CN109394789A - 一种脑神经组织提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脑神经组织提取方法，涉及生物制药技术领域，解决现有脑神经组织提取工艺复杂且使用有毒溶剂污染环境的问题。本发明包括以下步骤：1)称取冷冻的除人以外的哺乳动物大脑组织，解冻后除去杂质，再将大脑组织粉碎成脑浆；2)将脑浆装入超临界萃取装置进行萃取，得到萃取物；3)将萃取物加入提取设备，并加入乙醇，调节pH，回流提取并过滤得到乙醇提取液和滤渣；4)将步骤3)中滤渣重复步骤3)；5)收集步骤3)和步骤4)中的乙醇提取液并回收乙醇，得到提取液；6)将提取液冷却后沉淀，过滤得到提取物，将提取物干燥粉碎即得到大脑组织提取物。本发明提取工艺简单、安全无毒，提取物收率大且神经节苷脂含量高。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，更具体的是涉及一种脑神经组织提取方法。
背景技术
神经节多糖和神经节苷脂是含唾液酸的糖神经鞘脂，存在于哺乳类动物脑细胞膜中，脑神经系统中含量非常丰富，是脑神经细胞膜的及其重要的组成成分，在脑神经中发生、生长、分化过程中起必不可少的作用，对于损伤后的脑神经修复也非常重要，具有促进脑神经再生、促进脑神经轴突生长和突触形成、恢复脑神经支配功能；改善脑神经传导、促进脑电波活动及其它脑神经电生理指标的恢复，保护脑细胞膜、促进脑细胞膜各种酶活性恢复等作用。
神经节多糖和神经节苷脂是一种分子量小的糖脂类复合物质，能穿过血脑屏障进入大脑，直接作用于人脑细胞，镶嵌在受损的神经细胞膜上，稳定和改善神经细胞膜的物质交换功能，通过促进各种形态、生化、组化、神经生理及行为参数的改善，促使凋亡的神经细胞恢复活力。具有促进神经细胞及大脑组织的正常发育、修复损伤神经及大脑组织作用。是用于溶栓、抗凝或止血和新生儿缺氧缺血性脑病的有效物质，对改善记忆能力、修复脑损伤、老年痴呆及帕金森氏病有一定的改善作用。
现有神经节苷脂的提取方法大多采用有机溶剂提取法，如专利申请号为201310187229.6的一种动物神经节苷脂与脑苷脂提取方法与其应用，先用氯仿与甲醇以2：1混合的混合溶剂提取出脂肪，再用石油醚提取出脂肪中的神经节苷脂和脑苷脂，固体为脑苷脂，液体为溶有脂肪的石油醚溶液；在低温4℃条件下，将前述得到的脑苷脂内加入无水乙醇，将残留的石油醚洗出，固液分离，得到无溶剂残留的脑苷脂；前述溶有脂肪的石油醚溶液经过蒸馏，将石油醚蒸发出，取固体，在此固体中加入固体重量的3～30倍的丙酮，固液分离，取固体得到神经节苷脂，将得到的神经节苷脂内加入神经节苷脂重量的3～30倍的无水乙醇，搅拌均匀，将残留的丙酮洗出，固液分离，取固体，得到无溶剂残留的神经节苷脂。该提取方法先用有机溶剂丙酮分离再用无水乙醇洗出神经节苷脂中的丙酮，提取工艺复杂且污染环境。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决现有脑神经组织提取工艺复杂且使用有毒溶剂污染环境的问题，本发明提供一种安全无毒的脑神经组织提取方法，提取收率高且提取物中神经节苷脂含量高。
本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：
一种脑神经组织提取方法，包括以下步骤：
1)称取冷冻的除人以外的哺乳动物大脑组织，解冻后除去杂质，再将大脑组织粉碎成脑浆；
2)将脑浆装入超临界萃取装置进行萃取，得到萃取物；
3)将萃取物加入提取设备，并加入乙醇，调节pH，回流提取并过滤得到乙醇提取液和滤渣；
