超临界二氧化碳除脂生产水解脑蛋白粉和脑磷脂的方法
技术领域
本发明涉及一种应用超临界二氧化碳萃取去除动物脑组织中脂类,复合酶水解萃取釜中残留脑蛋白为氨基酸和肽,浓缩、干燥得脑蛋白水解粉;分离釜Ⅰ中萃取物经丙酮溶解除去胆固醇,硅胶层析提取脑磷脂。其方法属于食品工业领域。
背景技术
长期以来人们用动物脑蛋白水解物治疗,协助治疗老年痴呆症、脑卒中、脑外伤、脑血栓引起的并发症;婴幼儿脑发育不良;白领工作者用脑过度引起的头晕都收到良好效果。这是因为动物脑组织的构成物质与人类脑组织相近.。经水解成分子量小的肽,氨基酸后可轻易透过血脑屏障,进入人类大脑参与脑组织的合成,参与大脑神经传递物质的合成和神经系统传递活动。但采用注射方法给药,特别严重的是与中草药配制的注射液易产生过敏和毒性反应,这方面有许多报导(罗晓珊等 脑蛋白水解物注射液严重不良反应典型病例分析 临床合理用药杂志 2011,4(10),159-160)。在专利中没有查找到应用超临界二氧化碳去除脂类后再水解残留下的蛋白质生产氨基酸、肽的专利权。有专利将脑组织匀浆干燥成粉沫直接使用(CN 00119197.2);有的经过水解,但没有除去脂类物质(CN 201110148556.1)。脑组织中脂肪含量8.9%左右,胆固醇3.1% 。中国成人每天胆固醇摄取限量为106~254㎎,不除去脂肪、胆固醇对于高血脂、高胆固醇的人群是有害的,只要每天吃进3~8g脑组织或其制成品,都不利于高血脂、高胆固醇的人群。在生产工艺上脂类存在大大地加大了提取液过滤的难度,于是不得不加水浠释,加温使溶液比较易于过滤些,由于水分增加,溶液含量只有1.2%,后处理浓缩、干燥的成本也增加(CN 200910072481.6)。有的方法采用丙酮、乙酸乙脂等有机溶剂萃取出脂类(CN 201110050728.1)。但脑蛋白在有机溶剂作用下产生变性结块,变性蛋白质对酶敏感性降低,导致水解不完全。水解物收获少,分子量大,在8000~20000Da之间(CN201110227333.4)。分子量一般在5肽(650Da)以下才安全;
采用口服方法可以避免过敏反应和减少毒性。近些年来采用口服方法,水解脑蛋白的使用范围、使用量逐步提高。但不除去脑组织中脂类,或者采用丙酮等有机溶剂除去脂类并非理想,大量胆固醇、三酸甘油对人体确实不利。我们采用超临界二氧化碳萃取去除脑组织中脂类,效果显著。超临界二氧化碳溶解能力相当于正己烷,能溶解组织中脂类。(胡卫军等 超临界二氧化碳萃取去除蛋黄粉中胆固醇和甘油三脂的研究《生命科学研究》 2001年第5卷第2期186-188)。当压力解除,液态二氧化碳变为气态溶解力降低,被溶解的物质又析出。没有有机溶剂残留,空气中也不会有污染。经我们试验显示:能有效除去脑组织中脂类,残渣经酶解得氨基酸和肽的混合物。脂类再经丙酮除去胆固醇、三甘脂,硅胶层析分离得有用的脑磷脂。(CN 03140389.1,用超临界二氧化碳萃取卵磷脂的方法)。
在中国专利查询网上尚未查找到用超临界二氧化碳萃取去除脑组织中脂类的专利;更没有用超临界二氧化碳萃取去除脑组织中脂类,再酶解提取水解脑蛋白粉的专利,也没有过同时提取脑组织中水解脑蛋白粉和脑磷脂二种物质的专利。
发明内容
本发明的目的在于用超临界二氧化碳萃取去除脑组织中脂类,再酶解生产水解脑蛋白粉;另一个目的是用萃取出的膏状物生产脑磷脂的工业化生产方法,
其发明内容简介如下:
(1)干燥 将新鲜或冷冻的动物脑去除脑膜和血管,压碎,在45℃真空条件下干燥至含水分5%以下,得动物脑干燥品,保存于-5℃下备用;
