CN102504007A - 一种鲁斯考皂苷元单体的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鲁斯考皂苷元单体的分离纯化方法，属于中药活性成分的分离纯化技术领域。本发明的具体工艺步骤包括以甲醇或乙醇提取总皂苷，加入浓酸硫水解总皂苷，加入乙酸乙酯萃取总皂苷元，通过制备型高效液相色谱分离鲁斯考皂苷元单体，于45℃-75℃减压浓缩、干燥制备鲁斯考皂苷元单体产品。该方法操作简便，生产周期短，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现大量鲁斯考皂苷元单体的高纯度分离制备，得到纯度大于98%的鲁斯考皂苷元单体。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物化合物单体的制备方法，具体涉及从麦冬的块根中提取分离鲁斯考皂苷元单体的方法，属于中药活性成分的分离纯化技术领域。
背景技术
鲁斯考皂苷元主要来源于百合科沿阶草属植物麦冬Ophiopogon Japonicus（Thunb.) Ker-Gawl.的干燥块根，含多种甾体皂甙：麦冬皂甙A、B、C、D均具有抗心肌梗塞，增强心肌收缩力，增加冠脉流量等作用，甙元均为鲁斯考皂苷元，具有明显的抗血栓活性，能降低血清及组织的NO、MDA水平，保护各组织免受自由基攻击，对心、肺作用更明显并下调肺组织 TF基因表达，具有很好的药用前景，但由于在原植物中鲁斯考皂苷元极少以原型存在均是以皂苷形式存在，影响了其药效发挥。
结构式：
目前主要采用柱层析及结晶等常规手段进行鲁斯考皂苷元单体的分离纯化，效率低，产量少，工艺不稳定，成本较高。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的缺陷，提供一种从麦冬中分离纯化鲁斯考皂苷元单体的方法。该方法操作简便，生产周期短，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现工业化鲁斯考皂苷元单体的高纯度分离制备，得到的鲁斯考皂苷元单体的纯度达98％以上。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种鲁斯考皂苷元单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤：
A、提取总皂苷：
取麦冬块根药材，粉碎成1-4mm的粗粉置于容器中，按药材质量：溶液质量1Kg: (6-10)L加入体积分数均为70-90%的甲醇或乙醇中，加热回流提取3-5次，每次提取时间为1-3小时，过滤，滤液合并，并于60-90℃浓缩成相对密度为1.0-1.1的浸膏；
本步骤通过粉碎、加热回流提取、减压浓缩，所得的总皂苷浸膏中主要含有皂苷和黄酮等成分。
B、水解总皂苷：
将步骤A所得浓缩后的浸膏置于耐酸容器中，加入占浸膏体积1%-3%的浓硫酸搅拌，加热至沸腾，保持沸腾水解1.5-3.5小时，放冷至室温，滤布过滤，收集黑色固体物；
本步骤中，采用加酸加热沸腾的方式将提取浸膏中的总皂苷水解为皂苷元，提高目标物的浓度。
C、提取总皂苷元：
于步骤B所得黑色固体物中加入体积百分比1-5%氢氧化钠水溶液洗涤至中性，按固体质量：溶液体积为1Kg: (8-12)L加入乙酸乙酯溶液，室温浸泡提取3-5次，每次2-4小时，过滤，收集滤液，50-75℃减压浓缩至干，再按固体质量：溶液体积1Kg：4L加入纯甲醇使固体溶解，经孔隙为0.45微米的有机滤膜过滤，收集滤液；
本步骤通过乙酸乙酯提取、甲醇溶解、有机滤膜过滤，可进一步除去大部分杂质，纯化鲁斯考皂苷元。
D、通过制备型高效液相色谱分离鲁斯考皂苷元单体：
取步骤C所得的滤液进样，进行鲁斯考皂苷元单体的制备分离，紫外检测器在线监测针对性收集鲁斯考皂苷元的制备馏分溶液，得鲁斯考皂苷元单体溶液；
所述制备型高效液相色谱采用填料为C18的色谱柱、流动相组成为：体积分数65-85%的甲醇水溶液。
所述紫外检测器检测波长为205nm。
本发明在进行高效制备液相色谱分离前，可通过液-质联用或其它本技术领域常用的方法，如气-质联用、核磁共振碳谱、氢谱等确定高效液相色谱中鲁斯考皂苷元单体的峰形。
以液-质联用（HPLC-MS）方法为例，可采用填料为C18的色谱柱，流动相组成为：体积分数65-85%的甲醇水溶液，柱温为室温，检测波长为205nm，取步骤C所得的澄清透明滤液适量进样，进行鲁斯考皂苷元单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定鲁斯考皂苷元单体在液相色谱中所对应的峰形及归属。由于制备型高效液相色谱分离鲁斯考皂苷元单体也采用C18色谱柱，且流动相组成相同，因而可用于推断在制备型高效液相色谱中鲁斯考皂苷元单体的出峰位置及峰形等。
