CN108323752A - 一种青梅酵素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种青梅酵素的制备方法，属于发酵食品工程领域。该方法包括以下步骤：原料的挑选和预处理、原料混合、分阶段发酵、发酵后处理、螯合陈化、液体酵素产品制备、酵素固体剩余物再利用。本发明的制备方法所得到的青梅酵素有效维持了青梅的功能性活性成分，具有良好的抗氧化活性和降血糖活性，而且得到具有氨基酸组成和蛋白质营养组成结构合理的特殊营养和保健功能青梅酵素产品。
Description
技术领域
本发明属于发酵食品工程领域，具体涉及一种青梅酵素及其制备工艺。
背景技术
青梅（Prunus mume）主要分布在江苏、广东、浙江、广西、云南等地，在浙江杭州、湖州、宁波、绍兴等地区均有种植，其中长兴青梅、超山青梅、萧山大青梅等最为著名。青梅营养丰富，是一种有价值的可以药食两用的果实，每100 g
果肉中含有机酸5.99 g；还原糖0.845 g；单宁0.45 g；黄酮0.74 mg；氨基酸658.5 mg，其中8种为人体所需的氨基酸；维生素A 0.89 mg，维生素E 0.17 mg，磷21.59 mg，铁4.08mg，锌0.74 mg，Ca/P 接近1:1，易于人体吸收。青梅是一种低糖高酸的食物，研究表明，青梅具有防心血管病、抗肿瘤疾病、防癌症、抗骨质疏松等功效。
食用植物酵素（Edible plant source Jiaosu）是以一种或多种新鲜蔬菜、水果和谷豆类、海藻类、食药两用本草类、菌菇类等食材为原料，加（或不加）糖类物质，在较低温度下，经多种有益菌通过较长时间发酵而生产的功能性微生物发酵产品，拥有丰富的代谢产物功能成分、植物本身营养成分和益生菌本身功能成分等，特别是富有小分子功能成分，研究表明该类产品具有抗衰老、抗菌消炎、净化血液、增强机体免疫能力及解毒抗癌等多种保健功能。以青梅为原料进行青梅食用植物酵素的制备，有利于保持青梅的营养成分，同时发酵过程中的功能性成分如有机酸和蛋白质、氨基酸等也能够较好地保持。
目前关于青梅的加工多数是以青梅果脯、果酒、果茶等为主，很少有关于青梅酵素的研究报道。中国发明专利CN 106036841 A公开了一种青梅酵素及其生产工艺，采用了青梅、葡萄、蔓越莓、桂圆肉、桑葚和抗坏血酸等为原料经过酶解、均质、益生菌发酵等工艺处理得到富含白藜芦醇和超氧化物歧化酶的青梅酵素。中国发明专利CN 106620012 A公开了青梅酵素营养液及其制备方法，采用青梅、干枸杞、蜜糖、寡糖、干酵母和水等为原料，通过将青梅打成浆，将干枸杞煮水，再加入蜜糖、寡糖、干酵母发酵而成。中国发明专利CN106667867 A公开了一种青梅酵素护理液，将水果类原料与蔬菜类原料清洗、灭菌，切碎后添加白砂糖、蛋白酶、纤维素酶和果胶酶，密封发酵4~6个月制得青梅酵素，该专利仅提到该产品在活化皮肤细胞，提高肌肤含水量上等的应用。目前在青梅酵素制备上的研究报道还仅限于少于半年的短期发酵，而且极少有关于营养型和功能型青梅酵素产品的报道，对于青梅酵素的功能性成分分析也鲜有报道。
发明内容
为了弥补现有发明技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种青梅酵素的制备方法，本方法可较好地保留青梅原料中的生物活性成分，充分发挥青梅的营养价值，生产工艺易行，适用于工业化大规模生产。
本发明的另一个目的是提供一种功能性的青梅植物酵素产品，该青梅酵素富含丰富的有机酸、氨基酸、多酚、GABA（γ-氨基丁酸）和蛋白质等功能性成分，营养成分结构合理，且具有良好的生物生理学活性。
为解决上述技术问题，本发明包括以下步骤：
所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）原料的挑选和预处理：挑选无腐烂、无异味的青梅或青梅与水果的混合物，用无菌水或臭氧反复冲洗青梅表面，除去青梅果实表面上的灰尘等杂物，经自然晾干，或切片、切块、破碎，或打浆得到浆液，得到预处理后的青梅原料物料，备用；
（2）原料混合：将步骤（1）中预处理后的物料中加入糖类物质，搅拌均匀备用；或将步骤（1）中预处理后的物料中加入糖类物质、酵素菌原液或酵素菌粉末，搅拌均匀备用；
（3）分阶段发酵：将步骤（2）中所得的原料混合物搅拌混合均匀后进行自然发酵、或外接菌种发酵、或自然发酵与外接菌种发酵的组合发酵，将发酵得到的青梅原液，经固液分离后，得到青梅酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，得到的青梅酵素发酵液或浓缩原浆进行螯合陈化，得到青梅酵素原液；
（4）液体酵素产品制备：将步骤（3）得到的青梅酵素原液制成青梅酵素液体口服液，或青梅酵素胶囊，或经过低温浓缩、喷雾干燥、造粒后得到青梅酵素原液粉末，或经过配伍后得到复配青梅酵素产品；
（5）酵素固体剩余物再利用：将步骤（3）得到的酵素固体剩余物经过真空冷冻干燥、粉碎、造粒后得到青梅酵素固体剩余物粉末。
