背景技术
芒果苷(mangiferin),又称芒果素、莞知母宁;主要存在于漆树科植物芒果(Mangifera indica L.)的果实、叶、树皮,百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的根茎、地上部分,鸢尾科植物射干[Belamcanda chinensis(L.)DC.]的花、叶等植物中。
芒果苷的药理功能:具有抑制中枢神经系统、抗炎、抑菌、抗单纯疱疹病毒,利胆和免疫作用,对模拟高原急性低氧肝损伤有保护作用。药理实验表明,用于治疗慢性支气管炎有较好疗效,是藏茵陈治疗肝炎的主要有效成分,是知母根茎中抗病毒的活性成分。
研究发现芒果苷还具有降糖、降脂、保肝、保护肾功能等作用。而作为功能性食品添加剂,芒果苷的功能主要为治疗糖尿病、抑制脂肪吸收和加速脂肪分解。在国外,芒果苷是被大量应用于糖尿病食物和减肥食物中一种新型的、安全型的食品添加剂。
目前,国内对于芒果苷的研究,仅仅停留在药用总黄酮的提取方面,产品主要有芒果止咳片中成药,功效主要为止咳作用,同时,对于芒果苷的提取大多数采用从知母等植物中提取,并没有从环境资源再利用方面进行考虑再回收,虽然国内也有一些厂家对芒果叶进行了研究,但他们皆是以芒果苷粗提物作为化工原料进行销售,一则产品科技含量低,二则产品的深度加工不够,三则忽视了芒果苷的高度安全性,未考虑其开发功能性食品添加剂,四则制备工艺繁琐,成本较高,五则在纯化精制工艺中有机溶剂用量较大。
而芒果树是南方沿海城市的优势植物资源,芒果作为一种热带水果很受人们欢迎,而芒果叶作为废弃物大量的被弃置不用,所以迫切需要研发如何从大量废弃的芒果叶中,提取出高纯度的芒果苷,进而合理利用资源,变废为宝,开发新型的安全性的食品添加剂,广泛应用于糖尿病食物和减肥食物中。
发明内容
针对于此,本发明的目的在于,提供一种采用生物活性酶法进行芒果苷的提取纯化工艺,既提高了产品的得率,又提高了产品的纯度,同时大大降低了生产成本,其生产工艺简单可行,符合大生产条件。
为解决上述技术问题,本发明提供的技术方案为:一种芒果苷的制备方法,该制备方法包括以下步骤:
(1)、取原料芒果叶,经干燥、粉碎处理,用6~10倍原料重量的酶溶液进行浸泡0.1hr~1.0hr,在pH4.0~7.0和40℃~55℃下水浴酶解1hr~4hr,并充分搅拌;
(2)、滤过,取药渣各用6~10倍重量的石油醚进行脱脂处理2~3次;
(3)、步骤(2)脱脂处理后的药渣用相当于6~10倍原料重量的60%~80%的乙醇水溶液提取2~3次,合并提取液,回收乙醇;
(4)、步骤(3)的提取液经喷雾干燥得干粉末,再将该干粉末用10%~30%乙醇水溶液进行溶解,离心过滤;
(5)、取步骤(4)离心过滤后的滤液,水浴减压浓缩干燥,得芒果苷。
优选的,步骤(5)得到的芒果苷,用20%~50%乙醇溶液进行重结晶两次,即得到芒果苷纯品。
优选的,步骤(1)中的酶溶液选自纤维素酶溶液、果胶酶溶液和木瓜蛋白酶溶液中的一种或多种。
优选的,步骤(1)中的酶解温度为50℃。
优选的,步骤(1)中的酶溶液pH值为4.0~5.0。
优选的,所述酶溶液pH值为4.5。
优选的,步骤(3)中的乙醇水溶液的浓度为75%。
优选的,步骤(4)中的乙醇水溶液的浓度为20%。
优选的,所述乙醇溶液的浓度为40%。
优选的,每克原料中加入酶的量分别为纤维素酶40μg~140μg、果胶酶20μg~120μg、木瓜蛋白酶1.5%~7.5%。
与现有技术相比,本发明采用酶法从芒果叶中提取芒果苷,进行废物利用,大大降低生产成本,既提高了产品的得率,又提高了产品的纯度,整个生产工艺条件温和,简单易行。
