CN105012372A

CN105012372A - 一种半仿生酶法提取柿叶总黄酮的方法和应用

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Publication number: CN105012372A
Application number: CN201510430464.0A
Authority: CN
Inventors: 郭增军; 薛璇玑; 赵雅韵; 陈子章; 陈建; 王希颖
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2015-07-21
Filing date: 2015-07-21
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2035-07-21
Also published as: CN105012372B

Abstract

本发明公开了一种半仿生酶法提取柿叶总黄酮的方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明将半仿生法和生物酶结合起来提取柿叶中的总黄酮成分，通过设置不同的pH梯度，达到模拟药物在体内运转吸收的目的。本方法与单独使用半仿生法或酶法相比，提取率高，提取条件温和，操作简单，环境友好，适合工业化大规模生产。本方法提取的柿叶总黄酮具有很好的α-糖苷酶抑制活性。

Description

一种半仿生酶法提取柿叶总黄酮的方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种半仿生酶法提取柿叶总黄酮的方法和应用。

背景技术

柿(Diospyros kaki Linn.f)亦称朱果。属柿树科柿属。原产长江流域，现黄河以南广为栽培。目前，我国是世界上产柿最多的国家。柿叶是柿树的新鲜或干燥叶。本草再新记载其：“味苦，性寒，无毒”，“专入肺经”。柿叶可以制茶，日本民间素有饮柿叶茶的习惯。它是一种健身饮料，含有与茶叶相类似的单宁物质，沏水后清香扑鼻，柿叶茶为无毒的利尿剂，经常饮用能增进机体的新陈代谢、利小便、通大便、净化血液、使机体组织细胞复苏。柿叶具有抗菌消炎、降压降糖、润肺强心、镇咳止血、抗癌防癌等功效，其生理活性广泛且安全无毒。

现代研究表明，黄酮类化合物是柿叶主要有效成分，具有保护心脑血管系统、抗癌、抗氧化、降血糖血脂、抗菌止血等生理活性，且不良反应少、使用安全，逐渐被人们所关注。其中，关于总黄酮降血糖作用的研究也取得了不少的成果。研究结果发现柿叶总黄酮可以减弱四氧嘧啶对胰岛β细胞的损伤或改善受损伤细胞的功能，有益于缓解糖尿病小鼠的症状。同时，柿叶总黄酮有助于糖尿病小鼠抗氧化能力的提高，提示这可能是其降血糖作用的机制之一。但柿叶总黄酮对于酵母来源的α-糖苷酶活性抑制作用尚未见报道。

目前，关于黄酮的提取方法有热水提法、酶解提取法、超声波辅助提取法等，但存在有机溶剂耗费量大、污染环境等问题。半仿生酶法是一种新型的环保高效的提取方法，用此种方法提取柿叶黄酮尚未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种半仿生酶法提取柿叶总黄酮的方法和应用。本方法操作简单，提取率高，适合工业化大规模的生产需求。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种半仿生酶法提取柿叶总黄酮的方法，包括以下步骤：

(1)取粉碎后的柿叶，按1g：8～10mL的料液比，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为浸取剂，调节体系pH值为1.5～3.0，充分震荡均匀，于70℃～80℃水浴提取后过滤；

(2)在步骤(1)所得的滤渣中添加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，调节体系pH值为3.0～5.0，加入破坏植物细胞壁的酶，充分震荡均匀，于40℃～60℃水浴提取后过滤；

其中，破坏植物细胞壁的酶的用量为粉碎后柿叶质量的0.3％～0.6％；

(3)在步骤(2)所得的滤渣中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为提取液，调节体系pH值为7.0～8.0，充分混匀，在70℃～80℃下回流提取，过滤；

(4)在步骤(3)所得的滤渣中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为提取液，调节体系pH值为8.1～8.5，充分混匀，在70℃～80℃下回流提取，过滤；

(5)将步骤(1)～(4)得到的滤液合并，回收溶剂并真空干燥，得到包含柿叶总黄酮的干浸膏。

所述消解植物细胞壁的酶为纤维素酶、β-葡聚糖酶或提取复合酶。

步骤(1)和步骤(2)中的水浴提取时间为1～2h。

步骤(3)和步骤(4)中的回流提取时间为1～2h。

步骤(5)所述的真空干燥在60℃～80℃下进行。

本发明还公开了采用上述方法制得的柿叶总黄酮在制备α-糖苷酶抑制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开的半仿生酶法提取柿叶总黄酮的方法将半仿生法和生物酶结合起来提取柿叶中的总黄酮成分，通过设置不同的pH梯度，达到模拟药物在体内运转吸收的目的。本发明采用的半仿生酶法与单独使用酶法、半仿生法相比，提取率有所提高。本发明的提取条件温和，操作简单、提取率高，适合工业化大规模的生产需求。