所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（1）中水果为瓜类水果、浆果类水果、柑橘类水果、核果类水果、仁果类水果、菠萝、芒果、栗子、椰子、奇异果、芭乐、榴 莲、香蕉、甘蔗、百合、莲子、石榴、核桃、拐枣、酸果蔓、接骨木红、黑加仑、诺丽果或莲雾中的一种或多种。
所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中糖类物质为蔗糖、果糖、蜂蜜、葡萄糖、黑糖、红糖、冰糖、纤维二糖、L-阿拉伯糖、果葡糖浆、麦芽糖、大豆低聚糖、低聚果糖、异麦芽低聚糖、低聚半乳糖、低聚木糖、水苏糖、棉籽糖、低聚壳聚糖、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇中的一种或多种或配成糖浆液。
所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中糖类物质中固体糖重量占物料重量的20～80%。
所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中酵素菌原液为发酵180d~1000 d的不同植物酵素发酵液中的一种或几种，酵素菌粉末为发酵180d~1000 d的不同植物酵素发酵液中的一种或几种，经真空冷冻干燥后得到的菌粉。
所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中酵素菌原液或酵素菌粉末占物料重量的0.5%~50%。
所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（3）中自然发酵条件为：将混合物料置于经灭菌处理后的发酵容器中进行三阶段发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量0~80%，搅拌转速0~200rpm，发酵温度10～40℃，发酵时间1～6个月；第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2Mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间6～36个月；第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到青梅酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，青梅酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2Mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间1～36个月，得到青梅酵素原液。
所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（3）中外接菌种发酵条件为：将混合物料置于经灭菌处理后的发酵容器中接入0.2%～10%的高活性菌种进行三阶段发酵，第一阶段发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量0~80%，搅拌转速0~200rpm，发酵温度10～40℃，发酵时间1～6个月；第二阶段发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2Mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间6～36个月；第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到青梅酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，青梅酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2Mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间1～36个月，得到青梅酵素原液。
所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（3）中自然发酵与外接接种发酵的组合发酵为：将混合物料置于经灭菌处理后的发酵容器中进行三阶段发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量0~80%，搅拌转速0~200rpm，发酵温度10～40℃，发酵时间1～6个月；第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2Mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间6～36个月；第三阶段发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到青梅酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，青梅酵素发酵液或浓缩原浆中加入0.2%~10%高活性菌种，进行厌氧发酵，并螯合陈化，发酵容器压力维持在0~0.2Mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间1～36个月，得到青梅酵素原液。