E、干燥制备鲁斯考皂苷元单体产品：
取步骤D所得鲁斯考皂苷元单体溶液，于45℃-75℃减压浓缩至干，再将固体物于45-85℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，即得鲁斯考皂苷元单体产品。
由于高效液相色谱对样品溶液的纯度、色泽等要求均较高，通过提取等简单处理得到的提取液不能直接作为样品溶液进入高效液相色谱系统，否则既可能达不到良好的分离效果，还可能对高效液相色谱系统的色谱柱等配件产生难以逆转的影响，缩短其使用周期；而色谱柱等液相色谱的相关配件成本通常较高，其使用周期的缩短显然将造成最终产品的生产成本大大提高；因而，对进入高效液相色谱的样品溶液要求较高，其前处理过程非常重要。
麦冬药材中除含有皂苷外，还含有糖类、黄酮类、微量元素等非常复杂的成分，其中鲁斯考皂苷元单体成分含量极低，大部分以皂苷形式存在，要获得可直接进入高效液相色谱系统的样品，需要先进行提取及水解处理。针对麦冬药材中存在的各种成分的理化性质，本发明方法通过前述步骤A、B、C的顺序搭配，以及适当的参数组合，可有效提取出鲁斯考皂苷元等成分，并除去大量杂质，获得可以进入制备型高效液相色谱系统的样品溶液（即步骤C得到的澄清透明滤液），不至对高效液相色谱系统造成很大的影响，尽量延长其使用周期，节约生产成本。
在高效液相色谱分离过程中，色谱条件的选择非常重要，它对样品溶液中各物质的出峰顺序、峰形、分离效果等起着决定性的作用；色谱条件主要包括色谱柱（包括填料、柱长及内径等）、流动相（包括组成及流速等）、柱温、检测波长、检测器等，各色谱条件的选择及其组合至关重要。
本发明通过大量的试验研究及对比分析，确定了如上所述的各色谱条件，使样品溶液中各物质的出峰时间、峰形、分离效果等最佳化，有利于鲁斯考皂苷元单体得到充分有效的分离。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、通过步骤A对所述冬麦块根药材的粉碎、加热回流提取、减压浓缩，确保了所得的总皂苷浸膏中主要含有皂苷和黄酮等成分。
2、通过步骤B乙酸乙酯提取、甲醇溶解、有机滤膜过滤，进一步除去了大部分杂质，纯化了鲁斯考皂苷元。
3、采用制备型高效液相色谱系统对鲁斯考皂苷元单体进行分离，通过最适宜的前处理方法和色谱条件等，达到良好的分离效果，并且紫外检测器在线监测，针对性收集鲁斯考皂苷元单体，目标明确，避免了常规柱层析和先分离后检测造成的资源浪费。
4、采用制备型高效液相色谱分离过程直观，目标性强，对产品的质量易于控制，产品纯度可达98%以上。
3、操作简便，生产周期短，分离效率高，收率高，产量大，工艺稳定可靠，重现性好，成本低廉，适合工业化生产。
附图说明
图1是本发明实施例1鲁斯考皂苷元的高效液相制备色谱图，图中记录为3针样品连续进样色谱图，图中峰1、2、3为鲁斯考皂苷元；
图2是本发明实施例2鲁斯考皂苷元单体产品复检的高效液相分析色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
下述各实施例中，终产品鲁斯考皂苷元单体的纯度复检均采用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）法，色谱条件如下：
流动相组成为：甲醇-水，二者体积比为85:15；流速1.0mL/min；
色谱柱填料为C18，粒度为5um，色谱柱内径为4.6mm，长度为150mm；
检测波长为205nm。
实施例1
一种鲁斯考皂苷元单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤：
A、提取总皂苷：
取麦冬药材100kg，粉碎成1-4mm的粗粉，置1x1033L3提取罐中，加入体积分数为90%的甲醇600L，加热回流提取5次，每次提取时间为3小时，过滤，滤液合并，并于60℃浓缩成相对密度为1.1的浸膏约80L；
B、水解总皂苷：
将步骤A所得浓缩后的浸膏80L置于耐酸容器中，加入0.8L浓硫酸搅拌，加热至沸腾，保持沸腾水解3.5小时，放冷至室温，滤布过滤，收集黑色固体物约11.32Kg；
C、提取总皂苷元：
将步骤B所得黑色固体物11.32Kg，加入40L质量体积分数2%的氢氧化钠水溶液洗涤至中性，加入90.56L乙酸乙酯溶液，室温浸泡提取5次，每次3小时，过滤，收集滤液，60℃减压浓缩至干得固体物25.1g，加入100.4ml甲醇溶液使固体溶解，经空隙为0.45微米的有机滤膜过滤得液体约100ml；
