肽,如图2所示;铁螯合肽经检测为单一峰,利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Met-Ala-Gln-Met-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu,ESI/MS检测分子量为974.12Da,如图3所示。
采用邻菲罗啉比色法,测定鲻鱼鱼鳞胶原肽对铁离子的螯合作用:将0.05g样品置于100mL烧杯中,加入2mL浓盐酸,待样品完全溶解后,用蒸馏水定容至100mL容量瓶中,准确吸取5mL样品液于50mL容量瓶中,加入1mol/L的HCl溶液1mL,10%的盐酸羟胺lmL,0.12%邻菲罗啉1mL,然后加入10%醋酸钠5mL,用水稀释至刻度,摇匀,以不加铁的试剂空白溶液作参比液,在510nm波长处测定吸光度,将数值代入标准曲线中计算出铁结合量。
标准曲线的制作:吸取10μg/mL铁的标准溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL,分别置于50mL容量瓶中,加入lmol/L的HCl溶液1mL,10%的盐酸羟胺lmL,0.12%邻菲罗啉1mL,然后加入10%醋酸钠5mL,用水稀释至刻度,摇匀,以不加铁的试剂空白溶液作参比液,在510nm波长处测定吸光度,绘制标准曲线,得标准曲线公式为:y =0.1673x+0.009,R2 =0.9999。
测定结果表明:纯化得到的铁螯合胶原肽Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met对铁离子的螯合能力为81.06μg/mg,与蛋白酶解产物(42.73μg/mg)相比其对铁的螯合能力有了较大提高。
实施例2:一种氨基酸序列为Gly-Met-Ala-Gln-Met-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽在制备补铁保健品中的用途,具体过程为:取12份香菇、20份乳酸亚铁、16份黄豆以及9份茯苓在60℃蒸煮24min,冷却至55℃,加入5份茶多酚和0.1份鲻鱼鱼鳞铁螯合肽,接着在25W下超声15s,再加入4份硒化卡拉胶,充分混匀,制粒得补铁保健品。工艺简单,原料易得,成本较低,制备的补铁保健品安全性高,能够有效促进人体对铁的吸收,具有良好的补铁效果。
实施例3:一种氨基酸序列为Gly-Met-Ala-Gln-Met-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽在制备补铁保健品中的用途,具体过程为:取12份香菇、24份乳酸亚铁、17份黄豆以及11份茯苓在70℃蒸煮26min,冷却至57℃,加入6份茶多酚和0.14份鲻鱼鱼鳞铁螯合肽,接着在26W下超声17s,再加入0.01份戊酸乙酯以及0.013份二巯基丁二酸,在30W下超声40s,最后加入9份硒化卡拉胶,充分混匀,制粒得补铁保健品。工艺简单,原料易得,成本较低,制备的补铁保健品安全性高,具有良好的补铁效果;所加入的戊酸乙酯、二巯基丁二酸与茶多酚具有协同作用,提高了螯合肽与铁离子反应生成螯合物的速率,增大了体内螯合物的含量,使更多的铁离子能够以螯合物的形式通过肠黏膜,进一步提高了人体对铁离子的吸收率。
实施例4:一种氨基酸序列为Gly-Met-Ala-Gln-Met-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽在制备补铁保健品中的用途,具体过程为:取13份香菇、27份乳酸亚铁、18份黄豆以及11份茯苓在100℃蒸煮30min,冷却至60℃,加入8份茶多酚和0.16份鲻鱼鱼鳞铁螯合肽,接着在30W下超声20s,再加入9份硒化卡拉胶,充分混匀,制粒得补铁保健品。本发明制备的补铁保健品,结合养生学理论知识,对原料进行搭配和配比,全面协调地调理机体,使人体能够有效补充铁,调动人体免疫功能,增强人体抵抗疾病的能力。
实施例5:一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法,包括以下步骤:
1)鲻鱼鱼鳞的预处理:同实施例1的步骤1)一致;
2)鲻鱼鱼鳞胶原蛋白的制备:按照料液比1g:5mL向脱钙鱼鳞中加入0.5mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡3d,12000g离心20min后取上清液,加入NaCl至溶液终浓度为0.8mol/L,静置61min,15000g离心15min得沉淀物,冷冻干燥即为鲻鱼鱼鳞胶原蛋白;
3)鲻鱼鱼鳞的酶解:按照料液比1g:15mL向胶原蛋白中加入超纯水,用盐酸调溶液pH到2.0,按照胶原蛋白质量的0.8%向溶液中加入胃蛋白酶(酶活力≥1.6×105 U/g),酶解3h后,将溶液升温至90℃,并于此温度保持10min后,冷却至室温,用NaOH调溶液pH到9,按照蛋白质量的1.0%向溶液中加入碱性蛋白酶(2.0×105 U/g),45℃酶解3h,得酶解产物;
4)鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备:将制备的蛋白酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于3kDa部分,得超滤酶解液,超滤酶解液按照体积比加入到装有8倍AB-8大孔树脂的层析柱中,用5倍柱体积水洗脱除去杂质,然后用3倍柱体积的60%乙醇进行洗脱,乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物,胶原肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化,得到鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。
其中,凝胶柱层析过程为:将上述胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10mg/mL的溶液,经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分,其中,具有最高铁螯合活性的峰为凝胶层析酶解物。
反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化过程为:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90μg/mL的溶液,利用RP-HPLC进行纯化,其中,RP-HPLC条件为:进样量15μL,色谱柱为Zorbax C18(250×4.6mm,5μm),流动相为40%甲醇,洗脱速度为0.8mL/min,紫外检测波长为220nm。该过程利用反向高效液相色谱制备出超高纯度的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。
实施例6:一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法,包括以下步骤:
1)鲻鱼鱼鳞的预处理:同实施例1的步骤1)一致;
2)鲻鱼鱼鳞胶原蛋白的制备:按照料液比1g:8mL向脱钙鱼鳞中加入0.5mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡5d,12000g离心25min后取上清液,加入NaCl至溶液终浓度为1.0mol/L,静置90min,15000g离心20min得沉淀物,冷冻干燥即为鲻鱼鱼鳞胶原蛋白;
