CN112079890A - 一种泰拉霉素d的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种泰拉霉素D的分离纯化方法，采用高效液相色谱法，使用流动相对待分离物在色谱柱中进行洗脱，合格馏分减压蒸馏，萃取除盐后，取有机层减压浓缩至干即可，本发明在萃取之前对合格馏分进行处理，将合格馏分进行高压乳匀或超声粉碎，减小了粒径，调节pH，加入针剂用活性碳，搅拌，脱碳，然后通过滤膜过滤，提高了表观分布容积，更好的将馏分中的杂质分离出去，上述分离方法能够有效分离泰拉霉素在合成及降解过程中产生的杂质，生产批次稳定质量可靠，生产周期短，单次制备产量大，满足杂质质量控制需求，为泰拉霉素未知杂质的研究奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明属于抗生素分离提取领域，特别是涉及一种泰拉霉素D的分离纯化方法。
背景技术
泰拉霉素（Tulathromycin）是半合成大环内酯类抗生素，于2004年在美国和欧盟上市。该药主要用于牛和猪由敏感菌引起的呼吸系统感染性疾病及由牛莫拉氏菌引起传染性角膜结膜炎的防治，药效强于市场上广泛使用的大环内酯类抗生素泰乐菌素和替米考星，在畜禽生产中的使用前景广泛。
泰拉霉素是由异构体A、B（分子式 C41H79N3O12，分子量806.09）按9：1组成的十五元环大环内酯类抗生素，两种异构体可通过C11和C13之间的内酯键的形成和断裂进行转换。
为了确保动物源性食品的安全，须对动物专用药物质量进行严格控制，药物含量测定、未知杂质的结构鉴定和杂质限量是药物质量控制的有效方法，杂质分析是药物质量标准的重要内容。泰拉霉素由半合成过程生产，与合成药物相比可控性更低，因此杂质谱更为复杂且难以预测。
现有技术中对于泰拉霉素及相关物质的分离技术中，分离不彻底，反应不完全，得到的目标产物纯度低，无法满足结构鉴定以及动物药物质量控制的杂质定位要求。
同时，泰拉霉素D为泰拉霉素合成过程中关键杂质，制备其标准品并对其结构进行研究都是泰拉霉素在国内申报兽药所必须的，同时对其结构进行研究也可以分析出它是在生产过程中何时产生，可以更好的减少其含量，提高泰拉霉素纯度。
发明内容
本发明提供了一种泰拉霉素D的分离纯化方法，解决背景技术中提出的分离得到的目标产物纯度低，分离不彻底，反应不完全等问题，从而能够更好的分离出泰拉霉素杂质D，提高泰拉霉素的纯度。
本发明的技术方案如下：
一种泰拉霉素D的分离纯化方法，其工艺步骤为：
泰拉霉素D合成：TULA-4 30-40g，甲酸胺40-50g，异丙醇230-260ml，30-40g纯净水，升温至65-75℃，搅拌15-17小时，取样检测，原料残留0.90-1.0%，反应结束，开始处理；
反应液浓缩至干，加250-350g水，滴加10%NaOH溶液调节PH至8-9，加250-400ml二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷层；水层再加入70-120ml二氯甲烷反萃，收集二氯甲烷层；合并两次二氯甲烷层加250-350g水洗，分层取二氯甲烷层浓缩至干，加150-250g丙酮代干一次；得泰拉霉素D粗品粉末，此时泰拉霉素D粗品中含有泰拉霉素A以及泰拉霉素D，将泰拉霉素D粗品粉末进行制备柱分离；
泰拉霉素D分离：
采用高效液相色谱法，将泰拉霉素D粗品粉末溶解，然后将作为分离材料的离子交换纤维中浸泡在溶解液中，静置50-80min，然后将溶解液滤出；将氨水加热至60-65℃，取氨水浸泡上述已吸附了泰拉霉素A以及泰拉霉素D的离子交换纤维80-160分钟，滤去氨水；加入甲酸丁酯，其量为离子交换纤维量的2-3.5倍，得到预处理后的待测物；
使用流动相对预处理后的待测物在色谱柱中进行洗脱，合格馏分减压蒸馏，萃取除盐后，取有机层减压浓缩至干，即得泰拉霉素D。