所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的高活性菌种为鲁氏接合酵母CGMCC12131、双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、丙酸杆菌属、明串球菌属、酵母菌、片球菌属、醋酸菌、米曲霉、黑曲霉、红茶菌、冠突散囊菌、纳豆菌或红曲菌中的一种或多种。
本发明中鲁氏接合酵母CGMCC12131为从树莓酵素中分离出来的酵母菌，该菌可耐pH 2.5，可在900 g/L的葡萄糖浓度下生长，所述的菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC) ，保藏号为CGMCC12131，其基因序列已上传到GenBank数据库，编号为KT956240。
本发明中复配青梅酵素产品为：自然发酵青梅酵素原液或浓缩原浆与植物活性萃取物、微量元素、天然维生素和氨基酸、低聚糖中的一种或一种以上原辅料进行复配，得到复合青梅酵素。
本发明中水果具体可为西瓜、美人瓜、甜瓜、香瓜、黄河蜜、哈密瓜、木瓜、宣木瓜、乳瓜等瓜类水果。草莓、蓝莓、黑莓、树莓、桑葚、覆盆子、葡萄、青提、红提、水晶葡萄、马奶子等浆果类水果，蜜橘、砂糖橘、金橘、越橘、蜜柑、甜橙、脐橙、西柚、柚子、葡萄柚、柠檬、文旦、香泡、莱姆等柑橘类水果。桃（油桃，蟠桃，水蜜桃，黄桃）、李子、樱桃、杏、青梅、杨梅、西梅、乌梅、大枣、沙枣、海枣、蜜枣、酸枣、金丝小枣、橄榄、荔枝、龙眼（桂圆）、槟榔等核果类水果。苹果（红富士，红星，国光，秦冠，黄元帅）、梨（砂糖梨，黄金梨，莱阳梨，香梨，雪梨，香蕉梨）、蛇果、海棠果、沙果、柿子、山竹、黑布林、枇杷、杨桃、山楂、圣女果、无花果、白果、罗汉果、火龙果、猕猴桃等仁果类水果。菠萝、芒果、栗子、椰子、奇异果、芭乐、榴莲、香蕉、甘蔗、百合、莲子、石榴、核桃、拐枣、酸果蔓、接骨木红、黑加仑、诺丽果、莲雾中的一种或多种。
本发明的有益效果：
（1）本发明采用了自然发酵、或外接菌种发酵、或自然发酵与外接菌种发酵相结合，经过长时间发酵，使得青梅原料中的营养物质充分溶出，经过微生物代谢作用形成特殊风味物质。
（2）本发明的制备方法所得到的青梅酵素有效保留了青梅中的有机酸、氨基酸、GABA（γ-氨基丁酸）和蛋白质等功能性成分，具有良好的抗氧化活性，最终获得的成分或风味得到改善的具有特殊营养和保健功能的食用产品。
（3）本发明通过多阶段发酵，既充分保障了微生物的自身生长，又有利于功能性微生物代谢产物的积累。
附图说明
图1为青梅酵素发酵过程中DPPH自由基清除能力变化；
图2为青梅酵素发酵过程中ABTS自由基清除能力变化；
图3为青梅酵素发酵过程中羟基自由基清除能力变化；
图4 为青梅酵素发酵过程中还原力变化；
图5为青梅酵素发酵过程中总多酚含量变化；
图6为青梅酵素发酵过程中总酸的变化；
图7为青梅酵素发酵过程中有机酸变化，图中1.草酸（oxalic acid） 2.L-酒石酸（L-tartaric acid） 3.L-苹果酸（L-malic acid） 4.莽草酸（shikimic acid ） 5.抗坏血酸（ascorbic acid） 6.乳酸（lactic acid） 7.醋酸（acetic acid） 9.柠檬酸（citric acid）10.富马酸（fumaric acid） 11.琥珀酸（succinic acid）；
图8为青梅酵素发酵过程中氨基酸含量变化，图中（a）1：天冬氨酸（Asp）；（b）3：丝氨酸（Ser）；4：谷氨酸（Glu）；5：脯氨酸（Pro）；6：甘氨酸（Gly）；（b）7：丙氨酸（Ala）；8：半胱氨酸（Cys）；9：缬氨酸（Val）；10：蛋氨酸（Met）；11：异亮氨酸（Ile）；（c）2：苏氨酸（Thr）；12：亮氨酸（Leu）；13：酪氨酸（Tyr）；14：苯丙氨酸（Phe）；15：γ-氨基丁酸（GABA）；16：赖氨酸（Lys）；17：组氨酸（His）；18：精氨酸（Arg）（d）发酵过程中氨基酸总量变化（不含GABA）；（e）发酵过程中18种氨基酸含量变化汇总图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明进行进一步的解释，但并不用于限制本发明。
实施例1