(2)去脂类 把动物脑干燥品装入超临界二氧化碳萃取机的萃取釜中,萃取条件为:萃取釜压力18~42Mpa,温度35~62℃;分离釜Ⅰ压力10~25Mpa,温度30~48℃;分离釜Ⅱ压力4~15Mpa,温度40~55℃;夹带剂为60%~98%乙醇,用量为脑干燥品的5%~60%,萃取时间0.5~6小时;二氧化碳流量20~80立升/公斤/小时;分离柱填料:颗粒活性碳、硅胶、氧化铝,以吸附腥臭气味;萃取结束后,分离釜Ⅰ中膏状物含脑磷脂类和胆固醇,用于提取脑磷脂;分离釜Ⅱ中为三酸甘油脂类,去掉;萃取釜中残留物含有脑蛋白,用于酶解生产脑蛋白水解粉;在2小时内没用完者,应密封保存于-5℃下备用;
(3)酶解 将萃取釜中残留物置于水解罐中,加纯化水2~8倍, 加入动物蛋白专用水解酶0.3~0.8 %,在一定pH条件下,以40℃~80℃下搅拌酶解3小时,加入风味酶0.08~0.2 %,继续水解3小时;灭酶,加入活性炭脱色除臭,板框压滤除去固体杂质,0.45μm微孔滤膜精滤,得精滤液;
(4)大孔树脂柱吸附 精滤液通过大孔树脂柱分离出脑蛋白水解液,阴树脂和阳树脂脱盐;(5)真空薄膜浓缩过柱后的脑蛋白水解液,喷雾干燥得到脑蛋白水解粉;
(6)取分离釜Ⅰ中含脑磷脂类和胆固醇的膏状物,在真空中干燥,得含脑磷脂和胆固醇的稠膏;
(7)提取脑磷脂 取稠膏加丙酮,用量为稠膏体积3.0~10倍,分三次萃取出胆固醇和油脂类,萃取液与母液分别回收丙酮,丙酮可重复使用;胆固醇和油脂类丢弃;在玻璃柱中装入100份层析用硅胶,另取5.0~10份硅胶与回收丙酮后等量含脑磷脂的母液相混合,将混合物加于硅胶柱上部,接着用含量95%热乙醇,流速3份/分钟,洗脱;收集脑磷脂乙醇液,真空回收乙醇得脑磷脂,含量≥90%,加氮气密闭保存。
实施案例是为了举例说明生产操作规程,不是限制。
实施案例1:
将新鲜或冷冻的动物脑去除脑膜和血管,挤压通过6目筛,平铺于真空干燥箱烘盘上,在真空度为-0.08 Mpa、温度 45℃,干燥至含水分3%以下,得干燥品,保存于-5℃备用;
将干燥的动物脑粉粒,分批装入HA221-40-100型超临界CO2萃取设备的萃取釜中,以萃取釜压力32.5 Mpa,温度41℃;分离釜Ⅰ压力18 Mpa,温度45℃;分离釜Ⅱ压力6Mpa,温度48℃;夹带剂为95%乙醇,用量为脑干燥品的20 %;萃取时间2小时;二氧化碳流量60立升/公斤/小时;取出萃取釜中残留物,用于酶解生产水解脑蛋白粉,取出萃取釜Ⅰ中膏状物,用于提取脑磷脂。萃取釜Ⅱ中膏状物可以去掉;
秤取萃取釜中残留物100公斤,加纯化水3倍,加入动物蛋白水解专用酶,用量0.5 %,开动搅拌机拌均匀,用20 %氢氧化钠调节pH为7.5,温度 65℃±1℃,搅拌酶解3小时;加入风味酶0.16%,在上述pH值和温度条件下继续水解3小时;升温到90℃,灭酶20分钟; 降温到45℃,加活性炭4%,搅拌25分钟,再静置吸附30分钟;板框压滤除去固体杂质,压力0.12Mpa,反复循环直至滤液澄清,经0.45μm微孔滤膜精滤,得精滤液;
按说明书预处理大孔树脂HPD-200型,取经处理的HPD-200型大孔树脂70公斤装入玻璃柱;取精滤液过柱,流速2BV/h,当流出1BV时收集过柱液;加完精滤液后以4BV纯化水洗脱精滤液,过柱液与洗脱液合并,经预处理好的阴树脂201×4FC,阳树脂001×4脱盐;收集脱盐液,供浓缩、干燥;