D、通过制备型高效液相色谱分离鲁斯考皂苷元单体：
（a）、确定高效液相色谱中鲁斯考皂苷元单体的峰形及归属：
通过液-质联用（HPLC-MS），采用填料为C18的色谱柱（C18粒度为5um，柱长为250mm，内径4.6mm），流动相组成为体积分数65%的甲醇水溶液，流速1mL/min，柱温为室温，检测波长为205nm，取步骤C所得滤液10ul进样，进行鲁斯考皂苷元单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定鲁斯考皂苷元单体在液相色谱中所对应的峰形，出峰时间t=17.88-19.39min的峰所对应的物质为鲁斯考皂苷元单体。
（b）、制备鲁斯考皂苷元单体：
采用填料为C18的色谱柱（内径80mm，C18粒度为8um），流动相组成为体积分数65%的甲醇水溶液，流速为140mL/min，检测波长为205nm，取步骤C所得的澄清透明滤液进样，进行鲁斯考皂苷元单体的制备分离，紫外检测器在线监测，根据步骤（a）确定的高效液相色谱中黄柏碱单体的峰形等情况，针对性收集鲁斯考皂苷元单体的制备馏分溶液（出峰时间为48-51min），得鲁斯考皂苷元单体溶液；
E、干燥制备鲁斯考皂苷元单体产品：
取步骤D所得鲁斯考皂苷元的甲醇水溶液，于75℃减压浓缩至干，再将固体物于45℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，即得鲁斯考皂苷元单体产品15.21g。
通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为98.82%。
实施例2
一种鲁斯考皂苷元单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤：
A、提取总皂苷：
取麦冬药材300kg，粉碎成1-4mm的粗粉，置3x1033L提取罐中，加入体积分数为85%的乙醇2400L，加热回流提取4次，每次提取时间为2小时，过滤，滤液合并，于85℃浓缩成相对密度为1.0的浸膏约180L；
B、水解总皂苷：
将步骤A所得浓缩后的浸膏180L置于耐酸容器中，加入5.4L浓硫酸搅拌，加热至沸腾，保持沸腾水解2.5小时，放冷至室温，滤布过滤，收集黑色固体物34.89Kg；
C、提取总皂苷元：
将步骤B所得黑色固体物34.89Kg，加入60L质量体积分数5%的氢氧化钠水溶液洗涤至中性，加入340.89L乙酸乙酯溶液，室温浸泡提取4次，每次4小时，过滤，收集滤液，75℃减压浓缩至干得固体物85.06g，加入340.24ml甲醇溶液使固体溶解，经空隙为0.45微米的有机滤膜过滤得液体约335ml；
D、通过制备型高效液相色谱分离鲁斯考皂苷元单体：
（a）、确定高效液相色谱中鲁斯考皂苷元单体的峰形及归属：
通过液-质联用（HPLC-MS），采用填料为C18的色谱柱（C18粒度为5um，柱长为250mm，内径4.6mm），流动相组成为体积分数85%的甲醇水溶液，流速1mL/min，柱温为室温，检测波长为205nm，取步骤C所得的澄清透明滤液10ul进样，进行鲁斯考皂苷元单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定鲁斯考皂苷元单体在液相色谱中所对应的峰形，出峰时间t=15.88-16.39min的峰所对应的物质为鲁斯考皂苷元单体。
（b）、制备鲁斯考皂苷元单体：
采用填料为C18的色谱柱（内径80mm，C18粒度为8um），流动相组成为体积分数85%的甲醇水溶液，流速为140mL/min，检测波长为205nm，取步骤C所得的澄清透明滤液进样，进行鲁斯考皂苷元单体的制备分离，紫外检测器在线监测，根据步骤（a）确定的高效液相色谱中黄柏碱单体的峰形等情况，针对性收集鲁斯考皂苷元单体的制备馏分溶液（出峰时间为29-32min），得鲁斯考皂苷元单体溶液；
E、干燥制备鲁斯考皂苷元单体产品：
取步骤D所得鲁斯考皂苷元的甲醇水溶液，于60℃减压浓缩至干，再将固体物于85℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，即得鲁斯考皂苷元单体产品45.6g。
通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为99.10%。
实施例3