本发明中对于芒果叶先进行调pH值,然后再向其中加入活性酶,而没有采用先加入酶再调节pH值,能有效防止在加入酶制剂的溶液中,滴加强酸性溶液,造成溶液局部酸性太强,使得溶液中实际酶含量降低。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细描述,本部分的描述仅是示范性和解释性,不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。
实施例1
取漆树科植物芒果MangiferaindicaL.的干燥叶100g,粉碎,用800ml pH=4.5的纤维素酶水溶液(每g生药加入140μg纤维素酶)进行浸泡0.5hr,然后50℃水浴酶解2hr,并充分搅拌,滤过,取药渣各用600ml的石油醚进行脱脂处理两次,滤过,回收石油醚,药渣用相当于原药材6倍量的75%乙醇提取两次,合并提取液,回收乙醇,喷雾干燥得干粉末,再将此粉末用20%乙醇进行溶解,离心过滤15min,转速6000转/min,取滤液,浓缩至干得芒果苷粗品,再用40%乙醇进行重结晶两次,最终得到芒果苷精品。
实施例2
取漆树科植物芒果MangiferaindicaL.的干燥叶100g,粉碎,用1000ml pH=5.5的纤维素酶(每g生药加入140μg纤维素酶)与果胶酶(每g生药加入80μg果胶酶)1∶1水溶液进行浸泡0.5hr,然后50℃水浴酶解4hr,并充分搅拌,离心滤过30min,转速10000转/min,取药渣各用1000ml的石油醚进行脱脂处理两次,滤过,回收石油醚,药渣用相当于原药材10倍量的75%乙醇提取三次,合并提取液,回收乙醇,喷雾干燥得干粉末,再将此粉末用20%乙醇进行溶解,离心过滤,取滤液,浓缩至干得芒果苷粗品,再用40%乙醇进行重结晶三次,最终得到芒果苷精品。
实施例3
取芒果叶100g,用800ml pH=4.5的纤维素酶水溶液(每g生药加入140μg纤维素酶)进行浸泡0.5hr,然后50℃水浴酶解2hr,并充分搅拌,滤过,取药渣各用600ml的石油醚进行脱脂处理两次,滤过,回收石油醚,药渣用相当于原药材6倍量的75%乙醇提取两次,合并提取液,回收乙醇,喷雾干燥得干粉末,再将此粉末用20%乙醇进行溶解,过滤,取滤液,浓缩至干得芒果苷粗品,再用40%乙醇进行重结晶两次,最终得到芒果苷精品。
结果检测:
根据以上工艺试制三批样品,按含量测定方法依法测定芒果苷精品含量。结果见下表:
表1样品中芒果苷含量测定结果
含量测定方法学考察:
色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;色谱柱:迪马C18(20μm,4.6mm×250mm);柱温:30℃;甲醇~0.1%磷酸溶液(23∶77)为流动相;检测波长为258nm;理论塔板数按芒果苷峰计算不低于8000。
对照品溶液的制备:精密称取芒果苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备:取本品约10mg,精密称定,加40%甲醇50ml,称重,超声提取30min,放冷,补重,滤过,取续滤液,即得。
标准曲线制备:分别量取上述对照品溶液1、2、3、4、5ml,置10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀备用,在上述色谱条件下,分别进样20μl,记录色谱图,以峰面积对进样量进行回归,求得回归方程为:Y=90650X+27.034,r=0.99969。
精密度实验:取芒果苷对照品溶液20μl,连续进样5次,分别测定其峰面积,RSD为0.47%,结果表明仪器精密度符合要求。
稳定性实验:取供试品溶液,分别在0、4、8、12、24h进样,进行了24h考察,峰面积的RSD为0.25%,表明供试品溶液在24h内稳定。