以含0.3 %的盐酸纯化水,洗涤大孔树脂HPD-200,再用纯化水洗至流出液的Ph值为5.0~6.5;接着以含0.4%的氢氧化钠纯化水洗涤大孔树脂,再用纯水洗直至Ph值为7.0~7.5;以1%硫酸铜在碱性条件下检测不到双缩脲反应为止;所述的大孔树脂可以再重复使用;阴树脂201×4FC,阳树脂001×4分别以2.1~5%的氢氧化钠水溶液,3.0~4.5%的盐酸再生;
真空薄膜浓缩脱盐液,真空薄膜浓缩条件为:全程控制在65℃以下,真空度为-0.09Mpa;浓缩后溶液含固量22~25%;浓缩液喷雾干燥,喷雾干燥条件:喷嘴入口温度170℃;出料口温度50~70℃,得脑蛋白水解粉5公斤;
取出分离釜Ⅰ中含脑磷脂类和胆固醇的膏状物,在真空中干燥,真空度为-0.08 Mpa,温度62℃,干燥4小时,得稠膏;
用4倍体积丙酮,分三次萃取稠膏中胆固醇和油脂类,萃取液与母液分别回收丙酮, 丢弃萃取液回收丙酮后得到的胆固醇和油脂类;在玻璃柱中装入100份层析用硅胶;另取6份硅胶与回收丙酮后等量的母液混合,将混合物加于硅胶柱上部,接着用95%热乙醇6倍, 温度75℃,流速3份/分钟,洗脱硅胶柱,收集脑磷脂乙醇液,真空回收乙醇,真空度为-0.06 Mpa,温度60℃,直到馏出液没有乙醇味为此;膏状物为脑磷脂,含量≥90%,充氮气密封保存。
实施案例2:
将新鲜或冷冻的动物脑去除脑膜和血管,挤压通过6目筛,平铺于真空干燥箱烘盘上,在真空度为-0.08 Mpa、温度 45℃,干燥至含水分3%以下,得干燥品,保存于-5℃备用;
将干燥的动物脑粉粒,分批装入HA221-40-100型超临界CO2萃取设备的萃取釜中,以萃取釜压力31.5 Mpa,温度40℃;分离釜Ⅰ压力20 Mpa,温度46℃;分离釜Ⅱ压力5Mpa,温度48℃;夹带剂为95%乙醇,用量为脑干燥品的25 %;萃取时间2小时;二氧化碳流量60立升/公斤/小时;取出萃取釜中残留物,用于酶解生产水解脑蛋白粉,取出萃取釜Ⅰ中膏状物,用于提取脑磷脂;萃取釜Ⅱ中膏状物可以去掉;
秤取萃取釜中残留物100公斤,加纯化水3倍,加入动物蛋白水解专用酶,用量0.6%,开动搅拌机拌均匀,用20 %氢氧化钠调节pH为7.5,温度 65℃±1℃,搅拌酶解3.5小时;加入风味酶0.15%,在上述pH值和温度条件下继续水解2.5小时;升温到90℃,灭酶20分钟; 降温到45℃,加活性炭3%,搅拌20分钟,再静置吸附30分钟;板框压滤除去固体杂质,压力0.15Mpa,反复循环直至滤液澄清,经0.45μm微孔滤膜精滤,得精滤液;
按说明书预处理大孔树脂HPD-100型,取经处理的HPD-100型大孔树脂70公斤装入玻璃柱;取精滤液过柱,流速2BV/h,当流出0.7BV时收集过柱液;加完精滤液后以4BV纯化水洗脱精滤液,过柱液与洗脱液合并,经预处理好的阴树脂201×4FC,阳树脂001×4脱盐;收集脱盐液,供浓缩、干燥;
以含0.3 %的盐酸纯化水,洗涤大孔树脂HPD-100,再用纯化水洗至流出液的Ph值为5.0~6.5;接着以含0.4%的氢氧化钠纯化水洗涤大孔树脂,再用纯水洗直至Ph值为7.0~7.5;以1%硫酸铜在碱性条件下检测不到双缩脲反应为止;所述的大孔树脂可以再重复使用;阴树脂201×4FC,阳树脂001×4分别以2.1~5%的氢氧化钠水溶液,3.0~4.5%的盐酸再生;
真空薄膜浓缩脱盐液,真空薄膜浓缩条件为:全程控制在65℃以下,真空度为-0.09Mpa;浓缩后溶液含固量22~25%;浓缩液喷雾干燥,喷雾干燥条件:喷嘴入口温度175℃;出料口温度50~70℃,得脑蛋白水解粉5.8公斤;
