CN111345418A - 一种药食同源酵素饮料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种药食同源酵素饮料及其制备方法，属于酵素制备技术领域，其制备方法具有以下工序：将药食同源原料按中医原理组方，熬煮，获得药食同源提取液；将果蔬榨汁得到果蔬汁；将药食同源提取液、果蔬汁分别利用天然发酵催化剂和益生菌至少发酵12个月，分别得到药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物；将药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物混合后再利用益生菌进行发酵，得到二次发酵物，固液分离，即得酵素饮料。本发明能够将发酵过程中产生的醋酸、甲醇等充分代谢，组方的有效成分充分提取，益生菌经发酵产生丰富的、益于人体的代谢物，获得高品质天然酵素饮料，通过长期饮用该酵素饮料有助于人体肠道环境、睡眠、代谢、免疫力等。
Description
技术领域
本发明属于酵素制备技术领域，具体涉及一种药食同源酵素饮料及其制备方法。
背景技术
酵素是近年在欧美日韩等经济体中新兴的一种产品形式，在我国也极具市场潜力。酵素是以动物、植物、菌类等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性的产品，含有丰富的糖类、有机酸、矿物质、维生素、酚类、萜类等营养成分以及一些重要的酶类等生物活性物质。通过影响体内的活性酶达到调节细胞层面机体的生命活动，将多糖催化分解为葡萄糖、蛋白质催化分解成氨基酸、脂肪催化分解成脂肪酸被细胞吸收利用，从而维持机体功能、组织修复、食物消化等生命活动。酵素按用途可分为食用酵素、环保酵素、日化酵素、农用酵素及饲用酵素。其中，食用酵素是指以一种或多种新鲜蔬菜、水果、菌菇、药食同源中草药等为原料，经多种有益菌发酵而成的功能性产品，含有丰富的酶、维生素、矿物质、多糖类、寡糖类、蛋白质及多肽类、氨基酸类、维生素类及醇、酯、酸、酚类等营养成分，具有改善肠胃功能、增强机体免疫力、美白抗衰等功能。酵素食品的原料丰富，产品种类多样，如酵素原液、酵素粉、酵素片、酵素饮料等。近年来，学者对酵素的发酵工艺和酵素食品的抗氧化性进行了较多研究。酵素食品发酵工艺有自然发酵和人工接种发酵两种，人工接种发酵根据发酵剂的不同可以分为单一菌种发酵和多菌混合发酵。酵素食品普遍具有较好的抗氧化性，发酵过程中抗氧化性能总体呈现上升趋势。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种能够将发酵过程中产生的醋酸、甲醇等充分代谢，获得高品质天然酵素饮料的药食同源酵素饮料的制备方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种药食同源酵素饮料的制备方法，酵素饮料用原料包括：酵素饮料用原料包括：药食同源原料、果蔬、天然发酵催化剂和益生菌，制备方法具有以下工序：
提取工序，将药食同源原料按中医原理组方，熬煮，获得药食同源提取液；
榨汁工序，将果蔬榨汁得到果蔬汁；
一次发酵工序，将药食同源提取液、果蔬汁分别利用天然发酵催化剂和益生菌至少发酵12个月，分别得到药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物；以及
二次发酵工序，将药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物混合后再利用益生菌进行发酵，得到二次发酵物，固液分离，即得酵素饮料。
