CN105801527A - 豨桐胶囊的质量控制方法 - Google Patents

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CN105801527A CN201610194132.1A CN201610194132A CN105801527A CN 105801527 A CN105801527 A CN 105801527A CN 201610194132 A CN201610194132 A CN 201610194132A CN 105801527 A CN105801527 A CN 105801527A
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武爱玲
齐然
郭畅
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    • G01N2030/027—Liquid chromatography

Abstract

本发明公开了豨桐胶囊的质量控制方法，是一种通过控制豨桐胶囊中活性成分进而控制成药质量的分析方法。本发明提供的化合物(Ⅰ)为首次报道，具有治疗膝骨性关节炎作用，可能是豨桐胶囊发挥治疗作用的物质基础之一。该化合物可以从臭梧桐叶中分离得到，且分离制备方法得率高，可以进行大规模制备。本发明提供的液相分析方法可以将豨桐胶囊中的化合物(Ⅰ)与其他化合物分开，达到基线分离(分离度＞2.0)，化合物(Ⅰ)峰纯度检测合格。本发明提供的化合物(Ⅰ)在豨桐胶囊的质量控制过程中可以作为化学对照品用于化合物(Ⅰ)的定性或定量分析。

Description

豨桐胶囊的质量控制方法
技术领域
本发明属于药物技术领域，涉及药物制剂的分析，具体涉及豨桐胶囊的质量控制方法。
背景技术
豨桐胶囊是由豨莶草和臭梧桐叶制成的胶囊剂。
功能主治：清热袪湿，散风止痛。
本品主要用于风湿热痹，症见关节红肿热痛；风湿性关节炎见上述证候者。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种从豨桐胶囊中分离得到的新化合物；
本发明的第二目的在于提供上述新化合物的制备方法；
本发明的第三目的在于提供一种基于上述新化合物的液相分析方法，用于控制豨桐胶囊的质量，提高豨桐胶囊的质量控制水平；
本发明的第四目的在于提供上述新化合物在豨桐胶囊质量控制中用作对照品的用途。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
所述的化合物(Ⅰ)的制备方法包括如下操作步骤：
步骤S1，将干燥的臭梧桐叶粉碎，用70～80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
步骤S2，将步骤S1中正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用8～12％乙醇洗脱8～12个柱体积，再用65～75％乙醇洗脱13～17个柱体积，收集65～75％乙醇洗脱液，减压浓缩得65～75％乙醇洗脱浓缩物；
步骤S3，将步骤S2中65～75％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为100:1、50:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；
步骤S4，将步骤S3中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
步骤S5，将步骤S4中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为65～75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集14～18个柱体积洗脱液，减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。
进一步地，步骤S1中用75％乙醇热回流提取。
进一步地，步骤S2中所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
进一步地，步骤S2中，先用10％乙醇洗脱10个柱体积。
更进一步地，步骤S2中，再用70％乙醇洗脱15个柱体积，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物。
进一步地，步骤S5中用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱。
上述化合物(Ⅰ)在豨桐胶囊质量控制方法中用作化学对照品的用途。
所述豨桐胶囊质量控制方法为高效液相色谱法，参数如下：