优选的，采用高效液相色谱法进行洗脱时，用乙腈在中性环境下溶解预处理后的待测物，待测物与所述的乙腈的质量体积比为（5-200）：1。
优选的，用乙腈溶解预处理后的待测物后，将溶液使用微孔滤膜进行过滤，然后多孔金属膜过滤，膜过滤滤液降温至15-25℃后再用中空纤维膜组件超滤。
优选的，用于洗脱的流动相A为0.01mol/L磷酸盐水溶液，流动相B为甲醇、乙腈、乙醇中的一种或多种。
优选的，所述磷酸盐水溶液为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或磷酸三钠水溶液中的任意一种。
优选的，萃取之前对合格馏分进行处理：将合格馏分进行高压乳匀或超声粉碎，减小粒径，调节pH至6.5-8.0，30～50℃水浴65-80min；加入0.1-1.0g针剂用活性碳，搅拌下加温65-75℃，脱碳25-45分钟，然后通过滤膜过滤，所述的滤膜采用0.45微米。
优选的，所述萃取试剂为二氯甲烷或乙酸乙酯中的一种。
优选的，所述减压浓缩的温度为60～80℃，压力控制在-0.01～－0.1MPa，减压浓缩后采用真空干燥设备对白色粉末进行真空干燥处理，搅拌转速控制在20～50r/min；真空度≥-0.08MPa；干燥温度控制在50～80℃，干燥时间20h以上。
优选的，所述流动相A与B的体积比为A:B ＝ (15～35):(85～65)。
有益效果：
1.本发明采用高效液相色谱法，使用流动相对待分离物在色谱柱中进行洗脱，合格馏分减压蒸馏，萃取除盐后，取有机层减压浓缩至干，上述分离方法能够有效分离泰拉霉素在合成及降解过程中产生的杂质，本发明使用动态轴向压缩柱，生产批次稳定质量可靠，生产周期短，单次制备产量大，满足杂质质量控制需求，为泰拉霉素未知杂质的研究奠定了良好的基础。
2.本发明对合格馏分进行了减压蒸馏的方式进行处理，除去了接收液中的溶剂，有利于后续得到固体样品；采用萃取的方式除盐，萃取试剂为二氯甲烷或乙酸乙酯中的一种，能够有效将混合液中的盐分除掉，避免了有机溶剂、水、盐等在旋转蒸发过程的爆沸现象，提高除盐效果的同时也保证了安全性。
3.溶解样品时采用的方法是将待测物在中性环境下于乙腈中溶解，能够有效避免样品在酸性或者碱性环境下活性被破坏的问题，避免降低泰拉霉素的亲脂性，使得在后续的洗脱过程中更有利于与目标产物分离，也挺高了目标产物的稳定性。
4.本发明中采用的流动相为磷酸盐，选用的磷酸盐为磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，磷酸三钠中的一种，能够有效调节流动相的PH值，有利与改善分离时的峰型，提高所收集的目标物纯度。
5.在萃取之前对合格馏分进行处理，将合格馏分进行高压乳匀或超声粉碎，减小了粒径，调节pH至6.5-8.0，水浴65-80min，加入针剂用活性碳，搅拌，脱碳，然后通过滤膜过滤，提高了表观分布容积，更好的将馏分中的杂质分离出去。
6.进行洗脱之前先对所述待分离物进行预处理，将待分离物溶解，然后将作为分离材料的离子交换纤维中浸泡在溶解液中，静置，然后将溶解液滤出；将氨水加热，取氨水浸泡上述已吸附了泰拉霉素以及泰拉霉素相关物质的离子交换纤维，滤去氨水；加入甲酸丁酯，其量为离子交换纤维量的2-3.5倍，得到预处理后的待测物，经过上述预处理后，保持了泰拉霉素的生物活性，更有利于后续反应的进行，提高了目标产物的稳定性。
附图说明
图1是泰拉霉素D结构式；
图2是实例1制备谱图；
图3是实例1制备过程收集馏分检测谱图；
图4是泰拉霉素D的核磁图谱；
图5是泰拉霉素对照品图谱；
图6是泰拉霉素D粗品图谱；
图7是泰拉霉素D对照品图谱；
图8是泰拉霉素D的CAS号截图。
具体实施方式
本发明提供一种泰拉霉素有关物质的分离方法，其工艺步骤如下 ：