经本发明方法制得的柿叶总黄酮具有很好的α-糖苷酶抑制活性。通过测定柿叶黄酮半数抑制浓度显示：柿叶黄酮的黄酮含量28.37％，IC₅₀值为2.96μg/mL，抑制α-葡萄糖苷酶的强度是阳性对照药阿卡波糖的77.4倍。以上药效学结果说明柿叶总黄酮有着意想不到的抑制α-糖苷酶的效果，从而可以预期该柿叶总黄酮可作为糖苷酶抑制剂药物，尤其是防治Ⅱ型糖尿病，即非胰岛素依赖型糖尿病药物之用途。

附图说明

图1为柿叶总黄酮不同浓度对α-糖苷酶抑制活性影响的曲线图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

半仿生酶法(选用提取复合酶)提取柿叶总黄酮的方法，包括以下步骤：

1)取粉碎后的柿叶，按1g:8mL的料液比，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为浸取剂，调节pH为2.0，充分震荡均匀，70℃水浴2h后过滤。

2)在步骤1)滤渣中添加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，调节pH为3.5，加入提取复合酶，充分震荡均匀，60℃水浴2h后过滤；所述酶的用量为柿叶质量的0.6％。

所述提取复合酶购自宁夏和氏璧生物技术有限公司，包含β-葡聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶，其中，各种酶的活力为：β-葡聚糖酶≧300万u/g，纤维素酶≧40万u/g，木聚糖酶≧260万u/g，果胶酶≧2万u/g。

3)在步骤2)滤渣中依次加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为提取液，调节pH值为7.0，充分混匀，在70℃下回流提取2h，过滤。

4)在步骤3)滤渣中依次加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为提取液，调节pH值为8.5，充分混匀，在70℃下回流提取2h，过滤。

5)将步骤1)～4)得到的滤液合并，回收溶剂并真空干燥，得干浸膏4.3g。

实施例2

半仿生酶法(选用果胶酶)提取柿叶总黄酮的方法，包括以下步骤：

1)取粉碎后的柿叶，按1g:10mL的料液比，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为浸取剂，调节pH为2.0，充分震荡均匀，70℃水浴2h后过滤。

2)在步骤1)滤渣中添加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，调节pH为3.5，加入破坏植物细胞壁的酶，充分震荡均匀，60℃水浴2h后过滤；所述酶的用量为柿叶质量的0.6％。

5)将步骤1)～4)得到的滤液合并，回收溶剂并真空干燥，得干浸膏4.2g。

1、黄酮含量测定

准确称取0.0100mg芦丁标准品以60％乙醇溶解，定容至50ml容量瓶中得到0.0200mg/mL的芦丁标准液。分别准确量取0、1、2、3、4、5、6、7mL此标准液于8个25mL容量瓶中，依次分别加入1.0mL 5％NaNO3溶液，摇匀静置6min；1mL 10％Al(NO₃)₃溶液，摇匀后静置6min；10mL 4％NaOH，用60％乙醇稀释至刻度，静置15min后在510nm处测定吸光度。最后，以各组中芦丁标品浓度(mg/mL)为横坐标，其吸光度A为纵坐标，得到芦丁标准曲线及标准曲线回归方程。

样品黄酮含量测定：精密称取样品浸膏3份，每份0.0500g，分别定容至50mL容量瓶中，标记1、2、3组。从每组容量瓶中各精密量取5mL样液3份至3个25mL容量瓶中，得到9组待测品。每组依次分别加入1.0mL 5％NaNO3溶液，摇匀静置6min；1mL 10％Al(NO₃)₃溶液，摇匀后静置6min；10mL 4％NaOH,用60％乙醇稀释至刻度，静置15min。在510nm处测定吸光度。将各组吸光度数据代入标准曲线回归方程计算黄酮含量。柿叶总黄酮(1)黄酮含量分别为：28.37％，柿叶总黄酮(2)黄酮含量为：27.10％。

2、半仿生法、酶法单独使用的提取对比例：

对比例1

酶法(选用提取复合酶)提取柿叶总黄酮的方法，包括以下步骤：

1)取粉碎后的柿叶，按1g:8mL的料液比，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，调节pH为3.6左右，50℃水浴酶解2h，酶解后滤过。

2)在步骤1)滤渣加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，70℃回流3次，每次1h，合并滤液，回收溶剂并于80℃真空干燥，得干浸膏3.9g。

经黄酮含量测定，计算其黄酮含量为20.5％。

对比例2

半仿生法提取柿叶总黄酮的方法，包括以下步骤：

1)取粉碎后的柿叶，按1g:8mL的料液比，加入pH值为2.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为提取液，在70℃下回流提取2h。过滤。