色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.6％磷酸溶液；
梯度洗脱程序：0.01～5min，A8％→15％；5～10min，A15％→50％；10～25min，A50％→90％；25～30min，A90％→10％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：252nm；
柱温：35℃；
进样量：10μL。
进一步地，所述的C18柱为AgilentZorbaxSBC18柱(4.6mm×250mm，5μm)。
本发明的优点：
1、本发明提供的化合物(Ⅰ)为首次报道，具有治疗膝骨性关节炎作用，可能是豨桐胶囊发挥治疗作用的物质基础之一；
2、臭梧桐叶是豨桐胶囊中的一味药，化合物(Ⅰ)可以从臭梧桐叶中分离得到，本发明提供的制备方法得率高，可以进行大规模制备；
3、本发明提供的液相分析方法可以将豨桐胶囊中的化合物(Ⅰ)与其他化合物分开，达到基线分离(分离度＞2.0)，化合物(Ⅰ)峰纯度检测合格；
4、本发明制备的化合物(Ⅰ)纯度高，在豨桐胶囊的质量控制过程中可以用于化合物(Ⅰ)的定性或定量。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
实施例1：化合物(Ⅰ)的制备和结构确证
分离制备方法：
步骤S1，将2kg干燥的臭梧桐叶粉碎，用75％乙醇热回流提取(10L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
步骤S2，将步骤S1中正丁醇萃取物用D101型大孔树脂富集，先用10％乙醇洗脱10个柱体积，再用70％乙醇洗脱15个柱体积，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；
步骤S3，将步骤S2中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为100:1(10个柱体积)、50:1(8个柱体积)、25:1(8个柱体积)和15:1(7个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；
步骤S4，将步骤S3中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(6个柱体积)、15:1(6个柱体积)和5:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
步骤S5，将步骤S4中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集14～18个柱体积洗脱液，减压浓缩得到化合物(Ⅰ)(815mg，HPLC归一化纯度大于98％)。
结构确证：
无色结晶，HR-ESI-MS显示[M+H]+为m/z377.2289，结合核磁特征可得分子式为C22H32O5，不饱和度为7。核磁共振氢谱数据δH(ppm，pyridine-d5，500MHz)：H-1(6.04，dd，J＝6.7，12.1Hz)，H-2(6.52，dd，J＝12.1，9.5Hz)，H-3(7.13，d，J＝9.5Hz)，H-5a(3.23，d，J＝15.6Hz)，H-5b(2.98，dd，J＝15.6，9.3Hz)，H-6(5.06，dd，J＝9.3，1.4Hz)，H-7(1.87，m)，H-8(1.53，m)，H-9a(2.02，m)，H-9b(1.61，m)，H-10(1.96，m)，H-11(1.77，m)，H-12(0.85，d，J＝5.9Hz)，H-13(1.13，d，J＝6.8Hz)，H-14(1.20，d，J＝6.8Hz)，H-2’(2.69，m)，H-3’(5.26，m)，H-4’(1.23，d，J＝6.3Hz)，H-5’(1.09，d，J＝7.1Hz)，H-2”(1.97，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，pyridine-d5，125MHz)：133.2(CH，1-C)，127.4(CH，2-C)135.3(CH，3-C)，122.5(C，4-C)，28.3(CH2，5-C)，77.4(CH，6-C)，52.7(CH，7-C)，27.7(CH，8-C)，35.2(CH2，9-C)，42.8(CH，10-C)，26.4(CH，11-C)，22.1(CH3，12-C)，23.8(CH3，13-C)，18.4(CH3，14-C)，171.2(C，15-C)，211.9(C，1’-C)，46.4(CH，2’-C)，72.4(CH，3’-C)，17.3(CH3，4’-C)，12.7(CH3，5’-C)，170.3(C，1”-C)，21.4(CH3，2”-C)。