采用高效液相色谱法，使用流动相对待分离物在色谱柱中进行洗脱，合格馏分减压蒸馏至一定体积，萃取除盐，再减压浓缩至干粉即可；所述的洗脱的流动相为添加了磷酸盐水溶液与甲醇、乙腈、乙醇等有机试剂一定比例的混合试剂；所述的色谱柱为装有色谱填料的DAC50柱；所述色谱柱内径范围在4.6mm～50mm，所述色谱柱内装填4～350g填料，所述填料的粒径为5um～10um。
在所述的分离方法中，所述的待测物采用以待测物的乙腈溶液的形式进样；所述的待测物的乙腈溶液的浓度为30mg/mL～500mg/mL，更佳地为5mg/L～200mg/mL；所述的待测物的乙腈溶液的进样量为 2mL～ 50mL，更佳地为 5mL ～20mL。
在所述的分离方法中，所述的色谱填料可为C8填料，C18填料，较佳地为Daisogel公司C18 填料；在所述的分离方法中使用的 DAC50柱为江苏汉邦科技有限公司 DAC50色谱系统。在所述的分离方法中，所述的分离方法的流速为30ml/min ～ 80ml/min，更佳地50ml/min ～ 70
ml/min。在所述的分离方法中，所述的流动相 A 和所述的流动相 B 可进行预处理，经0.45μm 滤膜过滤，并超声 10min；在所述的分离方法中，所述的分离方法检测时的紫外吸收波长为200 ～ 215nm，更佳地为 205 ～ 210nm；所述萃取除盐使用用的试剂为乙酸乙酯或二氯甲烷。
本发明所使用仪器如下：
DAC50制备液相色谱系统（江苏汉邦科技有限公司）；2695 型高效液相色谱仪，2487 型紫外检测器（Waters公司）。
以下将结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细叙述。
本发明中进行的泰拉霉素D合成时，均采用以下的反应参数：泰拉霉素D合成：TULA-4 35g，甲酸胺45g，异丙醇250ml，35g纯净水，升温至70℃，搅拌16小时，取样检测，原料残留0.97%，反应结束，开始处理。
反应液浓缩至干，加300g水，滴加10%NaOH溶液调节PH至8-9，加300ml二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷层。水层再加入100ml二氯甲烷反萃，收集二氯甲烷层。合并两次二氯甲烷层加300g水洗，分层取二氯甲烷层浓缩至干，加200g丙酮代干一次。
得泰拉霉素D粗品粉末，此时泰拉霉素D粗品中含有泰拉霉素A以及泰拉霉素D，将泰拉霉素D粗品粉末进行制备柱分离；
泰拉霉素D的结构式如图1所示，分子式：C38H73N3O12。
进行分离时，采用以下实施例的参数：
实施例1
色谱参数：C18,5um填料装填250g，流动相A为0.01mol/L磷酸三钠水溶液，流动相B为乙腈与甲醇，磷酸三钠水溶液：流动相B=40:60，进行等度洗脱，紫外吸收波长205nm，流速60ml/min。
具体工艺步骤如下：首先将待分离物溶解，然后将作为分离材料的离子交换纤维中浸泡在溶解液中，静置50min，然后将溶解液滤出；将氨水加热至65℃，取氨水浸泡上述已吸附了泰拉霉素以及泰拉霉素相关物质的离子交换纤维160分钟，滤去氨水；加入甲酸丁酯，其量为离子交换纤维量的3倍，得到预处理后的待测物，即处理后的泰拉霉素粗品。使用10mL乙腈在中性环境下溶解泰拉霉素粗品2g，将溶液使用微孔滤膜进行过滤，然后多孔金属膜过滤，膜过滤滤液降温至15℃后再用中空纤维膜组件超滤，使用配置好的流动相平衡系统15min，进样10mL。如图1所示，洗脱约15.1min后开始接收目标组分，接收约1min，然后继续洗脱10分钟。如图2所示，检测收集馏分纯度为95%，将合格馏分进行高压乳匀，减小粒径，调节pH至6.5，50℃水浴70min；加入0.1g针剂用活性碳，搅拌下加温65℃，脱碳25分钟，然后通过滤膜过滤，所述的滤膜采用0.45微米，将接收的液体流份使用旋转蒸发仪浓缩至50mL，加100ml乙酸乙酯中萃取除盐，分出下层减压浓缩，所述减压浓缩的温度为65℃，压力控制在-0.07MPa，减压浓缩后采用真空干燥设备对白色粉末进行真空干燥处理，搅拌转速控制在40r/min；真空度≥-0.08MPa；干燥温度控制在60℃，干燥时间34h至干，得到的白色粉末即为目标产物，泰拉霉素D。