2)向步骤(1)滤渣中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为提取液，调节pH值为7.5，在70℃下回流提取2h。过滤。

3)向步骤(2)滤渣中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为提取液，调节pH值为8.3，在70℃下回流提取2h。过滤。

4)合并提取液，回收溶剂并于80℃真空干燥，得干浸膏4.0g。

经黄酮含量测定，计算其黄酮含量为23.4％。

由实施例和对比例可以看出，相较于单独使用酶法和半仿生法，半仿生酶法提取的柿叶黄酮的浸膏量和黄酮含量都有很大提高，同时，其作为一种清洁环保的提取方法，操作简便，条件温和，适合大规模工业生产。

3、α-糖苷酶抑制活性试验

本发明采用pNPG法测定柿叶总黄酮的α-糖苷酶抑制活性。pNPG全名为对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，利用α-糖苷酶可以将pNPG分解为pNP及葡萄糖，且pNP在碱性环境下显色的原理测定样品中黄酮的糖苷酶抑制活性。实验阿卡波糖作为阳性对照，最终对比样品与阳性对照品对于糖苷酶活性抑制的重要参数50％抑制率，即IC₅₀值，来确定样品黄酮的α-糖苷酶抑制活性。

对照品：阿卡波糖(商品名：拜糖苹，50mg/片，德国拜耳公司)。阳性对照药-阿卡波糖溶液的配制：精密称取50mg阿卡波糖，置于1.5mL的EP管中，用移液枪加入1mL PBS溶液，配制成50mg/mL的贮备液。将样品液滤过后，倍半稀释，配制成浓度分别为50，25，12.5，6.25，3.125…0.09765mg/mL的10组对照品溶液。测试溶液的配制:精密称取某萃取物样品50mg，置于1.5mL的EP管中，用移液枪加入1mLDMSO溶解，配制成50mg/mL的贮备液。将贮备液滤过后，倍半稀释配制成适合浓度梯度的数组测试溶液。

反应体系如表1所示：

表1反应体系表(单位：μL)

将测试样品或阳性对照组阿卡波糖溶液，酶，缓冲液按照反应体系表中的用量混合置于a、b、c、d四个试管中，37度孵化10min后分别加入α-pNPG(α-葡萄糖苷酶，S.cerevisiae，G0660-750U)，在37度反应20min，之后加入Na₂CO₃终止反应，在405nm测吸光度，分别记录a、b、c、d四组的吸光度，根据如下公式计算抑制率：

抑制率＝[1-(c-d/a-b)]×100％[其中a、b、c、d为四组对应的吸光度].

经测定，阳性对照阿卡波糖的IC₅₀值为229μg/mL，参见图1，为柿叶总黄酮α-糖苷酶抑制曲线，其IC₅₀值为：2.96μg/mL，为阳性对照活性的77.4倍。

Claims

1.一种半仿生酶法提取柿叶总黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取粉碎后的柿叶，按1g：8～10mL的料液比，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为浸取剂，调节体系pH值为1.5～3.0，充分震荡均匀，于70℃～80℃水浴提取后过滤；

（2）在步骤（1）所得的滤渣中添加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，调节体系pH值为3.0～5.0，加入破坏植物细胞壁的酶，充分震荡均匀，于40℃～60℃水浴提取后过滤；

其中，破坏植物细胞壁的酶的用量为粉碎后柿叶质量的0.3%～0.6%；

（3）在步骤（2）所得的滤渣中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为提取液，调节体系pH值为7.0～8.0，充分混匀，在70℃～80℃下回流提取，过滤；

（4）在步骤（3）所得的滤渣中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为提取液，调节体系pH值为8.1～8.5，充分混匀，在70℃～80℃下回流提取，过滤；

（5）将步骤（1）～（4）得到的滤液合并，回收溶剂并真空干燥，得到包含柿叶总黄酮的干浸膏。

2.根据权利要求1所述的一种半仿生酶法提取柿叶总黄酮的方法，其特征在于，所述消解植物细胞壁的酶为纤维素酶、β-葡聚糖酶或提取复合酶。

3.根据权利要求1所述的一种半仿生酶法提取柿叶总黄酮的方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中的水浴提取时间为1～2h。

4.根据权利要求1所述的一种半仿生酶法提取柿叶总黄酮的方法，其特征在于，步骤（3）和步骤（4）中的回流提取时间为1～2h。

5.根据权利要求1所述的一种半仿生酶法提取柿叶总黄酮的方法，其特征在于，步骤（5）所述的真空干燥在60℃～80℃下进行。

6.采用权利要求1～5中任意一项所述方法制得的柿叶总黄酮在制备α-糖苷酶抑制剂中的应用。