一种青梅酵素的制备方法，包括以下制备步骤：挑选无腐烂、无异味的青梅5kg，葡萄1kg，用无菌水反复冲洗青梅和葡萄表面，除去青梅和葡萄果实表面上的灰尘等杂物，经打浆得到浆液，得到预处理后的青梅和葡萄原料物料；将物料放入已消毒的清洁干燥容器内，加入占物料0.5%的植物酵素菌菌粉，占物料80%的浓度为30%的蔗糖，搅拌均匀，接入总质量为10%的酵母菌、乳酸菌、醋酸菌和双歧杆菌的混合菌种，进行第一阶段自然发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量80%，搅拌转速200rpm，发酵温度40℃，发酵时间6个月；再将发酵容器密封，进行第二阶段自然发酵，第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0.2Mpa，发酵温度40℃，发酵时间36个月；再将发酵容器密封，进行第三阶段自然发酵，第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到青梅酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，青梅酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0.2Mpa，发酵温度40℃，发酵时间36个月，得到青梅酵素原液。
上述的青梅酵素原液可以制成青梅酵素液体口服液，或青梅酵素胶囊，或经过低温浓缩、喷雾干燥、造粒后得到青梅酵素原液粉末，或经过配伍后得到复配青梅酵素产品；上述的酵素固体剩余物经过真空冷冻干燥、粉碎、造粒后得到青梅酵素固体剩余物粉末。
实施例1中蔗糖糖浆液可以替换为蜂蜜、果糖、葡萄糖、红糖、冰糖、纤维二糖、L-阿拉伯糖、果葡糖浆、麦芽糖、大豆低聚糖、低聚果糖、异麦芽低聚糖、低聚半乳糖、低聚木糖、水苏糖、棉籽糖、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇中的一种或多种或配成糖浆液。葡萄可替换为西瓜、美人瓜、甜瓜、香瓜、黄河蜜、哈密瓜、木瓜、宣木瓜、 乳瓜等瓜类水果。草莓、蓝莓、黑莓、树莓、桑葚、覆盆子、葡萄、青提、红提、水晶葡萄、马奶子等浆果类水果，蜜橘、砂糖橘、金橘、越橘、蜜柑、甜橙、脐橙、西柚、柚子、葡萄柚、柠檬、文旦、 香泡、莱姆等柑橘类水果。桃（油桃，蟠桃，水蜜桃，黄桃）、李子、樱桃、杏、青梅、杨梅、西梅、 乌梅、大枣、沙枣、海枣、蜜枣、酸枣、金丝小枣、橄榄、荔枝、龙眼（桂圆）、槟榔等核果类水果。 苹果（红富士，红星，国光，秦冠，黄元帅）、梨（砂糖梨，黄金梨，莱阳梨，香梨，雪梨，香蕉梨）、 蛇果、海棠果、沙果、柿子、山竹、黑布林、枇杷、杨桃、山楂、圣女果、无花果、白果、罗汉果、火 龙果、猕猴桃等仁果类水果。菠萝、芒果、栗子、椰子、奇异果、芭乐、榴莲、香蕉、甘蔗、百合、 莲子、石榴、核桃、拐枣、酸果蔓、接骨木红、黑加仑、诺丽果、莲雾中的一种或多种。
实施例2
一种青梅酵素的制备方法，包括以下制备步骤：挑选无腐烂、无异味的新鲜青梅5kg，用无菌水反复冲洗青梅表面，除去青梅果实表面上的灰尘等杂物，经自然晾干，得到预处理后的青梅原料物料，放入已消毒的清洁干燥容器内，加入占物料0.5%的植物酵素菌菌粉、加入占物料60%的浓度为80%的蔗糖糖浆液，适当搅拌，进行第一阶段自然发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量40%，搅拌转速100rpm，发酵温度25℃，发酵时间3.5个月；再将发酵容器密封，进行第二阶段自然发酵，第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0.1Mpa，发酵温度25℃，发酵时间21个月；再将发酵容器密封，进行第三阶段自然发酵，第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到青梅酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，青梅酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0.1Mpa，发酵温度25℃，发酵时间18.5个月，得到青梅酵素原液。
实施例3
一种青梅酵素的制备方法，包括以下制备步骤：挑选无腐烂、无异味的新鲜青梅5kg，用无菌水反复冲洗青梅表面，除去青梅果实表面上的灰尘等杂物，经自然晾干，得到预处理后的青梅原料物料，放入已消毒的清洁干燥容器内，加入占物料0.5%的植物酵素菌原液，占物料30%浓度为40%的冰糖糖浆液，适当搅拌。进行第一阶段自然发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量20%，搅拌转速0rpm，发酵温度10℃，发酵时间1个月；再将发酵容器密封，进行第二阶段自然发酵，第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0Mpa，发酵温度10℃，发酵时间6个月；再将发酵容器密封，进行第三阶段自然发酵，第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到青梅酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，青梅酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0Mpa，发酵温度10℃，发酵时间1个月，得到青梅酵素原液。