红外波谱中的1756cm-1吸收带与UV谱中的236nm吸收带表明该化合物含有α,β-不饱和内酯结构，红外波谱中的1715cm-1与1624cm-1吸收带表明结构中存在酮基与α,β-不饱共轭体系。13C-NMR、DEPT和HSQC谱中显示有22个碳信号，包括六个甲基，两个亚甲基，十个次甲基(两个连氧碳和三个烯烃碳)，以及四个季碳(三个羰基碳和一个烯烃碳)，以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为双环结构。1H-NMR谱结合HSQC谱显示五个甲基质子信号δH0.85(3H，d，J＝5.9Hz)、1.13(3H，d，J＝6.8Hz)、1.20(3H，d，J＝6.8Hz)、1.23(3H，d，J＝6.3Hz)、1.09(3H，d，J＝7.1Hz)，一个乙酰基甲基质子信号δH1.97(3H，s)，三个共轭烯烃质子信号δH6.04(1H，dd，J＝6.7，12.1Hz)、6.52(1H，dd，J＝12.1，9.5Hz)与7.13(1H，d，J＝9.5Hz)，两个连氧次甲基质子信号δH5.06(1H，dd，J＝9.3，1.4Hz)与5.26(1H，m)，两组亚甲基质子信号δH3.23(1H，d，J＝15.6Hz)与2.98(1H，dd，J＝15.6，9.3Hz)、2.02(1H，m)与1.61(1H，m)，五个次甲基质子信号δH1.87(1H，m)、1.53(1H，m)、1.96(1H，m)、1.77(1H，m)、2.69(1H，m)。1H-1HCOSY谱中存在H-1/H-2/H-3、H2-5/H-6/H-7/H-8/H2-9/H-10、H-7/H-11/H3-12、H-11/H3-13以及H-8/H3-14相关信号，结合HMBC谱中显示的H-2、H2-9和H-10与C-1相关信号以及H-2、H2-5和H-6与C-4相关信号可以构建吉马烷型倍半萜骨架。而1H-1HCOSY谱中H3-5’/H-2’/H-3’/H3-4’相关信号，与HMBC谱中H-2’与C-1’、C-3’和C-5’，H-3’与C-2’、C-4’和C-1”以及H3-2”与C-1”相关信号可以构建另一部分片段，并且这一部分结构中存在的乙酰基通过氧原子与C-3’相连，同时HMBC谱中H-10与C-1’的相关性表明这一片段与吉马烷型倍半萜骨架连接的位置。另外，HMBC谱中H-3、H2-5和H-6与C-15相关信号暗示C-6与C-15之间存在一个内酯环结构。NOESY谱中，假设H-8为β构型，那么H-8与H-10的相关性表明H-10也为β构型，因此，O-3’-O-乙酰基-2’-甲基丁酮基应该为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。
化学结构式和碳原子编号如下：
实施例2：化合物(Ⅰ)的药理作用(治疗膝骨性关节炎)
本实施例采用兔右膝关节腔内注入木瓜蛋白酶建立骨性关节炎模型，测定膝骨性关节炎关节软骨中硫酸软骨素的含量变化，观察化合物(Ⅰ)防治骨性关节炎的作用。
1、材料与方法
1.1动物
10月龄普通级日本大耳白兔36只，体重2.8～3.2kg，雌雄不限。由贵阳医学院实验动物中心提供，饲料由该中心提供标准饲料。
1.2试剂与样品
化合物(Ⅰ)自制，制备方法见实施例1。木瓜蛋白酶(Papain)：Merk公司产品；硫酸软骨素标准品：Sigma公司产品；胰蛋白酶、胃蛋白酶、HCl、NaOH、高岭土、活性炭、95％乙醇、乙醚。
1.3仪器
骨科常用手术器械、温度计、滤纸、分液漏斗、离心机、干燥器、试管、恒温水浴箱、冷冻库、紫外分光光度计、间苯三酚、冰醋酸、超声波清洗机、全自动电子分析天平。
1.4白兔分组及模型制备
按照组间均衡一致的原则，将36只日本大耳白兔随机分成3组，分别为正常对照组、模型对照组、化合物(Ⅰ)组(40mg·kg-1)，每组12只。适应环境1周后，按照兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶造成骨关节炎病变模型方法，将日本大耳白兔右膝关节腔内注入1.6％木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.5ml，隔2d后再注射第2次，再隔2d后注射第3次，共注射3次。36只健康日本大耳白兔正常饲养1周后，模型组、化合物(Ⅰ)组按上述造模方法造模。于末次造模注射后的第28d开始，模型组给予0.9NS8.4ml/(kg·d)灌胃每天一次，正常组按正常饲养4、8、12周后，正常组、模型组、化合物(Ⅰ)组每次4只取软骨后宰杀，留取标本。
1.5硫酸软骨素的提取
(1)高温蒸煮与碱解：将软骨投入恒温蒸煮器内于80℃煮4～6h，蒸馏水洗净，放入冷库于-25℃速冻6～8h后立即绞碎，称重后按原料与2％NaOH的比例为1:6.25的量加入2％NaOH，室温提取1.5h，然后用2mol/LHCl调pH到6～6.5，定量滤纸、漏斗过滤。留下滤液。滤渣再以1：0.12的比例加2％NaOH，于40℃下提取1h，再用定量滤纸过滤，弃滤渣，取滤液。合并两次滤液，并测量体积待用。