重复性实验:取同一批供试品,精密称取约10mg,共6份,按供试品溶液制备方法制备,测定峰面积,结果表明重复性良好。
加样回收实验:精密称取已知含量的同一供试品约10mg,分别精密加入一定量的芒果苷对照品溶液,按供试品溶液制备方法制备,进样20μl,记录色谱图,计算回收率。结果平均回收率为99.82%,RSD为0.19%。
在本发明中突出优势体现在以下几点:
(1)本发明中我们采用长期被废置的芒果叶作为原料进行芒果苷的提取,其含量较高,且变废为宝,对芒果苷在不同植物中的含量进行研究,如下表所示:
表2不同产地、不同植物中芒果苷含量的对比研究
从以上整体研究得到结论:海南芒果叶中芒果苷含量的平均含量为1.79%~3.38%,知母为1.12%~1.77%,獐芽菜为1.19%~1.50%,龙胆为1.04%~1.41%,综合比较,海南芒果叶中芒果苷含量最高。
(2)本发明采用酶法处理药材,使芒果叶中细胞壁纤维组织结构破坏,最大程度的提高了芒果苷的提取率,数据见对比实验中的资料。
(3)本发明中采用75%以上的乙醇作提取溶剂而非采用低浓度的甲醇或乙醇水溶液作提取溶剂,因为低浓度的甲醇或者乙醇,其提取物中杂质太多,精制过程步骤多、而且使用普通方法很难得到芒果苷结晶;而用75%乙醇作溶剂,回收溶剂后可以得到杂质相对较少的芒果苷粗结晶,增加了生产操作中的安全性,减少了动力资源及纯化工序中试剂的浪费,同时也减少了有机试剂的使用量,从而降低了生产成本。
对比实验:
两种提取方法对于芒果叶中芒果苷转移率的影响
1.供试样品的制备
(1)本发明的纤维素酶法
取芒果叶10g,粉碎,用80ml pH=4.5的纤维素酶水溶液(每克生药加入140μg纤维素酶)进行浸泡0.5hr,然后50℃水浴酶解2hr,并充分搅拌,滤过,取药渣各用60ml的石油醚进行脱脂处理两次,滤过,回收石油醚,药渣用相当于原药材6倍量的75%乙醇提取两次,合并提取液,回收乙醇,喷雾干燥得干粉末,再将此粉末用20%乙醇进行溶解两次,离心过滤15min,转速6000转/min,取滤液,浓缩至干得芒果苷粗品,再用40%乙醇进行重结晶两次,最终得到芒果苷精品。重复工艺操作制备平行样品5份,计算芒果苷转移率的平均值。
(2)普通方法
取芒果叶10g,粉碎,用60ml的石油醚进行脱脂处理两次,滤过,回收石油醚,药渣用相当于原药材6倍量的75%乙醇提取两次,合并提取液,回收乙醇,喷雾干燥得干粉末,再将此粉末用20%乙醇进行溶解两次,离心过滤15min,转速6000转/min,取滤液,浓缩至干得芒果苷粗品,再用40%乙醇进行重结晶两次,最终得到芒果苷精品。重复工艺操作制备平行样品5份,计算芒果苷转移率的平均值。
专利200610079234.5“高纯度芒果苷的制备方法”中,以芒果叶或扁桃叶为原料,采用树脂法脱色,虽含量和纯度较高,但转移率仅为46.33%,不足我方专利芒果苷转移率的50%,而且成本较高,工艺较复杂。
2.检测方法
具体方法请见上述的结果检测步骤。
3.实验结果
(1)实验所选用芒果叶原料中芒果苷含量为2.23%,根据结果表明:采用纤维素酶法处理的样品最终芒果苷转移率为95.87%;而普通法处理的样品最终芒果苷转移率仅为78.78%,可见采用纤维素酶法工艺对于芒果苷的转移率有较大的影响。具体试验数据见下表:
表3两种提取方法对于芒果叶中芒果苷转移率的影响(n=5)
通过采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理,对平均转移率进行统计学分析,结果表明:纤维素酶法同普通法在芒果苷转移率方面有显著差异(P<0.05),说明纤维素酶法处理之后,能明显提高药材中芒果苷的转移率。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。