CN103667385B - 一种从蜘蛛香药渣中获得高纯度橙皮素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从蜘蛛香药渣中获得高纯度橙皮素的方法，该方法对提取总萜后的蜘蛛香药渣加热浸提2次，提取液调节pH后用大孔吸附树脂柱富集，先用去离子水洗脱，当流出液澄清后，再用质量浓度1%左右的氢氧化钠溶液洗脱，收集洗脱液，调洗脱液pH值，经酶解，离心过滤，重结晶，得到淡黄色针状结晶的高纯度橙皮素。该方法操作简单，生产成本低，资源利用率高，易于实现工业化生产。

Description

一种从蜘蛛香药渣中获得高纯度橙皮素的方法

技术领域

本发明涉及中药有效成分提取分离方法，特别涉及一种从蜘蛛香药渣中获得高纯度橙皮素的方法。

背景技术

蜘蛛香为败酱科缬草属植物蜘蛛香（ValerianajatamansiJones）的干燥根茎和根。分布于为我国四川，贵州，云南，湖南，湖北，陕西等地。具有疏散风热，利咽，透疹，明目退翳，解痉之效。用于治疗风热感冒，咽痛音哑，麻疹不透，风疹瘙痒，目赤翳障，惊风抽搐，破伤风。药理研究显示：蜘蛛香可作用于中枢神经系统，有镇静、催眠、抗惊厥和抗焦虑的作用；还可以治疗病毒性腹泻、季节性腹泻和肠易激综合症；而且其中环烯醚萜类化合物还能治疗良性的前列腺增生。化学成分研究表明：蜘蛛香中主要含有挥发油、环烯醚萜类和黄酮类，其中橙皮苷的含量是缬草属植物中含量最高的植物，随产地不同含量在0.4%～1.2%之间波动。

橙皮素（Hesperitin）属于二氢黄酮类化合物，别名：3,5,7-三羟基-4-甲氧基黄酮、圣草酚4-甲基醚。分子式为C₁₆H₁₄O₆，分子量为302.27，淡黄色针状结晶，熔点226℃-228℃。橙皮素易溶于乙醇、甲醇、丙酮，溶于稀碱溶液，部分溶于乙醚，微溶于水、氯仿和苯。药理作用：抗氧化，橙皮素可通过清除过氧亚硝酸根离子，避免过氧化反应带来的危害，如癌变。抗炎，橙皮素可以抑制炎性介质的介导作用，从而间接抑制炎症反应。与橙皮苷相比，橙皮素有更强的抗炎作用。降血脂，橙皮素可以抑制胆固醇的生成酶及酯化酶的作用，从而达到降血脂的作用。保护心血管，橙皮素具有降低血管渗透性的功效，可以起到预防血栓形成的作用。还可以通过刺激某些线粒体酶如琥珀酸脱氢酶等起到保护内皮细胞组织的缺氧作用，预防由内皮细胞坏死引起的凝血而诱发血栓形成。

目前制备橙皮素的方法主要有直接分离法，全合成法，水解法，微生物转化法等。因植物中的橙皮素含量很低使直接分离法得到橙皮素的成本高，收率低，不适于工业化生产；全合成法制备橙皮素的操作繁琐，收率低，成本高，不适合工业化生产；微生物转化法对生产条件要求苛刻，使获得橙皮素的成本高，不适于工业化生产；水解法主要是从芸香科植物（橙、柚、枳实等）中分离出橙皮苷再进行酸水解或是先进行水解在分离出橙皮素，该方法成本适中，但对环境的影响较大，不适于大面积推广。酶解法是近年来用于制备苷类化合物苷元的方法，该方法的优势在于酶解反应专属性高，副产物少，反应条件温和，对产物破坏小，产品收率高，操作简单，且对环境影响小。

如何从药用资源保护及合理利用的角度出发，寻找一种可以最大化的利用植物资源来获得橙皮素的方法，是一项非常有技术价值的研究课题。

发明内容

申请人通过研究发现蜘蛛香是除芸香科植物外橙皮苷含量最高的植物之一，而且目前蜘蛛香的主要药用部位为环烯醚萜类，在提取环烯醚萜类成份后药渣便弃掉，既污染环境又浪费资源。

申请人发现提取蜘蛛香中的环烯醚萜类成份使用的是体积浓度≥90%的高浓度乙醇，而蜘蛛香中所含的橙皮苷是二氢黄酮双糖苷类成分，高浓度乙醇是不能讲其溶解提取的，因此，大量的橙皮苷还保留在提取总萜后的蜘蛛香药渣中。