3)鲻鱼鱼鳞的酶解:按照料液比1g:20mL向胶原蛋白中加入超纯水,用盐酸调溶液pH到2.5,按照胶原蛋白质量的1.2%向溶液中加入胃蛋白酶(酶活力≥1.6×105 U/g),酶解5h后,将溶液升温至95℃,并于此温度保持15min后,冷却至室温,用NaOH调溶液pH到10,按照蛋白质量的1.5%向溶液中加入碱性蛋白酶(2.0×105 U/g),55℃酶解4h,得酶解产物;
4)鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备:将制备的蛋白酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于3kDa部分,得超滤酶解液,超滤酶解液按照体积比加入到装有10倍AB-8大孔树脂的层析柱中,用8倍柱体积水洗脱除去杂质,然后用5倍柱体积的60%乙醇进行洗脱,乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物,胶原肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化,得到鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。
其中,凝胶柱层析过程同实施例1一致。
反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化过程为:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成100μg/mL的溶液,利用RP-HPLC进行纯化,其中,RP-HPLC条件为:进样量20μL,色谱柱为Zorbax C18(250×4.6mm,5μm),流动相为40%甲醇,洗脱速度为1.0mL/min,紫外检测波长为220nm。该过程利用反向高效液相色谱制备出超高纯度的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。
以上实施方式仅用于说明本发明,而并非对本发明的限制,本领域的普通技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,还可以做出各种变化和变型。因此,所有等同的技术方案也属于本发明的范畴,本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 鲻鱼(Mugil cephalus)
<400> 1
Gly Met Ala Gln Met Ala Gly Pro Pro Gly Glu
1 5 10

Claims (9)

1.一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途,其特征在于氨基酸序列为Gly-Met-Ala-Gln-Met-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽用于制备补铁保健品的用途。
2.根据权利要求1所述的一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途,其特征在于:所述补铁保健品的制备方法为:取12~13份香菇、20~27份乳酸亚铁、16~18份黄豆以及9~11份茯苓在60~100℃蒸煮24~30min,冷却至55~60℃,加入5~8份茶多酚和0.1~0.16份鲻鱼鱼鳞铁螯合肽,接着在25~30W下超声15~20s,再加入4~9份硒化卡拉胶,充分混匀,制粒得补铁保健品。
3.根据权利要求1所述的一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途,其特征在于:所述鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法包括以下步骤:
1)鲻鱼鱼鳞的预处理:取鲻鱼鱼鳞,加入NaOH溶液脱除非胶原蛋白,再加入EDTA溶液,经浸泡、干燥得脱钙鱼鳞;
2)鲻鱼鱼鳞胶原蛋白的制备:向脱钙鱼鳞中加入乙酸溶液并在4℃浸泡,分离得上清液,对上清液进行盐析,经分离得鲻鱼鱼鳞胶原蛋白;
3)鲻鱼鱼鳞的酶解:向胶原蛋白中加入超纯水,用盐酸调溶液pH为2.0~2.5,加入胃蛋白酶酶解,将溶液升温至90℃~95℃,保持10~15min,冷却至室温,用NaOH调溶液pH为9~10,加入碱性蛋白酶酶解,得酶解产物;
4)鲻鱼鱼鳞铁螯合胶原肽的制备:通过3kDa超滤膜对酶解产物进行超滤,收集分子量小于3kDa部分,经树脂层析柱纯化得胶原肽混合物,胶原肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化,得到鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。
4.根据权利要求3所述的一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途,其特征在于:所述步骤2)中乙酸溶液的浓度为0.5mol/L,乙醇溶液与脱钙鱼鳞的料液比为1g:5~8mL。
5.根据权利要求3所述的一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途,其特征在于:所述步骤3)中胃蛋白酶的加入量为胶原蛋白质量的0.8%~1.2%,碱性蛋白酶的加入量为胶原蛋白质量的1.0%~1.5%。
6.根据权利要求3所述的一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途,其特征在于:所述步骤3)中在加入碱性蛋白酶后,在45~55℃酶解3~4h。
7.根据权利要求3所述的一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途,其特征在于:所述步骤3)中胶原蛋白与超纯水的料液比为1g:15~20mL。
8.根据权利要求3所述的一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途,其特征在于:所述步骤4)中凝胶柱层析过程为:将上述胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10~20mg/mL的溶液,经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分,其中,具有最高铁螯合活性的峰为凝胶层析酶解物。
9.根据权利要求3所述的一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的用途,其特征在于:所述步骤4)中反相高效液相色谱纯化过程为:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90~100μg/mL的溶液,利用RP-HPLC进行纯化,其中,反相高效液相色谱纯化条件为:进样量15~20μL,色谱柱为Zorbax C18,流动相为40%甲醇,洗脱速度为0.8~1.0mL/min,紫外检测波长为220nm。
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