本发明制备方法融入了传统中医理论，将古法发酵和现代生物菌定向发酵技术相结合，独创九法融合工艺，甄选、配伍、清洗、破碎、灭菌、陶缸地窖发酵、定向发酵、螯合发酵、无菌灌装九大核心工艺相辅相成，能够将发酵过程中产生的醋酸、甲醇等充分代谢，组方的有效成分充分提取，益生菌经发酵产生丰富的、益于人体的多酶、多肽和大量的提取物，获得高品质天然酵素饮料，有益于肠道的吸收和机体的利用，具有通便、促进消化、调节肠道菌群等功效，通过长期饮用该酵素饮料，可以改善人体消化不良、便秘，达到调理肠道的目的，且效果优于现有技术，尤其有助于肠道健康、代谢、免疫力等。
优选地，药食同源原料包括选自：火麻仁、郁李仁、桃仁、肉豆蔻、香薷、山楂、陈皮、白茅根、燕麦等中的一种或几种。
优选地，果蔬选自：大豆、南瓜、冬瓜、香蕉、刺梨、杨桃、火龙果、柚子、冬枣、苹果、雪花梨、猕猴桃等中的一种或几种。
优选地，天然发酵催化剂选自蜂蜜。
优选地，益生菌包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌等。
进一步地，酵素饮料用原料包括如下重量百分比的成分：药食同源原料50-80％、果蔬20-30％、天然发酵催化剂5-12％和1×106-1×109CFU/mL的益生菌0.1-2％。
优选地，一次发酵工序具体为：将药食同源提取液、果蔬汁分别加入天然发酵催化剂和益生菌，置入陶缸中，然后至少发酵12个月。
优选地，一次发酵环境为置于地下窖式车间，每日环境灭菌，据发酵过程控制有氧发酵或无氧发酵。地下窖式车间可使缸体形成冬暖夏凉、内外温差的环境，可自然恒温在25-30℃左右，能最大限度地保留药食同源原料和果蔬的有效成分以及维C、维E等还原性成分，同时充分的发酵时间能将发酵过程中产生的醋酸、甲醇等充分代谢，并产生人体必需的多糖、多酶、多肽、氨基酸、有机酸等，使产品活性最好，从而使产品中各成分的作用发挥到极致。优选的，一次发酵系的pH值在3.2-4.5的范围内时，即可以确定为发酵完成。
优选地，二次发酵工序中，加入益生菌，进行72-120h快速发酵。
本发明的又一目的，在于提供一种药食同源酵素饮料，通过上述制备方法获得。本发明酵素饮料具有通便、促进消化、调节肠道菌群等功效，可以改善人体消化不良、便秘，达到调理肠道的目的，且效果优于现有技术，通过长期饮用该酵素饮料有助于人体肠道环境、睡眠、代谢、免疫力等。
优选地，酵素饮料中总酶酶活≥1300.00U/mL。更优选地，蛋白酶酶活≥800.00U/mL。
本发明的又一目的，在于提供酵素饮料在制备调理肠道功能的食品或保健品中的用途。
优选地，酵素饮料在制备调理抗生素引起的肠道功能破坏的食品或保健品中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明制备方法能够将发酵过程中产生的醋酸、甲醇等充分代谢，组方的有效成分充分提取，益生菌经发酵产生丰富的、益于人体的多酶、多肽和大量的提取物，获得高品质天然酵素饮料，有益于肠道的吸收和机体的利用，具有通便、促进消化、调节肠道菌群等功效，通过长期饮用该酵素饮料，可以改善人体消化不良、便秘，达到调理肠道的目的，通过长期饮用该酵素饮料还有助于人体肠道环境、睡眠、代谢、免疫力等，且效果优于现有技术。
本发明采用了上述技术方案提供一种药食同源酵素饮料及其制备方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1是本发明实施例3酵素饮料的初步纯化多糖经阴离子交换柱层析分离的洗脱曲线；
图2是本发明实施例2酵素饮料的初步纯化多糖经阴离子交换柱层析分离的洗脱曲线；
图3是本发明试验例1中酵素饮料中脂肪酶、蛋白酶、SOD酶和总酶酶活；
图4是本发明试验例2中酵素饮料对小鼠肠胃消化功能的影响；
图5是本发明试验例2中酵素饮料对调节小鼠肠道菌群的影响；
图6是本发明试验例3中小鼠血清中IgG、LPS的含量；
图7是本发明试验例3中小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-22和IFN-γ的mRNA相对表达量。