4)将步骤3)中滤渣重复步骤3)；
5)收集步骤3)和步骤4)中的乙醇提取液并回收乙醇，得到提取液；
6)将提取液冷却后沉淀，过滤得到提取物，将提取物干燥粉碎即得到除人以外的哺乳动物大脑组织提取物。
优选地，所述步骤2)中超临界流体为二氧化碳，萃取温度为30-50℃，萃取压力为10-30MPa，萃取时间1-3h。
优选地，所述步骤3)中乙醇浓度为85％-95％，乙醇加量为萃取物体积的3-8倍。
优选地，所述步骤3)中pH范围为9-11，可有效去除游离脂类杂质。
优选地，所述步骤3)中回流提取温度为40-50℃，回流提取时间为2-3h。
优选地，所述步骤4)中：将步骤3)中滤渣重复步骤3)进行回流提取2-4次，得到多组乙醇提取液和滤渣。
优选地，所述步骤6)中：将提取液冷却后置于-5–15℃下沉淀，所述提取物的干燥条件为：真空度为-0.09MPa、干燥温度为40-50℃，干燥时间为10-12h。
优选地，所述除人以外的哺乳动物大脑组织为猪、牛、羊或马的大脑组织。
优选地，所述除人以外的哺乳动物大脑组织提取物中含有神经节苷脂、神经节多糖和唾液酸。
优选地，所述除人以外的哺乳动物大脑组织提取物中神经节苷脂的含量不小于92％。
本发明的有益效果如下：
1.本发明将超临界萃取和乙醇提取相结合，先通过超临界萃取得到萃取物(初提物)，再将萃取物(初提物)用乙醇进行回流提取得到含有神经节苷脂、神经节多糖和唾液酸的大脑组织提取物，其中，提取物的收率高达3.2-4.0‰，提取物中神经节苷脂的含量不小于92％。
2.本发明脑神经组织的提取工艺简单，使用二氧化碳作为超临界流体，且仅使用乙醇作为提取溶剂，环保且安全无毒。
具体实施方式
为了本技术领域的人员更好的理解本发明，下面结合以下实施例对本发明作进一步详细描述。以下对本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种脑神经组织提取方法，包括以下步骤：
1)称取1kg食用品级冷冻猪脑，解冻后除去杂质，再将猪脑置于粉碎机中打碎成脑浆；
2)将脑浆装入超临界萃取装置进行超临界萃取，超临界流体为二氧化碳，萃取温度为35℃，萃取压力保持为28MPa，萃取2h，得到萃取物；
3)将萃取物加入提取设备，向提取设备中加入萃取物体积7倍量、浓度为85％的乙醇，加氢氧化钠调节pH至9，在40℃下回流提取3小时，并在40℃下过滤得到乙醇提取液和滤渣；
4)将步骤3)中滤渣重复步骤3)进行回流提取2次，即将步骤3)中滤渣投入提取设备，向提取设备滤渣量7倍、浓度为85％的乙醇，加氢氧化钠调节pH至9，在40℃下回流提取3小时，并在40℃下过滤得到二次乙醇提取液和二次滤渣；再将二次滤渣进行回流提取和过滤一次得到三次乙醇提取液和三次滤渣；
5)收集并合并步骤3)中乙醇提取液和步骤4)中的二次乙醇提取液和三次乙醇提取液，回收乙醇，得到提取液；
6)将步骤5)中提取液冷却后置于10℃下沉淀，过滤得到提取物，将提取物在真空度为-0.09MPa、40℃下干燥12小时，粉碎得到3.2g猪脑组织提取物，本实施例猪脑组织提取物的收率为3.2‰，所得猪脑组织提取物中含有神经节苷脂、神经节多糖和唾液酸。
实施例2
本实施例提供一种脑神经组织提取方法，包括以下步骤：
1)称取1kg食用品级冷冻猪脑，解冻后除去杂质，再将猪脑置于粉碎机中打碎成脑浆；
2)将脑浆装入超临界萃取装置进行超临界萃取，超临界流体为二氧化碳，萃取温度为45℃，萃取压力保持为20MPa，萃取1.5h，得到萃取物；
