CN116694711A - 一种高纯度牡蛎肽的制备方法 - Google Patents

一种高纯度牡蛎肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高纯度牡蛎肽的制备方法，属于牡蛎深加工领域。本发明方法包括：牡蛎原料清洗除杂；牡蛎原料爆炸减压辅助碱法制浆，得到牡蛎匀浆；牡蛎匀浆脱脂、碱提酸沉提取牡蛎蛋白；牡蛎蛋白复合酶酶解处理，制备牡蛎小分子肽；真空MCPA系统与旋转柱联合纯化牡蛎小分子肽，获得纯化后的牡蛎肽；膜设备进一步纯化、过滤；减压浓缩；喷雾干燥，得到成品；其中，爆炸减压辅助碱法制浆是指将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，加入水和碱，并通入氧气，在一定温度下搅拌一定时间，得到牡蛎匀浆。本发明方法生产工艺简单、便捷，时间短，可规模化生产，在真空辅助MCPA系统与旋转柱高效纯化牡蛎肽，可获得高纯度的牡蛎肽。

Description

一种高纯度牡蛎肽的制备方法
技术领域
本发明属于牡蛎深加工领域，特别涉及一种高纯度牡蛎肽的制备方法。
背景技术
牡蛎又称为生蚝，属于软体动物门、瓣鳃纲、异柱目、牡蛎科，是世界第一大养殖贝类，也是我国四大养殖贝类之一。牡蛎中含有丰富的营养物质，如蛋白质、糖原、人体必需的8种氨基酸、维生素以及锌、硒、铁、铜、碘等微量元素，尤其是含有丰富的牛磺酸，是一种营养价值极高的海产软体类动物，同时牡蛎也被我国卫生部批准第一批列为既是药品又可作为食品的保健疗效品。牡蛎肽是新鲜去壳的牡蛎经酶解、分离、精制和干燥等加工过程而制得的相对分子量在200～5000Da的小分子低聚肽，分子量一般在1000Da以下的多肽称作寡肽、低聚肽，或称为小分子活性肽，一般由2～6个氨基酸组成。牡蛎肽具有良好的抗过敏性和低致敏性，牡蛎肽还有促进生长发育、抗光老化和衰老、改善男性生殖功能等功能特性，如今市场上存在的牡蛎肽产品形式还较为单一，主要有固体饮料、压片糖果、片剂、胶囊剂。因为牡蛎生物活性肽具有特殊的生理作用和极高的营养价值，牡蛎活性肽必将为食品、药品产业注入发展活力。
与牡蛎蛋白相比，牡蛎肽具有优良的理化特性：活性更高，在微量和低浓度的情况下，都能发挥其独特的生理作用；分子质量小，不需消化，可直接被小肠吸收；低渗透压，摄入牡蛎多肽不会导致腹泻。研究表明：蛋白质经酶解后形成的二肽和三肽可以不经消化，能够迅速被吸收，比游离氨基酸的吸收率提高2～2.5倍，具有更高的营养价值和生理功能。
随着广大消费者对高质量海洋食品的需求提高，传统加工技术已无法满足人类需求，因此，功能性牡蛎产品的开发与研究，是牡蛎深加工行业面临的一个严峻挑战，酶解技术制备得到海洋生物的小肽，因其分子量小、生物效价高、生理活性好、稳定性好、安全易携带等优势而受到广泛关注，但是如何制备高蛋白、高纯度的牡蛎肽产品也是牡蛎发展遇到的困难。目前的牡蛎肽制备工艺提取效率低，牡蛎肽纯化工艺复杂费时，得到的产品纯度低，杂质较多。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种高纯度牡蛎肽的制备方法，其生产工艺简单、便捷，时间短，可规模化生产，在真空辅助MCPA系统与旋转柱的条件高效纯化牡蛎肽，再通过助滤剂辅助膜设备进一步的纯化与浓缩，可获得高纯度的牡蛎肽。
本发明采用的技术方案：
本发明提供一种制备高纯度牡蛎肽的方法，包括以下步骤：
(1)牡蛎原料清洗除杂；
(2)牡蛎原料爆炸减压辅助碱法制浆，得到牡蛎匀浆；
(3)牡蛎匀浆脱脂、碱提酸沉提取牡蛎蛋白；
(4)牡蛎蛋白复合酶酶解处理，制备牡蛎小分子肽；
(5)真空MCPA系统与旋转柱联合纯化牡蛎小分子肽，获得纯化后的牡蛎肽；
(6)膜设备进一步纯化、过滤；
(7)减压浓缩；喷雾干燥，得到成品；
其中，所述爆炸减压辅助碱法制浆是指将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，加入水和碱，并通入氧气，在一定温度下搅拌一定时间，得到牡蛎匀浆。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，操作步骤优选为：新鲜牡蛎清洗、除杂，使用水进行浸泡，浸泡时间为1-2小时，浸泡结束后清洗干净。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述爆炸减压辅助碱法制浆具体为：将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，原料与水的比例为1:5-1:15g/mL，添加牡蛎原料质量5％-10％的碱液，在反应釜中通入氧气，氧压为1.0-2.0MPa，将其升温至150-180℃，在150-200r/min下搅拌2-3h，反应结束后得到牡蛎匀浆。优选的，所述碱液为氢氧化钠或氢氧化钾的任一种，优选氢氧化钠。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述脱脂是指使用石油醚对牡蛎匀浆进行脱脂处理。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，脱脂过程中，所述石油醚与牡蛎匀浆的体积比为1:5-1:15，脱脂后进行离心，沉淀即为脱脂后的牡蛎原料；
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述碱提酸沉提取牡蛎蛋白是将脱脂后的牡蛎原料以料液比1:10-1:20的比例进行加水混合，搅拌均匀，将pH调至10-12，碱提温度为40-60℃，碱提时间为2-4小时；将碱提后的牡蛎蛋白pH调节至3.5-5.0，冷藏放置，酸沉结束后进行离心处理，沉淀即为牡蛎蛋白。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述碱提酸沉提取牡蛎蛋白中的冷藏放置的温度为4-10℃。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，所述蛋白复合酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶，其中，中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1-2:1-2:2。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，酶解处理中，料液比范围为1:10～1:30g/mL，复合酶的用量为原料质量的0.3％～0.8％，酶解温度为50-60℃，酶解pH为6.5～7.5，酶解时间为2～5小时。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述真空MCPA系统是在重力或真空下同时纯化毫克不同的蛋白质.