(2)酶解：滤液用2mol/LHCl调pH到8.0～9.0，按滤液与胰蛋白酶1000:0.5的比例加入胰酶，于40～50℃水解1h后，再按1000∶0.5的比例加入胃蛋白酶，40～50℃水解1.5h。水解完毕后定量滤纸过滤并加入高岭土和活性炭(使其浓度为0.5％)进行吸附，同时慢速间歇搅拌4h，置4℃下自然澄清，取上清液，弃沉淀。
(3)反萃取：按体积比1:1向上清液中加入氯仿充分混合。
(4)沉淀：将上述水层，调pH到6.8～7.2，再加入2.5体积95％以上乙醇沉淀，待澄清后，弃清液，以1500r/min离心7～10min，收集沉淀，其沉淀物即为硫酸软骨素。
(5)干燥：将上述沉淀于盛有五氧化二磷的干燥器中即得成品。
1.6硫酸软骨素质量的测定
原理：利用硫酸软骨素(CS)与含有间苯三酚的无机酸在100℃反应30min，生成有色物质在波长558nm处有最大吸收，通过比色测定硫酸软骨素的含量。
(1)硫酸软骨素标准溶液的配制：准确称取已干燥至恒重的硫酸软骨素0.25g，于25ml量瓶中，加蒸镏水使其溶解稀释至刻度并摇匀。
(2)间苯三酚溶液(反应试剂)的配制：取冰醋酸30ml，盐酸40ml和50mg/ml间苯三酚乙醇溶液10ml混合(临用时配制)。
(3)吸收光谱的测定：准确吸取硫酸软骨素标准溶液0.4ml，置于10ml量瓶中，用蒸馏水稀释至1.0ml，加入间苯三酚溶液3ml，盖塞后混匀。将量瓶置于沸水浴中加热30min后取出，立即置于冰水浴中冷却5min，用冰醋酸稀释至刻度，混匀，以试剂空白为参比，在400～800nm波长范围内扫描。见在波长558nm处有最大吸收。选择波长558nm作为测定波长。
(4)绘制标准曲线：吸收硫酸软骨素标准溶液，分别配制浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.00mg/ml溶液，同(3)步操作，在波长558nm处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得其回归方程。
(5)硫酸软骨素(CS)的样品测定：取105℃干燥至恒重的硫酸软骨素(CS)的样品，精密称定其质量，置100ml量瓶中，加蒸馏水适量溶解，并加蒸馏水至刻度，摇匀。取1ml溶液，按上述方法测定。
1.7统计学方法
实验数据用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS18.0版统计软件进行单因素方差分析和t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2、实验结果
与正常对照组相比，模型对照组硫酸软骨素的含量4周有差异(P<0.05)，8、12周时有显著差异(P<0.01)；与模型组相比，化合物(Ⅰ)组硫酸软骨素测定值4、8、12周时都有显著差异(P<0.01)。结果见表1。
表1对膝骨性关节炎模型家兔硫酸软骨素含量(mg)的影响
组别 4周 8周 12周
正常对照组 9.87±0.30 9.81±0.38 9.63±0.42
模型对照组 7.57±0.25 5.47±0.35 4.90±0.20
化合物(Ⅰ)组 9.15±0.30 9.27±0.21 9.45±0.34
骨性关节炎的实质是软骨的退行性改变，其中包括软骨结构及成分的改变。一系列的研究证明，无论是人还是动物模型的骨性关节炎病变软骨，软骨基质所含的蛋白多糖渐进性减少，而胶原的含量则相对稳定不变。研究证明，随着年龄的增长软骨基质中蛋白多糖的主要改变表现在：大分子降解成小分子，糖醛的含量减少，硫酸软骨素和半乳糖胺的比例降低，而硫酸角质素和蛋白质的比例增高。本发明提供的化合物(Ⅰ)可以升高膝骨性关节炎模型家兔硫酸软骨素含量，对膝骨性关节炎具有治疗作用。
实施例3：豨桐胶囊的质量控制方法
1、仪器：Agilent1260高效液相色谱仪
2、试剂：化合物(Ⅰ)自制，HPLC归一化纯度大于98％，制备方法见实施例1；豨桐胶囊为河南省洛正制药厂产品。
3、色谱条件：
色谱柱：AgilentZorbaxSBC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.6％磷酸溶液；
梯度洗脱程序：0.01～5min，A8％→15％；5～10min，A15％→50％；10～25min，A50％→90％；25～30min，A90％→10％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：252nm；
柱温：35℃；
进样量：10μL。
4、供试品溶液的制备
取豨桐胶囊内容物适量研成细粉，精确称取细粉1.50g置于5ml离心管中，加10ml甲醇，超声提取20min，离心取上清，残渣重复提取两次，合并3次上清液，水浴回收溶剂至干，残留物用甲醇溶解并定容至25ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液为供试液。