3)将萃取物加入提取设备，向提取设备中加入萃取物体积4倍量、浓度为90％的乙醇，加氢氧化钠调节pH至10，在45℃下回流提取2.5小时，并在45℃下过滤得到乙醇提取液和滤渣；
4)将步骤3)中滤渣重复步骤3)进行回流提取3次，即将步骤3)中滤渣投入提取设备，向提取设备滤渣量3倍、浓度为90％的乙醇，加氢氧化钠调节pH至10，在45℃下回流提取2.5小时，并在45℃下过滤得到二次乙醇提取液和二次滤渣；再将二次滤渣进行回流提取和过滤一次得到三次乙醇提取液和三次滤渣；再将三次滤渣进行回流提取和过滤一次得到四次乙醇提取液和四次滤渣；
5)收集并合并步骤3)中乙醇提取液和步骤4)中的二次乙醇提取液、三次乙醇提取液和四次乙醇提取液，回收乙醇，得到提取液；
6)将步骤5)中提取液冷却后置于0℃下沉淀，过滤得到提取物，将提取物在真空度为-0.09MPa、50℃下干燥11小时，粉碎得到3.6g猪脑组织提取物，本实施例猪脑组织提取物的收率为3.6‰，所得猪脑组织提取物含有神经节苷脂、神经节多糖和唾液酸。
实施例3
本实施例提供一种脑神经组织提取方法，包括以下步骤：
1)称取1kg食用品级冷冻猪脑，解冻后除去杂质，再将猪脑置于粉碎机中打碎成脑浆；
2)将脑浆装入超临界萃取装置进行超临界萃取，超临界流体为二氧化碳，萃取温度为50℃，萃取压力保持为15MPa，萃取3h，得到萃取物；
3)将萃取物加入提取设备，向提取设备中加入萃取物体积6倍量、浓度为95％的乙醇，加氢氧化钠调节pH至10.5，在50℃下回流提取2小时，并在50℃下过滤得到乙醇提取液和滤渣；
4)将步骤3)中滤渣重复步骤3)进行回流提取3次，即将步骤3)中滤渣投入提取设备，向提取设备滤渣量6倍、浓度为95％的乙醇，加氢氧化钠调节pH至10.5，在50℃下回流提取2小时，并在50℃下过滤得到二次乙醇提取液和二次滤渣；再将二次滤渣进行回流提取和过滤一次得到三次乙醇提取液和三次滤渣；再将三次滤渣进行回流提取和过滤一次得到四次乙醇提取液和四次滤渣；
5)收集并合并步骤3)中乙醇提取液和步骤4)中的二次乙醇提取液、三次乙醇提取液和四次乙醇提取液，回收乙醇，得到提取液；
6)将步骤5)中提取液冷却后置于-5℃下沉淀，过滤得到提取物，将提取物在真空度为-0.09MPa、50℃下干燥12小时，粉碎得到4.0g猪脑组织提取物，本实施例猪脑组织提取物的收率为4.0‰，所得猪脑组织提取物含有神经节苷脂、神经节多糖和唾液酸。
测定本发明实施例1-实施例3所得的猪脑组织提取物中神经节苷脂的含量。猪脑组织提取物中神经节苷脂的测定方法依据高效液相色谱法，即使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。
使用的测试仪器有Agilent液相色谱仪、色谱柱(Lichrospher 100NH2 250×5.0mm 5um)、超声波震荡器、分析天平，试剂为四氢呋喃(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、磷酸(分析纯)、水(纯化水)。流动相：1％的磷酸：乙腈：四氢呋喃(V/V)＝300:600:100的比例配制，混匀，使用0.45um有机系膜抽滤一次，然后超声脱气30min，转入溶剂储液瓶密封，备用；临用前配制。波长：205nm，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，进样量：20μL，运行时间：20min。
测定步骤：分别精密吸取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图：前5针对照溶液1的峰面积RSD≤2.0％，6针对照溶液1的峰面积RSD≤5.0％。进样序列如表1所示。