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述真空MCPA系统主要由以下组件组成：安捷伦技术公司的板材主要包括：96孔长滴注板、96孔板密封/垫、可穿透、2mL/井收集板、5mL/孔收集板、储层收集板。12mL色谱柱；中继器配备了5个mL和50个mL的注射器；Sigma-Aldrich公司的真空歧管启动套件包、真空安全瓶，真空范围从-300mBar到600mBar；4L的废物收集瓶等。其中长滴过滤板是真空MCPA系统的主体，提供0.25μm过滤器。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，将牡蛎肽陶瓷膜清液注入到真空MCPA系统，系统配制为18-24柱，流速为1.0-2.0mL/min，时间为0.3-0.5小时，反复纯化2-3次；再加入到整体硅胶盘十八烷基甲硅烷基部分修饰的填充旋转柱中，以梯度浓度的乙醇作为洗脱溶剂，将纯化后的蛋白进行收集，得到纯化后的牡蛎肽。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述乙醇的浓度梯度为10～90％，优选为10％、30％、50％、70％、90％，收集50％与70％浓度下的纯化液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(6)中，将牡蛎肽精制液使用膜设备进行过滤，其中，膜设备的孔径依次为200nm、0.05μm。
在本发明的一种实施方式中，步骤(6)中，过滤过程中优选添加复合助滤剂辅助过膜，所述助滤剂为泊洛沙姆188、泊洛沙姆f-127、泊洛沙姆407、泊洛沙姆L-65的任一种，优选为上述助滤剂的两种及以上的组合。
在本发明的一种实施方式中，步骤(6)中，所述助滤剂为的加入量为料液体积的5％-8％。
在本发明的一种实施方式中，步骤(7)中，所述减压浓缩的操作参数为浓缩温度为60℃-70℃，真空压力为-0.1MPa。
在本发明的一种实施方式中，其进一步的技术方案如下：
(1)牡蛎原料清洗除杂：新鲜牡蛎清洗、除杂，使用去离子水进行浸泡，浸泡时间为1小时，浸泡结束后清洗干净；
(2)牡蛎原料爆炸减压辅助碱法制浆：将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，原料与水的比例为1:5，添加5％-10％氢氧化钠，在反应釜中通入氧气，氧压为1.0MPa，将其升温至180℃，在150r/min下搅拌2h，反应结束后得到牡蛎匀浆；
(3)碱提酸沉提取牡蛎蛋白：使用石油醚对牡蛎匀浆进行脱脂处理，石油醚与牡蛎匀浆的体积比为1:5，脱脂后进行离心，沉淀即为脱脂后的牡蛎原料；将脱脂后的牡蛎原料以料液比1:10的比例进行加水混合，搅拌均匀，将pH调至10-12，碱提温度为40-60℃，碱提时间为2-4小时；将碱提后的牡蛎蛋白pH调节至3.5-5.0，冷藏放置，酸沉结束后进行离心处理，沉淀即为牡蛎蛋白；
(4)牡蛎蛋白复合酶酶解：料液比范围为1:10～1:30g/mL，复合酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶，中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:1:2，复合酶的用量为0.3％～0.8％，酶解温度为50-60℃，酶解pH为6.5～7.5，酶解时间为2～5小时，酶解结束后，使用陶瓷膜设备进行过滤，获得牡蛎肽陶瓷膜清液；
(5)真空MCPA系统与旋转柱联合纯化：将牡蛎肽陶瓷膜清液注入到真空MCPA系统，系统配制为24柱，流速为1.0mL/min，时间为0.5小时，反复纯化2次；再加入到整体硅胶盘十八烷基甲硅烷基部分修饰的填充旋转柱中，以梯度浓度的乙醇作为洗脱溶剂，将纯化后的蛋白进行收集，得到牡蛎肽精制液；
(6)将牡蛎肽精制液使用膜设备进行过滤膜设备的孔径分别为200nm、0.05μm，添加复合助滤剂辅助过膜，得到牡蛎肽溶液；
(7)将牡蛎肽溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到牡蛎肽产品。
与现有技术相比，本发明技术方案带来的有益技术效果主要有：
(1)本发明采用爆炸减压辅助碱法制浆的方式，使蛋白提取率增加30％以上；
(2)本发明选择真空MCPA系统与旋转柱联合纯化，可有效去除杂质，蛋白纯度可达95％以上；
(3)本发明筛选助滤剂辅助膜设备进行过滤，提高膜通量，缩短过膜时间。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步描述本发明所述的改性水热生物炭的制备以及效果。同时说明，这些实施例所叙述的技术内容是说明性的，而不是限定性的，不应依此来局限本发明的保护范围。
中性蛋白酶购自山东隆科特酶制剂有限公司，型号：酶活5万u/mL；碱性蛋白酶购自山东隆科特酶制剂有限公司，型号：酶活20万u/mL；风味蛋白酶购自南宁庞博生物工程有限公司，型号：酶活2万u/g。
真空MCPA系统主要配件：长滴过滤板以及收集器等购自安捷伦技术公司；真空歧管启动套件包购自Sigma-Aldrich公司。
十八烷基甲硅烷基硅胶填料购自麦克林生物科技有限公司；旋转柱购自艾美捷生物科技有限公司，型号：10K(25ea)。