本发明的目的在于提供一种从提取总萜后的蜘蛛香药渣中获得高纯度橙皮素的方法，且该方法简单易行，收率高，资源利用率高，工业化前景良好。

为了实现上述任务，本发明采用的技术解决方案是：

1）提取：以提取总萜后的蜘蛛香提取渣为原料，用质量浓度5%的氢氧化钙水，在90℃条件下提取2次，第一次加入量为8BV，提取2h，第二次加入量为6BV，提取2h，提取液合并过滤，调节pH值为8～9，备用；

2）纯化：将调节pH值后的提取液上大孔树脂柱，树脂型号为AB-8，pH值为8～9，上样提取液量为5～6倍树脂柱体积，吸附流速1.5BV/h；待吸附饱和后用去离子水冲洗液冲柱，当流出液澄清后，洗后的柱体填料用质量浓度0.8%～1%的氢氧化钠洗脱液洗脱，洗脱液用量为2～3倍树脂柱体积，流速1BV/h，收集洗脱液；

3）酶解：将所得的洗脱液倒入反应釜中，调pH值至4～6后加热到35℃～55℃保温，在保温条件下加入原料中橙皮苷质量3/20～6/20的α-L-鼠李糖苷酶和原料中橙皮苷质量1/20～2/20的β-葡萄糖苷酶，酶解6～10h，酶解反应机理如图1所示。；

4）结晶：将酶解液放冷，离心，得到橙皮素粗品，橙皮素粗品用乙醇重结晶后，即可得浅黄色针状结晶的高纯度橙皮素。

本发明以提取总萜后的蜘蛛香药渣为原料，再用氢氧化钙水溶液做提取溶媒，随后用大孔树脂进行富集，最后用酶解法制备橙皮素；其中提取溶媒对环境影响小，树脂可重复再生利用，且经过树脂的富集使酶解转化率提高，大大提高了资源的利用率。本发明所述方法操作简单、生产成本低，资源利用率高，易于实现工业化生产。

附图说明

图1，本发明的酶解反应机理图。

图2，本发明的具体实施例分离提纯得到的橙皮素HPLC检测图谱，图中峰1表示橙皮素。

具体实施方式

以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。

一、橙皮苷的提取工艺研究

1.1研究目的

以提取液中橙皮苷的含量为考察指标，选择蜘蛛香药渣中橙皮苷提取的适宜方法和最佳工艺参数。

1.2实验因素与参数设计

以质量浓度5%的氢氧化钙水溶液为提取溶剂，蜘蛛香药渣为原料并采用热浸法提取橙皮苷的主要影响因素是加碱液量、提取时间、提取次数、浸提温度。因此，实验设计为4因素3水平，采用L₉（3⁴）正交表实验。提取实验的因素水平表设计请见表1，正交实验表请见表2。

表1提取实验因素水平表

1.3实验方法

蜘蛛香药渣9份，药渣中橙皮苷含量为1%，随机编为1～9号，每份药渣重50g，按正交实验设计表2中的各实验条件，加5%的氢氧化钙水溶液提取，合并提取液，滤过，收集滤液，分别测其提取液中橙皮苷的含量，统计结果。

表2提取实验正交实验表[L₉（3⁴）]

1.4实验结果与分析

实验结果及正交试验分析见表3。

由表3直观分析的结果可知，影响橙皮苷含量的主次因素排列为：提取次数（C）＞提取倍数（A）＞提取温度（D）＞提取时间（B），且C₂＞C₃＞C₁，A₂＞A₃＞A₁，D₃＞D₂＞D₁，B₂＞B₃＞B₁，由直观分析法得出的最优工艺为A₂B₂C₂D₃；由表4方差分析的结果可知，C因素对橙皮苷的提取转移率具有显著性影响，因此，选择橙皮苷的最佳提取条件为A₂B₂C₂D₃，即用质量浓度为5%氢氧化钙水溶液，90℃浸提2次，加入量各为8倍、6倍，浸提时间各为2小时。验证实验结果（见表5）显示，运用正交试验得出的最佳工艺提取橙皮苷，三组提取液中橙皮苷平均含量为1.79g，平均转移率达到89.5%，高于正交试验中任何一组试验所得橙皮苷的含量和转移率，说明按正交试验筛选的最优提取工艺提取橙皮苷转移率高、方法稳定、可行。