实施例4
一种青梅酵素的制备方法，包括以下制备步骤：挑选无腐烂、无异味的青梅5kg，用无菌水反复冲洗青梅表面，除去青梅果实表面上的灰尘等杂物，经打浆得到浆液，得到预处理后的青梅原料物料，放入已消毒的清洁干燥容器内，加入占物料30%的浓度为30%的异麦芽低聚糖和占物料5%的植物酵素菌原液，搅拌均匀，接入总质量为10%的鲁氏接合酵母CGMCC12131、乳酸菌和双歧杆菌的混合菌种，适当搅拌，进行第一阶段发酵，第一阶段发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量40%，搅拌转速100rpm，发酵温度25℃，发酵时间3.2个月；再将发酵容器密封，进行第二阶段发酵，第二阶段发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0.1Mpa，发酵温度25℃，发酵时间21个月；再将发酵容器密封，进行第三阶段自然发酵，第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到青梅酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，青梅酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0.1Mpa，发酵温度25℃，发酵时间18.5个月，得到青梅酵素原液。
实施例5
一种青梅酵素的制备方法，包括以下制备步骤：挑选无腐烂、无异味的青梅5kg，用无菌水反复冲洗青梅表面，除去青梅果实表面上的灰尘等杂物，经自然晾干，或切片、切块、破碎，或打浆得到浆液，得到预处理后的青梅原料物料，放入已消毒的清洁干燥容器内，加入占物料50%的浓度为50%的葡萄糖和占物料0.5%的酵素菌菌粉，搅拌均匀。进行第一阶段自然发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量80%，搅拌转速100rpm，发酵温度40℃，发酵时间6个月；再将发酵容器密封，进行第二阶段自然发酵，第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0.1Mpa，发酵温度25℃，发酵时间36个月；再将发酵容器密封，进行第三阶段发酵，第三阶段发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到青梅酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，青梅酵素发酵液或浓缩原浆中加入5.1%的米曲霉、酵母菌、乳酸菌和醋酸菌混合菌种，进行厌氧发酵，并螯合陈化，发酵容器压力维持在0.1Mpa，发酵温度25℃，发酵时间30个月，得到青梅酵素原液。
下面以清除DPPH、ABTS自由基、羟基自由基清除、还原力的能力，进一步说明实施例1-5提供的青梅酵素的抗氧化作用。以总酚、总酸、有机酸、氨基酸和蛋白质的营养来评价青梅酵素的功能性。
试验例1
1 材料和方法
1.1材料
本发明实施例1-5提供的青梅酵素。
1.2 方法
1.2.1 DPPH清除率的测定
取50 μL样品，加水至2 mL，分别加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液，450 μL 50mmol/L Tris-HCl 缓冲溶液（pH 7.4），混匀，25℃下恒温水浴30 min。以去离子水为参比溶液，在517 nm下测定吸光度。
（1）
式中：A0——空白对照液的吸光度；
A1——样品测定管的吸光度；
A2——样品本底管的吸光度。
1.2.2 ABTS清除率的测定
称取38.41mg ABTS和6.62 mg过硫酸钾，用pH 7.4 5 mmol/L的PBS定容至10 mL，室温下黑暗放置反应12-16 h，使用前用上述PBS缓冲液稀释，使其在734 nm下吸光度为0.70 ±0.02。取10 μL样品，加PBS缓冲溶液至300 μL，加入5 mL上述稀释液，混匀，30 ℃下反应1h。以去离子水为参比溶液，在734 nm下测定吸光度。按照上述公式（1）计算ABTS自由基清除能力。
1.2.3羟基自由基清除能力
取50 μL 样品加水至2 mL，加入1.4 mL 6 mmol/L H2O2，0.6 mL 20 mmol/L 水杨酸钠和2 mL 1.5 mmol/L硫酸亚铁，混匀后37 ℃下恒温水浴1 h。以去离子水为参比溶液，在510nm下测定吸光度。按照公式（1）计算羟基自由基清除能力。
1.2.4还原力
取70 μL样品，加0.2 mol/L，pH 6.6的磷酸缓冲液至2.5 mL，与2.5 mL 1%铁氰化钾（w/v）混合均匀后，50℃下反应30 min，加入10%三氯乙酸（w/v） 2.5 mL，混合均匀，静置10min，取2.5 mL上清液，与2.5 mL去离子水和0.5 mL 0.1%三氯化铁（w/v）充分混合，以去离子水为参比溶液，在700 nm下测定。吸光度值越高，说明其还原力越强。