纯度测量方式：蛋白含量测定：GB5009.5-2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定：称取充分混匀的固体试样0.2g～2g、半固体试样2g～5g或液体试样10g～25g(约当于30mg～40mg氮)，精确至0.001g，至消化管中，再加入催化剂、12mL硫酸，于消化炉进行消化。当消化炉温度达到420℃之后，继续消化1.5h，此时消化管中的液体呈绿色透明状，取出冷却后，于自动凯氏定氮仪(使用前加入氢氧化钠溶液，盐酸或硫酸标准溶液以及含有混合指示剂A或B的硼酸溶液)上实现自动加液、蒸馏、滴定和记录滴定数据的过程。
多肽含量测定：
1、仪器和材料：高效液相色谱仪：配有紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱工作站或积分仪；色谱柱：TSKgelG2000SWXL.300mm×7.8mm(内径)或性能与此相近的同类型其他适用于测定蛋白质和肽的凝胶柱；电子天平：精度0.0001g；三氟乙酸：分析纯；乙腈：色谱纯；流动相真空抽滤脱气装置；标准品：细胞色素C(cyyochrome，Mr12500)、抑酞酶(aprotinin，Mr6500)、杆菌酶(bacitracin，Mr1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mr451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mr189)；超纯水；超声波振荡器。
2、工作条件：流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝45:55:0.1(体积比)；检测波长：220nm；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样体积：10μL；检测时间：30min。；
3、测定步骤
标准曲线的配制：分别用流动相配制成0.1％(质量浓度)的上述不同相对分子质量的肽标准品溶液用孔径为0.2μm～0.5μm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后分别进样得到系列标准品的色谱图。以相对分子质量的对数(lgMr)对保留时间作图或作线性回归得到相对分子质量校正曲线及其方程。
操作：称取样品20.0mg于10mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声振荡10min使样品充分溶解混匀，用孔径为0.2μm～0.5μm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后，上机进样。
结果计算：用GPC数据处理软件，将样品的色谱数据代入校正曲线方程中进行计算即可得到样品中肽的相对分子质量及其分布范围。用峰面积归一化法计算相对分子质量范围在1000u以下的蛋白质水解物的峰面积相对百分比之和。
蛋白提取率的计算公式：
实施例1
1、新鲜牡蛎清洗、去除杂质，使用去离子水进行浸泡，浸泡时间为1小时，浸泡结束后清洗干净。
2、分别选择普通研磨方式与爆炸减压辅助碱法制浆方式，普通研磨方式即将清洗过的牡蛎原料放置于研磨器中，研磨成匀浆即可。爆炸减压辅助碱法制浆是将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，原料与水的比例为1:5，添加5％氢氧化钠，在反应釜中通入氧气，氧压为1.0MPa，将其升温至180℃，在150r/min下搅拌2h，反应结束后得到牡蛎匀浆。
3、使用石油醚对得到的两种牡蛎匀浆进行脱脂处理，石油醚与牡蛎匀浆的体积比为1:5，脱脂后进行离心，沉淀即为脱脂后的牡蛎原料；将脱脂后的牡蛎原料以料液比1:10的比例进行加水混合，搅拌均匀，将pH调至12，碱提温度为50℃，碱提时间为2小时；将碱提后的牡蛎蛋白pH调节至5.0，4℃静置3小时，酸沉结束后进行离心处理，沉淀即为牡蛎蛋白。
4、按照料液比范围为1:10g/mL在牡蛎蛋白中加入水，复合酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶，中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:1:2，复合酶的用量为0.3％，酶解温度为50℃，酶解pH为6.5，酶解时间为3小时，之后使用陶瓷膜设备进行过滤，获得牡蛎肽陶瓷膜清液。
5、将牡蛎肽陶瓷膜清液注入到真空MCPA系统，系统配制为24柱，流速为1.0mL/min，时间为0.5小时，反复纯化2次；再加入到整体硅胶盘十八烷基甲硅烷基部分修饰的填充旋转柱中，样品纯化结束后，先使用去离子水进行冲洗，再以梯度浓度的乙醇作为洗脱溶剂，乙醇浓度梯度分别为10％、30％、50％、70％、90％，主要收集50％与70％浓度下的纯化液，进行减压浓缩回收乙醇，得到牡蛎肽精制液。
6、将牡蛎肽精制液使用膜设备进行过滤膜设备的孔径分别为200nm、0.05μm，添加由泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127两种组合的助滤剂辅助过膜，其中泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127的质量比为2:1，添加量为料液体积的5％，得到牡蛎肽溶液。
7、将牡蛎肽溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到牡蛎肽产品。