一种鲁斯考皂苷元单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤：
A、提取总皂苷：
取麦冬药材50kg，粉碎成1-4mm的粗粉，置1x1033L提取罐中，加入体积分数为70%的甲醇600L，加热回流提取3次，每次提取时间为1小时，过滤，滤液合并，于90℃浓缩成相对密度1.1的浓浸膏约20L；
B、水解总皂苷：
将步骤A所得浓缩后的总皂苷浸膏20L置于适量耐酸容器中，加入0.4L浓硫酸搅拌，加热至沸腾，保持沸腾水解1.5小时，放冷至室温，滤布过滤，收集黑色固体物6.15Kg；
C、提取总皂苷元：
将步骤B所得黑色固体物6.15Kg，加入10L质量体积分数1%的氢氧化钠水溶液洗涤至中性，加入73.8L乙酸乙酯溶液，室温浸泡提取3次，每次2小时，过滤，收集滤液，50℃减压浓缩至干得固体物16.2g，加入64.8ml甲醇溶液使固体溶解，经空隙为0.45微米的有机滤膜过滤得液体约62ml；
D、通过制备型高效液相色谱分离鲁斯考皂苷元单体：
（a）、确定高效液相色谱中鲁斯考皂苷元单体的峰形及归属：
通过液-质联用（HPLC-MS），采用填料为C18的色谱柱（C18粒度为5um，柱长为250mm，内径4.6mm），流动相组成为体积分数75%的甲醇水溶液，流速1mL/min，柱温为室温，检测波长为205nm，取步骤C所得的澄清透明滤液10ul进样，进行鲁斯考皂苷元单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定鲁斯考皂苷元单体在液相色谱中所对应的峰形，出峰时间t=20.88-21.65min的峰所对应的物质为鲁斯考皂苷元单体。
（b）、制备鲁斯考皂苷元单体：
采用填料为C18的色谱柱（内径80mm，C18粒度为8um），流动相组成为体积分数75%的甲醇水溶液，流速为140mL/min，检测波长为205nm，取步骤C所得的澄清透明滤液进样，进行鲁斯考皂苷元单体的制备分离，紫外检测器在线监测，根据步骤（a）确定的高效液相色谱中黄柏碱单体的峰形等情况，针对性收集鲁斯考皂苷元单体的制备馏分溶液（出峰时间为45-47min），得鲁斯考皂苷元单体溶液；
E、干燥制备鲁斯考皂苷元单体产品：
取步骤D所得鲁斯考皂苷元的甲醇水溶液，于45℃减压浓缩至干，再将固体物于60℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，即得鲁斯考皂苷元单体产品7.46g。
通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为98.56%。
Claims (3)
1.一种鲁斯考皂苷元单体的分离纯化方法，其特征在于包括下述主要步骤：
A、提取总皂苷：
取麦冬块根药材，粉碎成1-4mm的粗粉置于容器中，按药材质量：溶液质量1Kg: (6-10)L加入体积分数均为70-90%的甲醇或乙醇中，加热回流提取3-5次，每次提取时间为1-3小时，过滤，滤液合并，并于60-90℃浓缩成相对密度为1.0-1.1的浸膏；
B、水解总皂苷：
将步骤A所得浓缩后的浸膏置于耐酸容器中，加入占浸膏体积1%-3%的浓硫酸搅拌，加热至沸腾，保持沸腾水解1.5-3.5小时，放冷至室温，滤布过滤，收集黑色固体物；
C、提取总皂苷元：
于步骤B所得黑色固体物中加入体积百分比1-5%氢氧化钠水溶液洗涤至中性，按固体质量：溶液体积为1Kg: (8-12)L加入乙酸乙酯溶液，室温浸泡提取3-5次，每次2-4小时，过滤，收集滤液，50-75℃减压浓缩至干，再按固体质量：溶液体积1Kg：4L加入纯甲醇溶液使固体溶解，经孔隙为0.45微米的有机滤膜过滤，收集滤液；
D、通过制备型高效液相色谱分离鲁斯考皂苷元单体：
取步骤C所得的滤液进样，进行鲁斯考皂苷元单体的制备分离，紫外检测器在线监测针对性收集鲁斯考皂苷元的制备馏分溶液，得鲁斯考皂苷元单体溶液；
E、干燥制备鲁斯考皂苷元单体产品：
取步骤D所得鲁斯考皂苷元单体溶液，于45℃-75℃减压浓缩至干，再将固体物于45-85℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，即得鲁斯考皂苷元单体产品。
2.如权利要求1所述鲁斯考皂苷元单体的分离纯化方法，其特征在于所述制备型高效液相色谱采用填料为C18的色谱柱、流动相组成为：体积分数65-85%的甲醇水溶液。
3.如权利要求1所述鲁斯考皂苷元单体的分离纯化方法，其特征在于所述紫外检测器检测波长为205nm。
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