取出分离釜Ⅰ中含脑磷脂类和胆固醇的膏状物,在真空中干燥,真空度为-0.08 Mpa,温度65℃,干燥4小时,得稠膏;
用4倍体积丙酮,分三次萃取稠膏中胆固醇和油脂类,萃取液与母液分别回收丙酮,丢弃萃取液回收丙酮后得到的胆固醇和油脂类;在玻璃柱中装入100份层析用硅胶;另取6份硅胶与回收丙酮后等量的母液混合,将混合物加于硅胶柱上部,接着用95%热乙醇6倍, 温度72℃,流速3份/分钟,洗脱硅胶柱,收集脑磷脂乙醇液,真空回收乙醇,真空度为-0.06 Mpa,温度60℃,直到馏出液没有乙醇味为此;膏状物为脑磷脂,含量≥90%,充氮气密封保存。
实施案例3:
将新鲜或冷冻的动物脑去除脑膜和血管,挤压通过6目筛,平铺于真空干燥箱烘盘上,在真空度为-0.08 Mpa、温度 45℃,干燥至含水分3%以下,得干燥品,保存于-5℃备用;
将干燥的动物脑粉粒,分批装入HA221-40-100型超临界CO2萃取设备的萃取釜中,以萃取釜压力32.0 Mpa,温度41℃;分离釜Ⅰ压力17 Mpa,温度46℃;分离釜Ⅱ压力5Mpa,温度48℃;夹带剂为95%乙醇,用量为脑干燥品的23%;萃取时间1.6小时;二氧化碳流量70立升/公斤/小时;取出萃取釜中残留物,用于酶解生产水解脑蛋白粉,取出萃取釜Ⅰ中膏状物,用于提取脑磷脂;萃取釜Ⅱ中膏状物可以去掉;
秤取萃取釜中残留物100公斤,加纯化水3倍,加入动物蛋白水解专用酶,用量0.6%,开动搅拌机拌均匀,用20 %氢氧化钠调节pH为7.5,温度 65℃±1℃,搅拌酶解4小时;加入风味酶0.17%,在上述pH值和温度条件下继续水解3小时;升温到90℃,灭酶20分钟; 降温到45℃,加活性炭3%,搅拌20分钟,再静置吸附30分钟;板框压滤除去固体杂质,压力0.15Mpa,反复循环直至滤液澄清,经0.45μm微孔滤膜精滤,得精滤液;
按说明书预处理大孔树脂HPD-300型,取经处理的HPD-300型大孔树脂75公斤装入玻璃柱;取精滤液过柱,流速2BV/h,当流出0.7BV时收集过柱液;加完精滤液后以4BV纯化水洗脱精滤液,过柱液与洗脱液合并,经预处理好的阴树脂201×4FC,阳树脂001×4脱盐;收集脱盐液,供浓缩、干燥;
以含0.3 %的盐酸纯化水,洗涤大孔树脂HPD-300,再用纯化水洗至流出液的Ph值为5.0~6.5;接着以含0.4%的氢氧化钠纯化水洗涤大孔树脂,再用纯水洗直至Ph值为7.0~7.5;以1%硫酸铜在碱性条件下检测不到双缩脲反应为止;所述的大孔树脂可以再重复使用;阴树脂201×4FC,阳树脂001×4分别以2.1~5%的氢氧化钠水溶液,3.0~4.5%的盐酸再生;
真空薄膜浓缩脱盐液,真空薄膜浓缩条件为:全程控制在60℃以下,真空度为-0.09Mpa;浓缩后溶液含固量25%;浓缩液喷雾干燥,喷雾干燥条件:喷嘴入口温度175℃;出料口温度50~70℃,得脑蛋白水解粉6.0公斤;
取出分离釜Ⅰ中含脑磷脂类和胆固醇的膏状物,在真空中干燥,真空度为-0.08 Mpa,温度65℃,干燥4小时,得稠膏;
用4倍体积丙酮,分三次萃取稠膏中胆固醇和油脂类,萃取液与母液分别回收丙酮,丢弃萃取液回收丙酮后得到的胆固醇和油脂类;在玻璃柱中装入100份层析用硅胶;另取6份硅胶与回收丙酮后等量的母液混合,将混合物加于硅胶柱上部,接着用95%热乙醇6倍, 温度70℃,流速3份/分钟,洗脱硅胶柱,收集脑磷脂乙醇液,真空回收乙醇,真空度为-0.06 Mpa,温度60℃,直到馏出液没有乙醇味为此;膏状物为脑磷脂,含量≥90%,充氮气密封保存。