计算两种研磨方式下制备得到的牡蛎蛋白提取率，结果见表1。可见，采用爆炸减压辅助碱法制浆的蛋白提取率高达94.3％，而普通研磨得到的蛋白提取率仅为58.7％。可见，本发明采用爆炸减压辅助碱法制浆能够明显提高蛋白提取率，提高了35％以上。
表1不同研磨制浆方式下的牡蛎蛋白提取率
编号 研磨方式 蛋白提取率(％)
1 普通研磨 58.7
2 爆炸减压辅助碱法制浆 94.3
实施例2
1、新鲜牡蛎清洗、去除杂质，使用去离子水进行浸泡，浸泡时间为1小时，浸泡结束后清洗干净。
2、将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，原料与水的比例为1:5，添加5％氢氧化钠，在反应釜中通入氧气，氧压为1.0MPa，将其升温至180℃，在150r/min下搅拌2h，反应结束后得到牡蛎匀浆。
3、使用石油醚对牡蛎匀浆进行脱脂处理，石油醚与牡蛎匀浆的体积比为1:5，脱脂后进行离心，沉淀即为脱脂后的牡蛎原料；将脱脂后的牡蛎原料以料液比1:10的比例进行加水混合，搅拌均匀，将pH调至12，碱提温度为50℃，碱提时间为2小时；将碱提后的牡蛎蛋白pH调节至5.0，4℃静置3小时，酸沉结束后进行离心处理，沉淀即为牡蛎蛋白。
4、按照料液比范围为1:10g/mL在牡蛎蛋白中加入水，复合酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶，中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:1:2，复合酶的用量为0.3％，酶解温度为50℃，酶解pH为6.5，酶解时间为3小时。使用陶瓷膜设备进行过滤，获得牡蛎肽陶瓷膜清液。
5、将牡蛎肽陶瓷膜清液注入到真空MCPA系统，系统配制为24柱，流速为1.0mL/min，时间为0.5小时，反复纯化2次；再加入到整体硅胶盘十八烷基甲硅烷基部分修饰的填充旋转柱中，样品纯化结束后，先使用去离子水进行冲洗，再以梯度浓度的乙醇作为洗脱溶剂，乙醇浓度梯度分别为10％、30％、50％、70％、90％，主要收集50％与70％浓度下的纯化液，进行减压浓缩回收乙醇，得到牡蛎肽精制液。
6、将牡蛎肽精制液使用膜设备进行过滤膜设备的孔径分别为200nm、0.05μm，分别添加硅藻土或由泊洛沙姆188、泊洛沙姆f-127、泊洛沙姆407、泊洛沙姆L-65其中的一种或两种组合的助滤剂辅助过膜，其中泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127、泊洛沙姆407、泊洛沙姆L-65的质量比均为2:1，添加量均为料液体积的5％，得到牡蛎肽溶液。
7、将牡蛎肽溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到牡蛎肽产品。
考察步骤6中是否加入助滤剂以及加入助滤剂的种类对于膜过滤的膜通量的影响，结果见下表2，可见，单独加入泊洛沙姆188、泊洛沙姆f-127、泊洛沙姆407、泊洛沙姆L-65此类助滤剂均能明显提高膜通量，单独加入泊洛沙姆188的效果最好，膜通量可达72.95L/m2·h。但，如果将助滤剂两两混合则能够进一步提高膜通量，膜通量可提高至88L/m2·h，远高于未使用助滤剂的膜通量。可见，助滤剂的加入能够大大缩短工艺时间。
表2不同助滤剂加入对膜通量的影响
实施例3
1、新鲜牡蛎清洗、去除杂质，使用去离子水进行浸泡，浸泡时间为1小时，浸泡结束后清洗干净。
2、将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，原料与水的比例为1:5，分别添加5％、10％氢氧化钠，在反应釜中通入氧气，氧压为1.0MPa，将其升温至180℃，在150r/min下搅拌2h，反应结束后得到牡蛎匀浆。
3、使用石油醚对牡蛎匀浆进行脱脂处理，石油醚与牡蛎匀浆的体积比为1:5，脱脂后进行离心，沉淀即为脱脂后的牡蛎原料；将脱脂后的牡蛎原料以料液比1:10的比例进行加水混合，搅拌均匀，将pH调至12，碱提温度为50℃，碱提时间为2小时；将碱提后的牡蛎蛋白pH调节至5.0，4℃静置3小时，酸沉结束后进行离心处理，沉淀即为牡蛎蛋白。
4、按照料液比范围为1:10g/mL在牡蛎蛋白中加入水，复合酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶，中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:1:2，复合酶的用量为0.3％，酶解温度为50℃，酶解pH为6.5，酶解时间为3小时。使用陶瓷膜设备进行过滤，获得牡蛎肽陶瓷膜清液。
5、将牡蛎肽陶瓷膜清液注入到真空MCPA系统，系统配制为24柱，流速为1.0mL/min，时间为0.5小时，反复纯化2次；再加入到整体硅胶盘十八烷基甲硅烷基部分修饰的填充旋转柱中，样品纯化结束后，先使用去离子水进行冲洗，再以梯度浓度的乙醇作为洗脱溶剂，乙醇浓度梯度分别为10％、30％、50％、70％、90％，主要收集50％与70％浓度下的纯化液，进行减压浓缩回收乙醇，得到牡蛎肽精制液。
6、将牡蛎肽精制液使用膜设备进行过滤膜设备的孔径分别为200nm、0.05μm，添加由泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127两种组合的助滤剂辅助过膜，其中泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127的质量比为2:1，添加量为料液体积的8％，得到牡蛎肽溶液。