表3提取实验正交结果统计表

表4提取实验方差分析表

注：F_0.05(2,18)=3.55F_0.01(2,18)=6.01

表5提取工艺验证实验结果

二、橙皮苷的酶解工艺研究

2.1研究目的

以酶解产物中橙皮素的含量为考察指标，选择橙皮苷酶解的适宜方法和最佳工艺参数。

2.2实验因素与参数设计

以酶解法获得橙皮素的影响因素有α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶用量、酶解温度、酶解时间以及酶解pH值。因此，实验设计为5因素3水平，采用L₁₈（3⁷）正交表实验。酶解实验的因素水平表设计请见表6，正交实验表请见表7。

表6酶解实验因素水平表

2.3实验方法

橙皮苷洗脱液18份，洗脱液中橙皮苷含量为1.36mg/ml，随机编为1～18号，每份洗脱液200ml，按正交实验设计表7中的各实验条件，酶解后放凉，离心，得酶解产物，分别测各组酶解产物中橙皮素的含量，统计结果。

表7酶解实验正交实验表[L₁₈（3⁷）]

2.4试验结果与分析

实验结果及正交试验分析见表8。

由表8直观分析的结果可知，影响橙皮素含量的主次因素排列为：α-L-鼠李糖苷酶（A）＞酶解时间（D）＞酶解pH值（E）＞酶解温度（C）＞β-葡萄糖苷酶用量（B），且A₃＞A₂＞A₁，D₃＞D₂＞D₁，E₃＞E₂＞E₁，C₂＞C₃＞C₁，B₂＞B₃＞B₁，由直观分析法得出的最优工艺为A₃B₂C₂D₃E₃；由表9方差分析的结果可知，A因素对橙皮素的产率具有显著性影响，因此，选择橙皮苷的最佳酶解条件为A₃B₂C₂D₃E₃，即质量浓度5%的盐酸水溶液调pH至5后，反应釜升温到45℃后保温，然后在保温条件下先后加入原料中橙皮苷质量6/20的α-L-鼠李糖苷酶和原料中橙皮苷质量1.5/20的β-葡萄糖苷酶，酶解8h。验证实验结果（见表10）显示，运用正交试验得出的最佳工艺酶解橙皮苷得橙皮素，三组酶解产物中橙皮素平均含量为357.13mg，平均产率达到88.40%，高于正交试验中任何一组试验所得橙皮素的含量和产率，说明按正交试验筛选的最优酶解工艺得到橙皮素的产率高、方法稳定、可行。

表8酶解实验正交结果统计表

表9酶解实验方差分析表

注：F_0.05(2,4)=6.94F_0.01(2,4)=18

表10酶解工艺验证实验结果

实施例1

通过对以上提取及酶解工艺研究结果的分析，确定本发明的从提取总萜后的蜘蛛香药渣中提取分离橙皮素的最佳方法包括下列步骤：

1）取提取总萜后的蜘蛛香提取渣10kg，橙皮苷含量1%，用质量浓度5%的氢氧化钙水溶液，在90℃条件下提取2次，第一次加入量为80L，提取2h，第二次加入量为60L，提取2h，提取液合并过滤，用质量浓度5%的氢氧化钙水溶液调节pH值为8～9，备用；

2）将调节pH值后的提取液上大孔树脂柱，树脂型号为AB-8，pH值为8～9，上样提取液量120L，吸附流速为1.5BV/h，待吸附饱和后用去离子水洗脱，当流出液澄清后，洗后的柱体填料用质量浓度为0.8%～1%的氢氧化钠洗脱液洗脱，洗脱液用量为50L，流速1BV/h，收集洗脱液；

3）将所获得的洗脱液倒入反应釜中，质量浓度5%的盐酸水溶液调pH至5后，反应釜升温到45℃后保温，然后在保温条件下先后加入30gα-L-鼠李糖苷酶和7.5gβ-葡萄糖苷酶，酶解8h；

4）将酶解液放冷，离心，得到含量为80%的橙皮素粗品43g，橙皮素粗品用乙醇饱和溶解，然后加入0.5%活性炭脱色，过滤，滤液浓缩至总滤液体积的1/2，加入浓缩液2倍体积水结晶，即得浅黄色针状结晶的高纯度的橙皮素33g，HPLC检测，面积归一化法含量为99.5%，外标法含量为98.3%；

5）纯度98%的橙皮素HPLC检测方法及检测图谱。

①色谱条件

色谱柱：AgilentXDBC-184.6×250mm,5μm；

流动相：甲醇：水：磷酸=56：43：1（v/v）；

波长：288nm；

流速：1ml/min；

柱温：30℃；

样品浓度：8.47mg/50ml。

②检测谱图

检测谱图见图2。

实施例2

1）取提取总萜后的蜘蛛香提取渣10kg，橙皮苷含量1%，用质量浓度5%的氢氧化钙水溶液，在90℃条件下提取2次，第一次加入量为80L，提取2h，第二次加入量为60L，提取2h，提取液合并过滤，用质量浓度5%的氢氧化钙水溶液调节pH值为8～9，备用；