具体实施方式
本发明允许各种修改及变形，其特定实施例进行了举例，下面进行详细说明。但并非要把本发明限定于公开的特别形态之意，相反，本发明包括与由权利要求项所定义的本发明思想一致的所有修改、均等及替代。
这些实施例只用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并非限定于这些实施例，这是所属技术领域的技术人员不言而喻的。
本发明一实施方式提供了一种药食同源酵素饮料的制备方法，酵素饮料用原料包括：药食同源原料、果蔬、天然发酵催化剂和益生菌，制备方法具有以下工序：
提取工序，将药食同源原料按中医原理组方，熬煮，获得药食同源提取液；
榨汁工序，将果蔬榨汁得到果蔬汁；
一次发酵工序，将药食同源提取液、果蔬汁分别利用益生菌至少发酵12个月，分别得到药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物；以及，
二次发酵工序，将药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物混合后再利用益生菌进行发酵，得到二次发酵物，固液分离，即得酵素饮料。
本实施方式制备方法融入了传统中医理论，将古法发酵和生物菌定向发酵技术相结合，独创九法融合工艺，甄选、配伍、清洗、破碎、灭菌、陶缸地窖发酵、定向发酵、螯合发酵、无菌灌装九大核心工艺相辅相成，能够将发酵过程中产生的醋酸、甲醇等充分代谢，组方的有效成分充分提取，益生菌经发酵产生丰富的、益于人体的多酶、多肽和大量的提取物，获得高品质天然酵素饮料，有益于肠道的吸收和机体的利用，具有通便、促进消化、调节肠道菌群等功效，通过长期饮用该酵素饮料，可以改善人体消化不良、便秘，达到调理肠道的目的，且效果优于现有技术，尤其有助于肠道健康、代谢、免疫力等。本实施方式酵素饮料还会改善抗生素引起的炎症、毒性及结肠炎症等不良反应，促进肠道健康，具体地，本实施方式酵素饮料能够在一定程度上降低免疫球蛋白G(IgG)和脂多糖(LPS)的含量、炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-22和IFN-γ)的表达量，从而有效抑制细胞炎症反应，从而减轻抗生素引起的结肠炎症，减轻甚至消除抗生素对机体的炎症和毒性，改善肠道健康。
于本发明一实施例中，药食同源原料包括选自：火麻仁、郁李仁、桃仁、肉豆蔻、香薷、山楂、陈皮、白茅根、燕麦等中的一种或几种。更优选的，药食同源原料包括火麻仁、桃仁、蜂蜜、陈皮、燕麦。
于本发明一实施例中，果蔬选自：大豆、南瓜、冬瓜、香蕉、刺梨、杨桃、火龙果、柚子、冬枣、苹果、雪花梨、猕猴桃等中的一种或几种。更优选的，果蔬包括南瓜、刺梨、火龙果、柚子、苹果、雪花梨、猕猴桃。
于本发明一实施例中，天然发酵催化剂选自蜂蜜。
于本发明一实施例中，乳酸菌包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌等。
进一步地，酵素饮料用原料包括如下重量百分比的成分：药食同源原料50-80％、果蔬20-30％、天然发酵催化剂5-12％和1×106-1×109CFU/mL的益生菌0.1-2％。更进一步地，药食同源原料包括如下成分及其重量份：火麻仁3-7份、桃仁1-5份、陈皮0.5-5份、燕麦2-7份；果蔬包括如下成分及其重量份：南瓜6-12份、刺梨3-8份、火龙果1-4份、柚子5-10份、苹果4-10份、雪花梨5-15份、猕猴桃4-8份；益生菌包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌，其重量比为0.02-2.2:0.03-1.2:0.05-1.8。按照酵素饮料用原料最显著的自然功效进行科学搭配，在酵素改善人体肠道功能的基础上，增加了原材料的天然功效。