7、将牡蛎肽溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到牡蛎肽产品。
计算添加不同的碱用量时制备得到的牡蛎蛋白提取率，结果见表3。可见，采用5％或10％的氢氧化钠加入量时的蛋白提取率变化不大，且添加5％的氢氧化钠时蛋白提取率略高。因此，考虑成本，优选添加5％的氢氧化钠。
表3氢氧化钠加入量下的牡蛎蛋白提取率
编号 氢氧化钠添加量(％) 蛋白提取率(％)
1 5 94.6
2 10 92.3
实施例4
1、新鲜牡蛎清洗、去除杂质，使用去离子水进行浸泡，浸泡时间为1小时，浸泡结束后清洗干净。
2、将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，原料与水的比例为1:5，添加5％氢氧化钠，在反应釜中通入氧气，氧压为1.0MPa，将其升温至180℃，在150r/min下搅拌2h，反应结束后得到牡蛎匀浆。
3、使用石油醚对牡蛎匀浆进行脱脂处理，石油醚与牡蛎匀浆的体积比为1:5，脱脂后进行离心，沉淀即为脱脂后的牡蛎原料；将脱脂后的牡蛎原料以料液比1:10的比例进行加水混合，搅拌均匀，将pH调至12，碱提温度为50℃，碱提时间为2小时；将碱提后的牡蛎蛋白pH调节至5.0，4℃静置3小时，酸沉结束后进行离心处理，沉淀即为牡蛎蛋白。
4、按照料液比范围为1:10g/mL在牡蛎蛋白中加入水，复合酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶，中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为2:1:2，复合酶的用量为0.3％，酶解温度为50℃，酶解pH为6.5，酶解时间为3小时。使用陶瓷膜设备进行过滤，获得牡蛎肽陶瓷膜清液。
5、将牡蛎肽陶瓷膜清液注入到真空MCPA系统，系统配制为24柱，流速为1.0mL/min，时间为0.5小时，反复纯化2次；再加入到整体硅胶盘十八烷基甲硅烷基部分修饰的填充旋转柱中，样品纯化结束后，先使用去离子水进行冲洗，再以梯度浓度的乙醇作为洗脱溶剂，乙醇浓度梯度分别为10％、30％、50％、70％、90％，主要收集50％与70％浓度下的纯化液，进行减压浓缩回收乙醇，得到牡蛎肽精制液。
6、将牡蛎肽精制液使用膜设备进行过滤膜设备的孔径分别为200nm、0.05μm，添加由泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127两种组合的助滤剂辅助过膜，其中泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127的质量比为2:1，添加量为料液体积的5％，得到牡蛎肽溶液。
7、将牡蛎肽溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到牡蛎肽产品。
8、该方法的蛋白提取率为94.5％，得到的牡蛎肽分子量小于500Da，纯度为97.3％。
实施例5
1、新鲜牡蛎清洗、去除杂质，使用去离子水进行浸泡，浸泡时间为1小时，浸泡结束后清洗干净。
2、将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，原料与水的比例为1:5g/mL，添加5％氢氧化钠，在反应釜中通入氧气，氧压为1.0MPa，将其升温至180℃，在150r/min下搅拌2h，反应结束后得到牡蛎匀浆。
3、使用石油醚对牡蛎匀浆进行脱脂处理，石油醚与牡蛎匀浆的体积比为1:5，脱脂后进行离心，沉淀即为脱脂后的牡蛎原料；将脱脂后的牡蛎原料以料液比1:10的比例进行加水混合，搅拌均匀，将pH调至10，碱提温度为40℃，碱提时间为5小时；将碱提后的牡蛎蛋白pH调节至3.5，4℃静置3小时，酸沉结束后进行离心处理，沉淀即为牡蛎蛋白。
4、按照料液比范围为1:10g/mL在牡蛎蛋白中加入水，复合酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶，中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:1:2，复合酶的用量为0.3％，酶解温度为50℃，酶解pH为6.5，酶解时间为3小时。使用陶瓷膜设备进行过滤，获得牡蛎肽陶瓷膜清液。
5、将牡蛎肽陶瓷膜清液注入到真空MCPA系统，系统配制为24柱，流速为1.0mL/min，时间为0.5小时，反复纯化2次；再加入到整体硅胶盘十八烷基甲硅烷基部分修饰的填充旋转柱中，样品纯化结束后，先使用去离子水进行冲洗，再以梯度浓度的乙醇作为洗脱溶剂，乙醇浓度梯度分别为10％、30％、50％、70％、90％，主要收集50％与70％浓度下的纯化液，进行减压浓缩回收乙醇，得到牡蛎肽精制液。
6、将牡蛎肽精制液使用膜设备进行过滤膜设备的孔径分别为200nm、0.05μm，添加由泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127两种组合的助滤剂辅助过膜，其中泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127的质量比为2:1，添加量为料液体积的5％，得到牡蛎肽溶液。
7、将牡蛎肽溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到牡蛎肽产品。
8、该方法的蛋白提取率为90.8％，得到的牡蛎肽分子量小于500Dal，纯度为96.7％。
实施例6