1.2.5发酵过程中总多酚含量变化
参照GB/T 31740.2-2015茶多酚的检测方法，取适量样品，加水至1 mL，加入5 mL 10%福林酚试剂，混匀，反应3 min后，加入4 mL 7.5% Na2CO3溶液，混匀，25℃反应60 min。以样品空白为参比溶液，在765 nm处测吸光值。以没食子酸为标品，绘制标准曲线。
1.2.6 发酵过程中总酸含量变化
根据GB/T 12456-2008食品中总酸的测定方法进行检测。
1.2.7 有机酸分析
取发酵液，10000 r/min高速离心10 min后，取上清液，用0.01 mol/L KH2PO4溶液（用磷酸调pH至2.7）稀释5倍，过0.22μm的微孔滤膜，用于有机酸分析。青梅原料去核打浆后，10000 r/min 高速离心取上清液备用。色谱柱：Agilent TC C18柱（250 mm*4.6mm i.d.，5微米）；检测波长：210 nm，流动相为甲醇：KH2PO4（0.01mol/L，pH 2.7）=2∶98（V/V），流速1mL/min，柱温：20℃。
1.2.8 氨基酸分析
参考国标GB/T 5009.124-2003，取1 mL发酵液于水解管中，加入6 mol/L HCl 10 mL，重蒸酚3～4滴，冷却5 min，在氮吹仪上充入高纯氮气，将已封口的水解管放在干燥箱内110℃水解 22 h 后，取出。冷却后小心打开水解管，将水解液全部转移至 25 mL 容量瓶中，用去离子水多次冲洗水解管，定容，过滤。取1 mL滤液，用真空干燥器在45±5℃干燥，残留物加1 mL水溶解，再干燥，用1 mL流动相溶解，过0.22 μm的水相微孔滤膜，上机进样，进样量20 μL，脯氨酸在440 nm处测定，其余17种氨基酸在570 nm处测定。
1.2.9 酵素中蛋白质营养评价
采用AAS、CS、RC三种评价体系，选取发酵前期、中期和后期3个时间点发酵液与原料进行分析，计算公式如下：
其中RAA为氨基酸比值。当比值系数等于1时，说明食物中氨基酸组成与模式一致；比值系数大于1，表示该氨基酸相对过剩；小于1，表示该氨基酸相对不足。比值系数最小的氨基酸为限制性氨基酸。
2 结果与分析
实施例1中青梅酵素清除DPPH自由基的实验结果如见图1所示。青梅酵素对DPPH自由基清除能力呈先显著增加后缓慢增加的趋势，青梅酵素经284 d 的发酵，酵素原液DPPH自由基清除能力从发酵初期的15.79%增加到43.53%，增加175.68%。
实施例2中青梅酵素清除ABTS自由基的实验结果如见图2所示。随着发酵时间的延长，青梅酵素发酵液对ABTS自由基清除能力呈先显著增加后缓慢增加的趋势，从发酵初期的14.79%，经284d的发酵增加到71.58%，增加了383.98%。
实施例3中青梅酵素清除羟基自由基的实验结果如见图3所示。青梅酵素发酵过程中，前40 d发酵，青梅酵素发酵液对羟基自由基清除能力呈急剧增加的趋势，从最初的38.50%增加到58.23%。
实施例4中青梅酵素还原力的实验结果如见图4所示。青梅酵素发酵液的还原力呈先显著增加后缓慢增加趋势，经284 d的发酵，还原力从发酵初期的0.148增加到0.578，发酵前后还原力升高了290.54%。
实施例1中青梅酵素总多酚的实验结果如图5所示。随着发酵时间的延长，青梅酵素液中总多酚含量呈先显著增加后缓慢增加的趋势，发酵284 d，由发酵前160.05 μg/mL增加至680.41 μg/mL。
实施例2中青梅酵素总酸的实验结果如图6所示。青梅酵素发酵初期，总酸含量增加明显，在第10 d至20 d期间，总酸含量从0.157 mol/L增加至0.433 mol/L。
实施例3中青梅酵素有机酸的实验结果如图7所示。青梅酵素发酵过程中，各种有机酸的含量均有所增加，苹果酸、柠檬酸在发酵20 d内变化明显，分别增加了179.58%、225.44%；从发酵37 d开始检测到乳酸，发酵至284 d，含量增加至0.45 mg/mL，发酵至 284d，其含量增加至1.29 mg/mL，发酵至284 d，琥珀酸含量增加至0.59 mg/mL。
实施例4中青梅酵素氨基酸的实验结果如图8所示。从图中可以看出青梅酵素发酵液中氨基酸含量由高到低依次为：Asp＞Glu＞GABA＞Ala＞Arg＞Val＞Thr＞Leu＞Pro＞Ser＞Lys＞Gly＞Phe＞Ile＞Tyr＞His＞Met＞Cys，其中Asp、Glu和GABA的含量较高；除Cys、Met外，其它16种氨基酸的含量在发酵过程中均有所增加，且发酵前37 d变化显著，37d后变化缓慢。发酵液中蛋白质类氨基酸总量从发酵初期的2.950 mg/mL 增加到4.013 mg/mL，增长了36.03%。
实施例5中不同发酵时间青梅酵素氨基酸的含量实验结果如表1所示。不同发酵时间的青梅酵素样品中均含有18种氨基酸，且Asp、Glu和GABA的含量均较高；几种原料中鲜味（Asp和Glu）和甜味（Ala、Gly、Pro和Ser）氨基酸的含量较芳香族氨基酸（Phe和Tyr）的含量高。