于本发明一实施例中，榨汁工序中加入水，果蔬和水的重量比为1:3-8。
于本发明一实施例中，一次发酵工序具体为：将药食同源提取液、果蔬汁分别加入天然发酵催化剂和益生菌，置入陶缸中，置于地下窖式车间，每日环境灭菌，据发酵过程控制有氧发酵或无氧发酵。地下窖式车间可使缸体形成冬暖夏凉、内外温差的环境，可自然恒温在25-30℃左右，能最大限度地保留药食同源原料和果蔬的有效成分以及维C、维E等还原性成分，同时充分的发酵时间能将发酵过程中产生的醋酸、甲醇等充分代谢，并产生人体必需的多糖、多酶、多肽、氨基酸、有机酸等，使产品活性最好，从而使产品中各成分的作用发挥到极致。优选的，一次发酵系的pH值在3.2-4.5的范围内时，即可以确定为发酵完成。
于本发明一实施例中，二次发酵工序中，加入益生菌，进行72-120h快速发酵。
于本发明一实施例中，一种药食同源酵素饮料的制备方法，酵素饮料用原料包括如下重量百分比的成分：药食同源原料50-80％、果蔬20-30％、天然发酵催化剂5-12％和1×106-1×109CFU/mL的益生菌0.1-2％，该制备方法具有以下工序：
提取工序，按如下重量份取各药食同源原料：火麻仁3-7份、桃仁1-5份、陈皮0.5-5份、燕麦2-7份，将药食同源原料火麻仁、桃仁、蜂蜜、陈皮、燕麦粉碎至50-300目，按固液比为1:4-10(g/mL)加入水，于80-100℃下熬煮30-60min，过滤，获得药食同源提取液；
榨汁工序，按如下重量份取各果蔬：南瓜6-12份、刺梨3-8份、火龙果1-4份、柚子5-10份、苹果4-10份、雪花梨5-15份、猕猴桃4-8份，将南瓜、刺梨、火龙果、柚子、苹果、雪花梨、猕猴桃中加入水，果蔬和水的重量比为1:3-8，榨汁得到果蔬汁；
一次发酵工序，将药食同源提取液、果蔬汁分别加入天然发酵催化剂和益生菌，置入陶缸中，置于地下窖式车间，每日环境灭菌，据发酵过程控制有氧发酵或无氧发酵，然后至少发酵12个月，分别得到药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物；
二次发酵工序，将药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物混合后再利用益生菌进行发酵，得到二次发酵物，在2000-5000rpm下离心20-30min，去除沉淀，0.22μm滤膜过滤两次，即得酵素饮料。为了进一步提高口感，该酵素饮料中可以添加食品添加剂，添加剂为木糖醇、葡萄糖、阿拉伯糖、酸度调节剂、抗结剂、消泡剂、抗氧化剂、漂白剂、膨松剂、胶基糖果中基础剂物质、着色剂、护色剂、乳化剂、酶制剂、增味剂、被膜剂、水分保持剂、营养强化剂、防腐剂、稳定剂和凝固剂、甜味剂、增稠剂、食品用香料、食品工业用加工助剂中的一种或几种；更优选的，添加剂为防腐剂、甜味剂、酸味剂、食品用香料、抗氧化剂、增稠剂中的一种或几种；特别的，添加剂为苯甲酸钠、山梨酸钾、二氧化硫、乳酸、糖精钠、甜蜜素、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、维生素C中的一种或几种。
我们知道，抗生素的使用严重威胁着肠道微生物的稳态平衡，长期滥用抗生素会使肠道微生物在数量和组成上发生变化，出现肠道菌失调现象，最终影响肠道健康，且抗生素对肠道的影响是长期而且深远的。所以，为了进一步使得到的酵素饮料能够改善抗生素引起的炎症、毒性及结肠炎症等不良反应，本实施方式在二次发酵工序中，在加入益生菌的同时加入N-乙酰神经氨酸和葡萄糖，N-乙酰神经氨酸和葡萄糖的共同存在，能够使乳酸产生一种新的胞外多糖，该胞外多糖是由多糖和蛋白组成的蛋白多糖，酵素饮料中该胞外多糖的产生不仅能够进一步调节肠道内菌群，而且能够进一步降低IgG和LPS的含量、炎症细胞因子的表达量。优选的，N-乙酰神经氨酸和葡萄糖的重量比为1:23-37。进一步地，该胞外多糖的分子质量为26302Da；由摩尔比为6.3:2.1:3.2:1的甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和氨基半乳糖组成。此外，葡萄糖可为酵素发酵过程持续不断地提供碳源，使发酵完全充分，提高酵素饮料的质量，同时还能提高酵素饮料的口感。