1、新鲜牡蛎清洗、去除杂质，使用去离子水进行浸泡，浸泡时间为1小时，浸泡结束后清洗干净。
2、将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，原料与水的比例为1:5，添加5％氢氧化钠，在反应釜中通入氧气，氧压为1.0MPa，将其升温至180℃，在150r/min下搅拌2h，反应结束后得到牡蛎匀浆。
3、使用石油醚对牡蛎匀浆进行脱脂处理，石油醚与牡蛎匀浆的体积比为1:5，脱脂后进行离心，沉淀即为脱脂后的牡蛎原料；将脱脂后的牡蛎原料以料液比1:10的比例进行加水混合，搅拌均匀，将pH调至12，碱提温度为60℃，碱提时间为2小时；将碱提后的牡蛎蛋白pH调节至5.0，4℃静置3小时，酸沉结束后进行离心处理，沉淀即为牡蛎蛋白。
4、按照料液比范围为1:10g/mL在牡蛎蛋白中加入水，复合酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶，中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:1:2，复合酶的用量为0.3％，酶解温度为50℃，酶解pH为6.5，酶解时间为3小时。使用陶瓷膜设备进行过滤，获得牡蛎肽陶瓷膜清液。
5、将牡蛎肽陶瓷膜清液注入到真空MCPA系统，系统配制为24柱，流速为1.0mL/min，时间为0.5小时，反复纯化2次；再加入到整体硅胶盘十八烷基甲硅烷基部分修饰的填充旋转柱中，样品纯化结束后，先使用去离子水进行冲洗，再以梯度浓度的乙醇作为洗脱溶剂，乙醇浓度梯度分别为10％、30％、50％、70％、90％，主要收集50％与70％浓度下的纯化液，进行减压浓缩回收乙醇，得到牡蛎肽精制液。
6、将牡蛎肽精制液使用膜设备进行过滤膜设备的孔径分别为200nm、0.05μm，添加由泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127两种组合的助滤剂辅助过膜，其中泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127的质量比为2:1，添加量为料液体积的5％，得到牡蛎肽溶液。
7、将牡蛎肽溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到牡蛎肽产品。
8、该方法的蛋白提取率为93.8％，得到的牡蛎肽分子量小于500Dal，纯度为96.7％。
实施例7
1、新鲜牡蛎清洗、去除杂质，使用去离子水进行浸泡，浸泡时间为1小时，浸泡结束后清洗干净。
2、将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，原料与水的比例为1:15，添加10％氢氧化钠，在反应釜中通入氧气，氧压为2.0MPa，将其升温至150℃，在150r/min下搅拌3h，反应结束后得到牡蛎匀浆。
3、使用石油醚对牡蛎匀浆进行脱脂处理，石油醚与牡蛎匀浆的体积比为1:5，脱脂后进行离心，沉淀即为脱脂后的牡蛎原料；将脱脂后的牡蛎原料以料液比1:10的比例进行加水混合，搅拌均匀，将pH调至12，碱提温度为50℃，碱提时间为2小时；将碱提后的牡蛎蛋白pH调节至5.0，4℃静置3小时，酸沉结束后进行离心处理，沉淀即为牡蛎蛋白。
4、按照料液比范围为1:30g/mL在牡蛎蛋白中加入水，复合酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶，中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:1:2，复合酶的用量为0.8％，酶解温度为60℃，酶解pH为7.5，酶解时间为2小时。使用陶瓷膜设备进行过滤，获得牡蛎肽陶瓷膜清液。
5、将牡蛎肽陶瓷膜清液注入到真空MCPA系统，系统配制为24柱，流速为1.0mL/min，时间为0.5小时，反复纯化2次；再加入到整体硅胶盘十八烷基甲硅烷基部分修饰的填充旋转柱中，样品纯化结束后，先使用去离子水进行冲洗，再以梯度浓度的乙醇作为洗脱溶剂，乙醇浓度梯度分别为10％、30％、50％、70％、90％，主要收集50％与70％浓度下的纯化液，进行减压浓缩回收乙醇，得到牡蛎肽精制液。
6、将牡蛎肽精制液使用膜设备进行过滤膜设备的孔径分别为200nm、0.05μm，添加由泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127两种组合的助滤剂辅助过膜，其中泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127的质量比为2:1，添加量为料液体积的5％，得到牡蛎肽溶液。
7、将牡蛎肽溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到牡蛎肽产品。
8、该方法的蛋白提取率为94.3％，得到的牡蛎肽分子量小于500Da，纯度为92.1％。
实施例8
1、新鲜牡蛎清洗、去除杂质，使用去离子水进行浸泡，浸泡时间为1小时，浸泡结束后清洗干净。
2、将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，原料与水的比例为1:5，添加5％氢氧化钠，在反应釜中通入氧气，氧压为2.0MPa，将其升温至180℃，在200r/min下搅拌2h，反应结束后得到牡蛎匀浆。