表1 不同发酵时间青梅酵素氨基酸的含量
注：表中*：必需氨基酸，T：氨基酸总量（不含GABA），E：人体必须氨基酸总量，CE：儿童必需氨基酸总量，N：非必须氨基酸，Σa为鲜味氨基酸含量（Asp+Glu），Σb为甜味氨基酸含量（Ala+Gly+Pro+Ser）Σc为芳香族氨基酸含量（Phe+Tyr）
实施例4中不同发酵时间青梅酵素蛋白质营养价值AAS评价结果如表2所示。青梅原料提取液中Ile和Leu分别为第一、第二限制氨基酸，除Thr的AAS值大于100%外，其余几种必需氨基酸的AAS值均低于100%。青梅酵素发酵液中，除Met+Cys外，其余几种氨基酸在发酵过程中含量均有所增加，且发酵过程中，几种样品的AAS值均大于100%。
表2 不同发酵时间青梅酵素蛋白质营养价值AAS
注：#：第一限制氨基酸，*：第二限制氨基酸
实施例3中不同发酵时间青梅酵素蛋白质营养价值CS评价结果如表3所示。青梅原料提取液中Ile、Leu分别为第一、第二限制氨基酸，其余几种氨基酸的CS值均小于100%，其中Thr的CS值接近100%；发酵81 d，179 d的青梅酵素发酵液中几种氨基酸的CS值均大于100%，发酵284 d的青梅酵素发酵液中，除Met+Cys外，其余几种氨基酸的CS值均大于100%，青梅酵素发酵过程中， Met+Cys的CS值随着发酵时间的增加而降低，其余几种氨基酸的CS值在发酵过程中均有所增加。
表3 不同发酵时间青梅酵素蛋白质营养价值CS
注：#：第一限制氨基酸，*：第二限制氨基酸
实施例2中不同发酵时间青梅酵素蛋白质营养价值CS评价结果如表4所示。从表中可以看出：青梅原料中Val和Phe+Tyr的含量基本上符合氨基酸模式谱中的要求；Ile、Leu的含量相对不足；其余几种氨基酸的含量相对过剩。青梅酵素发酵过程中Lys基本上符合氨基酸模式谱中的要求；Thr、Val，发酵过程中相对过剩；Ile在发酵81、179 d时含量相对不足，发酵284 d时，含量基本符合氨基酸模式谱中的要求；Met+Cys 和Leu在发酵过程中含量相对不足，Phe+Tyr在发酵81 d是含量相对不足，发酵179 d时基本符合氨基酸模式谱中的要求。
表4 不同发酵时间青梅酵素蛋白质营养价值RC
注：#：第一限制氨基酸，*：第二限制氨基酸
实施例4中的青梅酵素进行降血糖功效评价，结果表明青梅酵素原液对α-淀粉酶的抑制率达50.08%，说明青梅酵素具有一定的降血糖作用。
Claims (10)
1.一种青梅酵素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）原料的挑选和预处理：挑选无腐烂、无异味的青梅或青梅与水果的混合物，用无菌水或臭氧反复冲洗青梅表面，除去青梅果实表面上的灰尘等杂物，经自然晾干，或切片、切块、破碎，或打浆得到浆液，得到预处理后的青梅原料物料，备用；
（2）原料混合：将步骤（1）中预处理后的物料中加入糖类物质，搅拌均匀备用；或将步骤（1）中预处理后的物料中加入糖类物质、酵素菌原液或酵素菌粉末，搅拌均匀备用；
（3）分阶段发酵：将步骤（2）中所得的原料混合物搅拌混合均匀后进行自然发酵、或外接菌种发酵、或自然发酵与外接菌种发酵的组合发酵，将发酵得到的青梅原液，经固液分离后，得到青梅酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，得到的青梅酵素发酵液或浓缩原浆进行螯合陈化，得到青梅酵素原液；
（4）液体酵素产品制备：将步骤（3）得到的青梅酵素原液制成青梅酵素液体口服液，或青梅酵素胶囊，或经过低温浓缩、喷雾干燥、造粒后得到青梅酵素原液粉末，或经过配伍后得到复配青梅酵素产品；
（5）酵素固体剩余物再利用：将步骤（3）得到的酵素固体剩余物经过真空冷冻干燥、粉碎、造粒后得到青梅酵素固体剩余物粉末。
2.如权利要求1所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（1）中水果为瓜类水果、浆果类水果、柑橘类水果、核果类水果、仁果类水果、菠萝、芒果、栗子、椰子、奇异果、芭乐、榴 莲、香蕉、甘蔗、百合、莲子、石榴、核桃、拐枣、酸果蔓、接骨木红、黑加仑、诺丽果或莲雾中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中糖类物质为蔗糖、果糖、蜂蜜、葡萄糖、黑糖、红糖、冰糖、纤维二糖、L-阿拉伯糖、果葡糖浆、麦芽糖、大豆低聚糖、低聚果糖、异麦芽低聚糖、低聚半乳糖、低聚木糖、水苏糖、棉籽糖、低聚壳聚糖、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇中的一种或多种或配成糖浆液。
4.如权利要求1所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中糖类物质中固体糖重量占物料重量的20～80%。