5、对照品溶液的制备
精密称取化合物(Ⅰ)20mg至20ml容量瓶中，甲醇超声溶解，冷却至室温后定容。精密移取2ml至20容量瓶中，甲醇稀释定容，配制成浓度约为0.1mg/ml的对照品溶液。
6、分析方法验证
使用DAD检测器，分别进样分析供试品溶液和对照品溶液，结果：供试品溶液液相色谱图中在对照品溶液液相色谱图出峰位置出峰；对照品溶液中化合物(Ⅰ)色谱峰的光谱图与供试品溶液中对应色谱峰的光谱图一致；供试品溶液中化合物(Ⅰ)色谱峰与相邻色谱峰的分离度大于2.0，且峰纯度高于阈值。
7、样品含量测定
分别取3个批号的豨桐胶囊样品，按上述方法处理制备供试液，测定样品中化合物(Ⅰ)含量，3批样品中的含量分别为0.0832％、0.0835％、0.0834％。
本发明提供的化合物(Ⅰ)为首次报道，具有治疗膝骨性关节炎作用，可能是豨桐胶囊发挥治疗作用的物质基础之一，可以从臭梧桐叶中分离得到，在豨桐胶囊的质量控制过程中可以作为化学对照品用于化合物(Ⅰ)的定性或定量分析。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
步骤S1，将干燥的臭梧桐叶粉碎，用70～80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
步骤S2，将步骤S1中正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用8～12％乙醇洗脱8～12个柱体积，再用65～75％乙醇洗脱13～17个柱体积，收集65～75％乙醇洗脱液，减压浓缩得65～75％乙醇洗脱浓缩物；
步骤S3，将步骤S2中65～75％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为100:1、50:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；
步骤S4，将步骤S3中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
步骤S5，将步骤S4中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为65～75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集14～18个柱体积洗脱液，减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中用75％乙醇热回流提取。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，先用10％乙醇洗脱10个柱体积。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，再用70％乙醇洗脱15个柱体积，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S5中用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱。
8.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在豨桐胶囊质量控制方法中用作化学对照品的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，所述豨桐胶囊质量控制方法为高效液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱法的参数如下：
色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.6％磷酸溶液；
梯度洗脱程序：0.01～5min，A8％→15％；5～10min，A15％→50％；10～25min，A50％→90％；25～30min，A90％→10％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：252nm；
柱温：35℃；
进样量：10μL。
10.权利要求9所述的C18柱为AgilentZorbaxSBC18柱(4.6mm×250mm，5μm)。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111044628A (zh) * 2019-12-19 2020-04-21 江苏七○七天然制药有限公司 一种风湿豨桐片的检测方法

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