3、使用石油醚对牡蛎匀浆进行脱脂处理，石油醚与牡蛎匀浆的体积比为1:5，脱脂后进行离心，沉淀即为脱脂后的牡蛎原料；将脱脂后的牡蛎原料以料液比1:10的比例进行加水混合，搅拌均匀，将pH调至12，碱提温度为50℃，碱提时间为2小时；将碱提后的牡蛎蛋白pH调节至5.0，4℃静置3小时，酸沉结束后进行离心处理，沉淀即为牡蛎蛋白。
4、按照料液比范围为1:30g/mL在牡蛎蛋白中加入水，复合酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶，中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:1:2，复合酶的用量为0.8％，酶解温度为60℃，酶解pH为7.5，酶解时间为5小时。使用陶瓷膜设备进行过滤，获得牡蛎肽陶瓷膜清液。
5、将牡蛎肽陶瓷膜清液注入到真空MCPA系统，系统配制为24柱，流速为1.0mL/min，时间为0.5小时，反复纯化2次；再加入到整体硅胶盘十八烷基甲硅烷基部分修饰的填充旋转柱中，样品纯化结束后，先使用去离子水进行冲洗，再以梯度浓度的乙醇作为洗脱溶剂，乙醇浓度梯度分别为10％、30％、50％、70％、90％，主要收集50％与70％浓度下的纯化液，进行减压浓缩回收乙醇，得到牡蛎肽精制液。
6、将牡蛎肽精制液使用膜设备进行过滤膜设备的孔径分别为200nm、0.05μm，添加由泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127两种组合的助滤剂辅助过膜，其中泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127的质量比为2:1，添加量为料液体积的5％，得到牡蛎肽溶液。
7、将牡蛎肽溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到牡蛎肽产品。
8、该方法的蛋白提取率为94.3％，得到的牡蛎肽分子量小于500Da，纯度为91.3％。
对比例1
1、新鲜牡蛎清洗、去除杂质，使用去离子水进行浸泡，浸泡时间为1小时，浸泡结束后清洗干净。
2、将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，原料与水的比例为1:5，添加5％氢氧化钠，在反应釜中通入氧气，氧压为1.0MPa，将其升温至180℃，在150r/min下搅拌2h，反应结束后得到牡蛎匀浆。
3、使用石油醚对牡蛎匀浆进行脱脂处理，石油醚与牡蛎匀浆的体积比为1:5，脱脂后进行离心，沉淀即为脱脂后的牡蛎原料；将脱脂后的牡蛎原料以料液比1:10的比例进行加水混合，搅拌均匀，将pH调至12，碱提温度为50℃，碱提时间为2小时；将碱提后的牡蛎蛋白pH调节至5.0，4℃静置3小时，酸沉结束后进行离心处理，沉淀即为牡蛎蛋白。
4、按照料液比范围为1:30g/mL在牡蛎蛋白中加入水，复合酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶，中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:1:2，复合酶的用量为0.8％，酶解温度为60℃，酶解pH为7.5，酶解时间为5小时。使用陶瓷膜设备进行过滤，获得牡蛎肽陶瓷膜清液。
5、将牡蛎肽陶瓷膜清液分别选择以大孔树脂为填料的层析柱与真空MCPA系统与旋转柱联合纯化两种纯化方式，层析柱纯化：将注入到以大孔树脂为填料的层析柱，流速为1bv/h；真空MCPA系统与旋转柱联合纯化：将注入到真空MCPA系统，系统配制为24柱，流速为1.0mL/min，时间为0.5小时，反复纯化2次；再加入到整体硅胶盘十八烷基甲硅烷基部分修饰的填充旋转柱中，样品纯化结束后，先使用去离子水进行冲洗，再以梯度浓度的乙醇作为洗脱溶剂，乙醇浓度梯度分别为10％、30％、50％、70％、90％，主要收集50％与70％浓度下的纯化液，进行减压浓缩回收乙醇，得到牡蛎肽精制液。
6、将牡蛎肽精制液使用膜设备进行过滤膜设备的孔径分别为200nm、0.05μm，添加由泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127两种组合的助滤剂辅助过膜，其中泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127的质量比为2:1，添加量为料液体积的5％，得到牡蛎肽溶液。
7、将牡蛎肽溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到牡蛎肽产品。
对比例2
1、新鲜牡蛎清洗、去除杂质，使用去离子水进行浸泡，浸泡时间为1小时，浸泡结束后清洗干净。
2、将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，原料与水的比例为1:5，添加5％氢氧化钠，在反应釜中通入氧气，氧压为1.0MPa，将其升温至180℃，在150r/min下搅拌2h，反应结束后得到牡蛎匀浆。
3、分别使用石油醚与乙醇对得到的牡蛎匀浆进行脱脂处理，石油醚与牡蛎匀浆的体积比为1:5，脱脂后进行离心，沉淀即为脱脂后的牡蛎原料；将脱脂后的牡蛎原料以料液比1:10的比例进行加水混合，搅拌均匀，将pH调至12，碱提温度为50℃，碱提时间为2小时；将碱提后的牡蛎蛋白pH调节至5.0，4℃静置3小时，酸沉结束后进行离心处理，沉淀即为牡蛎蛋白。