实施例2：
色谱参数：C18,10um填料装填250g，流动相A为0.01mol/L磷酸二氢钾水溶液，流动相B为乙腈与乙醇，磷酸二氢钾溶液：流动相B=15:85，进行等度洗脱，紫外吸收波长205nm，流速60ml/min。
具体工艺步骤如下：首先将待分离物溶解，然后将作为分离材料的离子交换纤维中浸泡在溶解液中，静置60min，然后将溶解液滤出；将氨水加热至61℃，取氨水浸泡上述已吸附了泰拉霉素以及泰拉霉素相关物质的离子交换纤维100分钟，滤去氨水；加入甲酸丁酯，其量为离子交换纤维量的2.5倍，得到预处理后的待测物，即处理后的泰拉霉素粗品。使用150mL乙腈在中性环境下溶解泰拉霉素粗品1g，将溶液使用微孔滤膜进行过滤，然后多孔金属膜过滤，膜过滤滤液降温至20℃后再用中空纤维膜组件超滤，使用配置好的流动相平衡系统15min，进样10mL。洗脱约12min后开始接收目标组分，接收约1.5min，然后继续洗脱10分钟。检测收集馏分纯度为92%，将合格馏分进行超声粉碎，减小粒径，调节pH至7.0，45℃水浴65min；加入1.0g针剂用活性碳，搅拌下加温70℃，脱碳45分钟，然后通过滤膜过滤，所述的滤膜采用0.45微米，将接收的液体流份使用旋转蒸发仪浓缩至50mL，加100ml二氯甲烷中萃取除盐，分出下层减压浓缩，所述减压浓缩的温度为80℃，压力控制在-0.01MPa，减压浓缩后采用真空干燥设备对白色粉末进行真空干燥处理，搅拌转速控制在50r/min；真空度≥-0.08MPa；干燥温度控制在50℃，干燥时间40h至干，得到的白色粉末即为目标产物。
实施例3：
色谱参数：C8,10um填料装填250g，流动相A为0.01mol/L磷酸二氢钾水溶液，流动相B为乙腈，磷酸二氢钾水溶液：流动相B=25:75，进行等度洗脱，紫外吸收波长205nm，流速60ml/min。
具体工艺步骤如下：首先将待分离物溶解，然后将作为分离材料的离子交换纤维中浸泡在溶解液中，静置70min，然后将溶解液滤出；将氨水加热至60℃，取氨水浸泡上述已吸附了泰拉霉素以及泰拉霉素相关物质的离子交换纤维80分钟，滤去氨水；加入甲酸丁酯，其量为离子交换纤维量的2倍，得到预处理后的待测物，即处理后的泰拉霉素粗品。使用5mL乙腈在中性环境下溶解泰拉霉素粗品1g，将溶液使用微孔滤膜进行过滤，然后多孔金属膜过滤，膜过滤滤液降温至25℃后再用中空纤维膜组件超滤，使用配置好的流动相平衡系统15min，进样5mL。洗脱约12min后开始接收目标组分，接收约2.5min，然后继续洗脱10分钟。检测收集馏分纯度为93%，将合格馏分进行高压乳匀，减小粒径，调节pH至7.5，35℃水浴80min；加入0.8g针剂用活性碳，搅拌下加温75℃，脱碳30分钟，然后通过滤膜过滤，所述的滤膜采用0.45微米，将接收的液体流份使用旋转蒸发仪浓缩至50mL，加100ml二氯甲烷中萃取除盐，分出下层减压浓缩，所述减压浓缩的温度为60℃，压力控制在-0.05MPa，减压浓缩后采用真空干燥设备对白色粉末进行真空干燥处理，搅拌转速控制在30r/min；真空度≥-0.08MPa；干燥温度控制在80℃，干燥时间22h至干，得到的白色粉末即为目标产物。
实施例4：
色谱参数：C8,10um填料装填350g，流动相A为0.01mol/L磷酸氢二钾水溶液，流动相B为甲醇与乙醇，磷酸氢二钾水溶液：流动相B=20:80，进行等度洗脱，紫外吸收波长205nm，流速60ml/min。