5.如权利要求1所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中酵素菌原液为发酵180d~1000 d的不同植物酵素发酵液中的一种或几种，酵素菌粉末为发酵180d~1000 d的不同植物酵素发酵液中的一种或几种，经真空冷冻干燥后得到的菌粉。
6.如权利要求1所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中酵素菌原液或酵素菌粉末占物料重量的0.5%~50%。
7.如权利要求1所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（3）中自然发酵条件为：将混合物料置于经灭菌处理后的发酵容器中进行三阶段发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量0~80%，搅拌转速0~200rpm，发酵温度10～40℃，发酵时间1～6个月；第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2Mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间6～36个月；第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到青梅酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，青梅酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2Mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间1～36个月，得到青梅酵素原液。
8.如权利要求1所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（3）中外接菌种发酵条件为：将混合物料置于经灭菌处理后的发酵容器中接入0.2%～10%的高活性菌种进行三阶段发酵，第一阶段发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量0~80%，搅拌转速0~200rpm，发酵温度10～40℃，发酵时间1～6个月；第二阶段发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2Mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间6～36个月；第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到青梅酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，青梅酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2Mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间1～36个月，得到青梅酵素原液。
9.如权利要求1所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（3）中自然发酵与外接接种发酵的组合发酵为：将混合物料置于经灭菌处理后的发酵容器中进行三阶段发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量0~80%，搅拌转速0~200rpm，发酵温度10～40℃，发酵时间1～6个月；第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2Mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间6～36个月；第三阶段发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到青梅酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，青梅酵素发酵液或浓缩原浆中加入0.2%~10%高活性菌种，进行厌氧发酵，并螯合陈化，发酵容器压力维持在0~0.2Mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间1～36个月，得到青梅酵素原液。
10.如权利要求8或9所述的一种青梅酵素的制备方法，其特征在于所述的高活性菌种为鲁氏接合酵母CGMCC12131、双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、丙酸杆菌属、明串球菌属、酵母菌、片球菌属、醋酸菌、米曲霉、黑曲霉、红茶菌、冠突散囊菌、纳豆菌或红曲菌中的一种或多种。
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