4、按照料液比范围为1:10g/mL在牡蛎蛋白中加入水，复合酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶，中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:1:2，复合酶的用量为0.3％，酶解温度为50℃，酶解pH为6.5，酶解时间为3小时，之后使用陶瓷膜设备进行过滤，获得牡蛎肽陶瓷膜清液。
5、将牡蛎肽陶瓷膜清液注入到真空MCPA系统，系统配制为24柱，流速为1.0mL/min，时间为0.5小时，反复纯化2次；再加入到整体硅胶盘十八烷基甲硅烷基部分修饰的填充旋转柱中，样品纯化结束后，先使用去离子水进行冲洗，再以梯度浓度的乙醇作为洗脱溶剂，乙醇浓度梯度分别为10％、30％、50％、70％、90％，主要收集50％与70％浓度下的纯化液，进行减压浓缩回收乙醇，得到牡蛎肽精制液。
6、将牡蛎肽精制液使用膜设备进行过滤膜设备的孔径分别为200nm、0.05μm，添加由泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127两种组合的助滤剂辅助过膜，其中泊洛沙姆188与泊洛沙姆f-127的质量比为2:1，添加量为料液体积的5％，得到牡蛎肽溶液。
7、将牡蛎肽溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到牡蛎肽产品。
编号 脱脂试剂 蛋白含量(％)
1 乙醇 69.36％
2 石油醚 94.30％
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种制备高纯度牡蛎肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)牡蛎原料清洗除杂；
(2)牡蛎原料爆炸减压辅助碱法制浆，得到牡蛎匀浆；
(3)牡蛎匀浆脱脂、碱提酸沉提取牡蛎蛋白；
(4)牡蛎蛋白复合酶酶解处理，制备牡蛎小分子肽；
(5)真空MCPA系统与旋转柱联合纯化牡蛎小分子肽，获得纯化后的牡蛎肽；
(6)膜设备进一步纯化、过滤；
(7)减压浓缩；喷雾干燥，得到成品；
其中，所述爆炸减压辅助碱法制浆是指将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，加入水和碱，并通入氧气，在一定温度下搅拌一定时间，得到牡蛎匀浆。
2.根据权利要求1所述的一种制备高纯度牡蛎肽的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述爆炸减压辅助碱法制浆具体为：将清洗过的牡蛎原料放置在封闭蒸压釜中，原料与水的比例为1:5-1:15g/mL，添加牡蛎原料质量5％-10％的碱液，在反应釜中通入氧气，氧压为1.0-2.0MPa，将其升温至150-180℃，在150-200r/min下搅拌2-3h，反应结束后得到牡蛎匀浆。优选的，所述碱液为氢氧化钠或氢氧化钾的任一种，优选氢氧化钠。
3.根据权利要求1所述的一种制备高纯度牡蛎肽的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述脱脂是指使用石油醚对牡蛎匀浆进行脱脂处理。
4.根据权利要求3所述的一种制备高纯度牡蛎肽的方法，其特征在于，步骤(3)中，脱脂过程中，所述石油醚与牡蛎匀浆的体积比为1:5-1:15，脱脂后进行离心，沉淀即为脱脂后的牡蛎原料。
5.根据权利要求1所述的一种制备高纯度牡蛎肽的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述碱提酸沉提取牡蛎蛋白是将脱脂后的牡蛎原料以料液比1:10-1:20的比例进行加水混合，搅拌均匀，将pH调至10-12，碱提温度为40-60℃，碱提时间为2-4小时；将碱提后的牡蛎蛋白pH调节至3.5-5.0，冷藏放置，酸沉结束后进行离心处理，沉淀即为牡蛎蛋白。
6.根据权利要求1所述的一种制备高纯度牡蛎肽的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述蛋白复合酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶，其中，中性蛋白酶、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1-2:1-2:2。
7.根据权利要求1所述的一种制备高纯度牡蛎肽的方法，其特征在于，步骤(4)中，酶解处理中，料液比范围为1:10～1:30g/mL，复合酶的用量为原料质量的0.3％～0.8％，酶解温度为50-60℃，酶解pH为6.5～7.5，酶解时间为2～5小时。
8.根据权利要求1所述的一种制备高纯度牡蛎肽的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述真空MCPA系统是在重力或真空下同时纯化毫克不同的蛋白质。
9.根据权利要求1所述的一种制备高纯度牡蛎肽的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述乙醇的浓度梯度为10～90％，优选为10％、30％、50％、70％、90％，收集50％与70％浓度下的纯化液。
10.根据权利要求1～9任一项所述的一种制备高纯度牡蛎肽的方法，其特征在于，步骤(6)中，过滤过程中优选添加复合助滤剂辅助过膜，所述助滤剂为泊洛沙姆188、泊洛沙姆f-127、泊洛沙姆407、泊洛沙姆L-65的任一种，优选为上述助滤剂的两种及以上的组合。
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