2）将调节pH值后的提取液上大孔树脂柱，树脂型号为AB-8，pH值为8～9，上样提取液量120L，吸附流速为1.5BV/h，待吸附饱和后用去离子水洗脱，当流出液澄清后，洗后的柱体填料用质量浓度为0.8%～1%的氢氧化钠洗脱液洗脱，洗脱液用量为50L，流速1BV/h，收集洗脱液；

3）将所获得的洗脱液倒入反应釜中，质量浓度5%的盐酸水溶液调pH至4后，反应釜升温到35℃后保温，然后在保温条件下先后加入15gα-L-鼠李糖苷酶和5gβ-葡萄糖苷酶，酶解6h；

4）将酶解液放冷，离心，得到含量为80%的橙皮素粗品37g，橙皮素粗品用乙醇饱和溶解，然后加入0.5%活性炭脱色，过滤，滤液浓缩至总滤液体积的1/2，加入浓缩液2倍体积水结晶，即得浅黄色针状结晶的高纯度的橙皮素26g，HPLC检测，面积归一化法含量为99.2%，外标法含量为98.1%；

5）橙皮素HPLC检测方法同实施例1。

实施例3

1）取提取总萜后的蜘蛛香提取渣10kg，橙皮苷含量1%，用质量浓度5%的氢氧化钙水溶液，在90℃条件下提取2次，第一次加入量为80L，提取2h，第二次加入量为60L，提取2h，提取液合并过滤，用质量浓度5%的氢氧化钙水溶液调节pH值为8～9，备用；

2）将调节pH值后的提取液上大孔树脂柱，树脂型号为AB-8，pH值为8～9，上样提取液量120L，吸附流速为1.5BV/h，待吸附饱和后用去离子水洗脱，当流出液澄清后，洗后的柱体填料用质量浓度为0.8%～1%的氢氧化钠洗脱液洗脱，洗脱液用量为50L，流速1BV/h，收集洗脱液；

3）将所获得的洗脱液倒入反应釜中，质量浓度5%的盐酸水溶液调pH至6后，反应釜升温到55℃后保温，然后在保温条件下先后加入30gα-L-鼠李糖苷酶和10gβ-葡萄糖苷酶，酶解10h；

4）将酶解液放冷，离心，得到含量为80%的橙皮素粗品40g，橙皮素粗品用乙醇饱和溶解，然后加入0.5%活性炭脱色，过滤，滤液浓缩至总滤液体积的1/2，加入浓缩液2倍体积水结晶，即得浅黄色针状结晶的高纯度的橙皮素30g，HPLC检测，面积归一化法含量为99.5%，外标法含量为98.4%；

5）橙皮素HPLC检测方法同实施例1。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (1)

1.一种从蜘蛛香药渣中获得高纯度橙皮素的方法，其特征在于按以下步骤进行：

1)取提取总萜后的蜘蛛香药渣，测定橙皮苷的含量，用质量浓度5％的氢氧化钙水溶液，在90℃条件下提取2次，第一次加入量为8BV，提取2h，第二次加入量为6BV，提取2h，两次提取液合并过滤，用质量浓度5％的氢氧化钙水溶液调节pH值为8～9，备用；

2)将调节pH值后的提取液上大孔树脂柱，树脂型号为AB-8，pH值为8～9，上样提取液量为5～6倍树脂柱体积，吸附流速1.5BV/h；待吸附饱和后用去离子水冲洗液冲柱，当流出液澄清后，洗后的柱体填料用质量浓度0.8％～1％的氢氧化钠洗脱液洗脱，洗脱液用量为2～3倍树脂柱体积，流速1BV/h，收集洗脱液；

3)将所获得的洗脱液倒入反应釜中，质量浓度5％的盐酸水溶液调pH值至4～6后加热到35℃～55℃保温，在保温条件下加入原料中橙皮苷质量3/20～6/20的α-L-鼠李糖苷酶和原料中橙皮苷质量1/20～2/20的β-葡萄糖苷酶，酶解6～10h；

4)将酶解液放冷，结晶析出，离心，得到含量为80％的橙皮素粗品，橙皮素粗品用乙醇饱和溶解，然后加入0.5％活性炭脱色，过滤，滤液浓缩至总滤液体积的1/2，加入浓缩液2倍体积水结晶，即可得浅黄色针状结晶的含量为98％的橙皮素。