具体工艺步骤如下：首先将待分离物溶解，然后将作为分离材料的离子交换纤维中浸泡在溶解液中，静置80min，然后将溶解液滤出；将氨水加热至62℃，取氨水浸泡上述已吸附了泰拉霉素以及泰拉霉素相关物质的离子交换纤维130分钟，滤去氨水；加入甲酸丁酯，其量为离子交换纤维量的3.5倍，得到预处理后的待测物，即处理后的泰拉霉素粗品。使用50mL乙腈在中性环境下溶解泰拉霉素粗品1g，将溶液使用微孔滤膜进行过滤，然后多孔金属膜过滤，膜过滤滤液降温至20℃后再用中空纤维膜组件超滤，使用配置好的流动相平衡系统15min，进样10mL。洗脱约18min后开始接收目标组分，接收约1.5min，然后继续洗脱10分钟。检测收集馏分纯度为91%，将合格馏分进行超声粉碎，减小粒径，调节pH至8.0，30℃水浴75min；加入0.5g针剂用活性碳，搅拌下加温72℃，脱碳40分钟，然后通过滤膜过滤，所述的滤膜采用0.45微米，将接收的液体流份使用旋转蒸发仪浓缩至50mL，加100ml乙酸乙酯中萃取除盐，分出下层减压浓缩，所述减压浓缩的温度为75℃，压力控制在-0.1MPa，减压浓缩后采用真空干燥设备对白色粉末进行真空干燥处理，搅拌转速控制在20r/min；真空度≥-0.08MPa；干燥温度控制在70℃，干燥时间27h至干，得到的白色粉末即为目标产物。
产物检测：
取实施例1-4得到的目标产物进行最终纯度检测，同时设置对比例，对比例的参数同实施例1，不同之处在于，对比例的操作步骤中，不对待分离物进行预处理，结果如下表所示。
从上表中可以看出，经过本发明的步骤得到的泰拉霉素目标产物，初次得到的馏分的纯度为92-95%，在经过高压乳匀或者超声粉碎后，最终得到的泰拉霉素相关物质的纯度较高，均在95%以上，这表明经过高压乳匀或者超声粉碎后，减小了产物的粒径，又经过调节pH、水浴75min加热，加入活性碳，脱碳、滤膜过滤等一系列过程，过滤杂质以及部分机械杂质，综合提高了目标产物的纯度；通过对比例的实验数据可以看出，待分离的泰拉霉素粗品在经过了与处理之后，提高了泰拉霉素粗品与目标产物之间的分离效率，提高了目标产物的纯度。
高温降解反应：
取待分离物适量，置于105℃烘箱中24h，放冷，取5mg 溶于1ml乙腈中，0.45μm滤膜过滤后，按实施例1的色谱参数测定，进样 20μL。
取约50mg泰拉霉素样品于10ml量瓶中，乙腈定容，置沸水浴中12h，放冷，0.45μm滤膜过滤，按实施例1的色谱参数测定，进样20μl。
高温破坏分析：泰拉霉素固体样品高温破坏与原料药相比，未见新的杂质峰，说明该样品在高温下较稳定。
稳定性实验：
将以上实施例1-4以及对比实验所制备的目标产物进行稳定性试验，对比实验1（A-C）的其他工艺流程及参数同实施例1，不同之处在于，进样时，用乙腈在酸性环境下（A-C分别对应的PH分别为1/3/5）溶解样品；对比实验2进样时，用乙腈在碱性性环境下（D-F分别对应的PH分别为9/11/12）溶解样品。将最终的到的目标产物置于40℃的烘箱中，放置6个月，分别于0月、3月、6月取样，考察样品的性状、酸度、干燥、失重、溶液的颜色与澄清度，结果见下表。
酸度pH值检测时，无菌注射用水配制溶液的浓度为0.1g／mL，溶液颜色与澄清度检测时，无菌注射用水配制溶液的浓度为0.1g／mL。
从上表的结果可以看出，本发明制备的目标产物具有良好的稳定性，而且与0月的结果比较，40℃下放置6个月后各检查指标均无明显变化，干燥失重率较低，从对比实验1和对比实验2的结果可以看出，在进样时，用乙腈在酸性环境下溶解样品和用乙腈在碱性环境下溶解样品之后，所得到的目标产物其颜色在3个月的时候发生了变化，且酸度较低，整体偏酸性，失重率高，这表明了样品在酸性和碱性条件下收到了一定的影响，导致了目标产物的不稳定性。