表1进样序列表
| 样品名称 | 进样针数 |
| 空白溶液 | 1 |
| 系统适用性溶液 | 1 |
| 对照品溶液1 | 5 |
| 对照品溶液2 | 1 |
| 供试品溶液1 | 3 |
| 供试品溶液2 | 2 |
| 对照品溶液1 | 1 |
按外标法以峰面积计算：
式中A样为样品主峰峰面积，A对为对照品主峰峰面积，M对为对照品取样量，单位mg，M样为样品取样量，单位mg，P对为对照品含量。
采用上述方法分别测定本发明实施例1-实施例3所得的猪脑组织提取物中神经节苷脂的含量如表2所示。
表2实施例1-实施例3中神经节苷脂的含量表
| 神经节苷脂含量/％ | |
| 实施例1 | 92.3 |
| 实施例2 | 92.8 |
| 实施例3 | 93.1 |
由表2可知，依照四川鼎润元生物科技有限公司企业标准Q/DRY0002S-2018计算本发明实施例1-实施例3的猪脑组织提取物中神经节苷脂的含量均不小于92％。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，本发明的专利保护范围以权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种脑神经组织提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)称取冷冻的除人以外的哺乳动物大脑组织，解冻后除去杂质，再将大脑组织粉碎成脑浆；
2)将脑浆装入超临界萃取装置进行萃取，得到萃取物；
3)将萃取物加入提取设备，并加入乙醇，调节pH，回流提取并过滤得到乙醇提取液和滤渣；
4)将步骤3)中滤渣重复步骤3)；
5)收集步骤3)和步骤4)中的乙醇提取液并回收乙醇，得到提取液；
6)将提取液冷却后沉淀，过滤得到提取物，将提取物干燥粉碎即得到除人以外的哺乳动物大脑组织提取物。
2.根据权利要求1所述的脑神经组织提取方法，其特征在于：所述步骤2)中超临界流体为二氧化碳，萃取温度为30-50℃，萃取压力为10-30MPa，萃取时间1-3h。
3.根据权利要求1所述的脑神经组织提取方法，其特征在于：所述步骤3)中乙醇浓度为85％-95％，乙醇加量为萃取物的3-8倍。
4.根据权利要求1所述的脑神经组织提取方法，其特征在于：所述步骤3)中pH范围为9-11。
5.根据权利要求1所述的脑神经组织提取方法，其特征在于：所述步骤3)中回流提取温度为40-50℃，回流提取时间为2-3h。
6.根据权利要求1所述的脑神经组织提取方法，其特征在于：所述步骤4)中：将步骤3)中滤渣重复步骤3)进行回流提取2-4次，得到多组乙醇提取液和滤渣。
7.根据权利要求1所述的脑神经组织提取方法，其特征在于：所述步骤6)中：将提取液冷却后置于-5–15℃下沉淀，所述提取物的干燥条件为：真空度为-0.09MPa、干燥温度为40-50℃，干燥时间为10-12h。
8.根据权利要求1所述的脑神经组织提取方法，其特征在于：所述除人以外的哺乳动物大脑组织为猪、牛、羊或马的大脑组织。
9.根据权利要求1所述的脑神经组织提取方法，其特征在于：所述除人以外的哺乳动物大脑组织提取物中含有神经节苷脂、神经节多糖和唾液酸。
10.根据权利要求1所述的脑神经组织提取方法，其特征在于：所述除人以外的哺乳动物大脑组织提取物中神经节苷脂的含量不小于92％。
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