从图5可以看出，泰拉霉素在该流动相条件下保留时间为22.279，而泰拉霉素D相对泰拉霉素保留时间为0.55左右，推出泰拉霉素D的保留时间为12.25左右，从图6可以，保留时间为12.115这个物质与报道中泰拉霉素D保留时间吻合，其粗品纯度为55.86%。图7为制备分离得到的泰拉霉素D对照品，其纯度为97.05%，保留时间为12.222。后经核磁图谱确定，该物质结构与泰拉霉素D结构一致。
Claims (9)
1.一种泰拉霉素D的分离纯化方法，其特征在于其工艺步骤为：
泰拉霉素D合成：TULA-4 30-40g，甲酸胺40-50g，异丙醇230-260ml，30-40g纯净水，升温至65-75℃，搅拌15-17小时，取样检测，原料残留0.90-1.0%，反应结束，开始处理；
反应液浓缩至干，加250-350g水，滴加10%NaOH溶液调节PH至8-9，加250-400ml二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷层；水层再加入70-120ml二氯甲烷反萃，收集二氯甲烷层；合并两次二氯甲烷层加250-350g水洗，分层取二氯甲烷层浓缩至干，加150-250g丙酮代干一次；得泰拉霉素D粗品粉末，此时泰拉霉素D粗品中含有泰拉霉素A以及泰拉霉素D，将泰拉霉素D粗品粉末进行制备柱分离；
泰拉霉素D分离：
采用高效液相色谱法，将泰拉霉素D粗品粉末溶解，然后将作为分离材料的离子交换纤维中浸泡在溶解液中，静置50-80min，然后将溶解液滤出；将氨水加热至60-65℃，取氨水浸泡上述已吸附了泰拉霉素A以及泰拉霉素D的离子交换纤维80-160分钟，滤去氨水；加入甲酸丁酯，其量为离子交换纤维量的2-3.5倍，得到预处理后的待测物；
使用流动相对预处理后的待测物在色谱柱中进行洗脱，合格馏分减压蒸馏，萃取除盐后，取有机层减压浓缩至干，即得泰拉霉素D。
2.如权利要求 1 所述的一种泰拉霉素D的分离纯化方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行洗脱时，用乙腈在中性环境下溶解预处理后的待测物，待测物与所述的乙腈的质量体积比为（5-200）：1。
3.如权利要求2所述的一种泰拉霉素D的分离纯化方法，其特征在于，用乙腈溶解预处理后的待测物后，将溶液使用微孔滤膜进行过滤，然后多孔金属膜过滤，膜过滤滤液降温至15-25℃后再用中空纤维膜组件超滤。
4.如权利要求 1 所述的一种泰拉霉素D的分离纯化方法，其特征在于，用于洗脱的流动相A为0.01mol/L磷酸盐水溶液，流动相B为甲醇、乙腈、乙醇中的一种或多种。
5.如权利要求 4所述的一种泰拉霉素D的分离纯化方法，其特征在于，所述磷酸盐水溶液为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或磷酸三钠水溶液中的任意一种。
6.如权利要求 1 所述的一种泰拉霉素D的分离纯化方法，其特征在于，萃取之前对合格馏分进行处理：将合格馏分进行高压乳匀或超声粉碎，减小粒径，调节pH至6.5-8.0，30～50℃水浴65-80min；加入0.1-1.0g针剂用活性碳，搅拌下加温65-75℃，脱碳25-45分钟，然后通过滤膜过滤，所述的滤膜采用0.45微米。
7.如权利要求1所述的一种泰拉霉素D的分离纯化方法，其特征在于，所述萃取试剂为二氯甲烷或乙酸乙酯中的一种。
8.如权利要求 1 所述的一种泰拉霉素D的分离纯化方法，其特征在于，所述减压浓缩的温度为60～80℃，压力控制在-0.01～－0.1MPa，减压浓缩后采用真空干燥设备对白色粉末进行真空干燥处理，搅拌转速控制在20～50r/min；真空度≥-0.08MPa；干燥温度控制在50～80℃，干燥时间20h以上。
9.如权利要求 1所述的一种泰拉霉素D的分离纯化方法，其特征在于，所述流动相A与B的体积比为A:B ＝ (15～35):(85～65)。
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