本发明一实施方式还提供了一种药食同源酵素饮料，通过上述制备方法获得。本发明酵素饮料具有通便、促进消化、调节肠道菌群等功效，可以改善人体消化不良、便秘，达到调理肠道的目的，且效果优于现有技术，尤其会改善抗生素引起的炎症、毒性及结肠炎症等不良反应，促进肠道健康。
于本发明一实施例中，酵素饮料中总酶酶活≥1300.00U/mL。优选地，蛋白酶酶活≥800.00U/mL。酵素饮料中主要的功效酶包括脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶，较高的总酶酶活能够进一步促进酵素饮料的肠胃消化能力。
于本发明一实施例中，酵素饮料中含有具有如下特征的胞外多糖：胞外多糖的分子质量为26302Da；胞外多糖由摩尔比为6.3:2.1:3.2:1的甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和氨基半乳糖组成。
本发明一实施方式还提供了上述酵素饮料在制备调理肠道功能的食品或保健品中的用途。优选的，酵素饮料在制备调理抗生素引起的肠道功能破坏的食品或保健品中的用途。
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
实施例1：
一种药食同源酵素饮料的制备方法，酵素饮料用原料包括如下重量百分比的成分：药食同源原料63％、果蔬25％、蜂蜜12％和1×106CFU/mL的益生菌2％，制备方法具有以下工序：
提取工序，按如下重量份取各各药食同源原料：火麻仁4份、桃仁2份、陈皮1份、燕麦7份，将药食同源原料火麻仁、桃仁、陈皮、燕麦粉碎至100目，按固液比为1:5(g/mL)加入水，于100℃下熬煮40min，过滤，获得药食同源提取液；
榨汁工序，按如下重量份取各果蔬：南瓜6份、刺梨8份、火龙果1份、柚子5份、苹果4份、雪花梨5份、猕猴桃4份，将南瓜、刺梨、火龙果、柚子、苹果、雪花梨、猕猴桃中加入水，果蔬和水的重量比为1:4，榨汁得到果蔬汁；
一次发酵工序，将药食同源提取液、果蔬汁分别加入蜂蜜和益生菌，置入陶缸中，置于地下窖式车间，每日环境灭菌，据发酵过程控制有氧发酵或无氧发酵，然后发酵12个月，分别得到药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物；其中，药食同源提取液中加入蜂蜜重量的65％，益生菌重量的35％；果蔬汁益生菌中加入蜂蜜重量的35％，益生菌重量的20％，益生菌中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌的重量比为0.1:1.2:1.8；
二次发酵工序，将药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物混合后加入剩余益生菌，进行72h快速发酵，得到二次发酵物，在5000rpm下离心22min，去除沉淀，0.22μm滤膜过滤两次，即得酵素饮料。
实施例2：
一种药食同源酵素饮料的制备方法，酵素饮料用原料包括如下重量百分比的成分：药食同源原料70％、果蔬22％、蜂蜜8％和1×106CFU/mL的益生菌1％，制备方法具有以下工序：
粉碎工序，按如下重量份取各各药食同源原料：火麻仁5份、桃仁3份、蜂蜜6份、陈皮2.5份、燕麦4份，将药食同源原料火麻仁、桃仁、蜂蜜、陈皮、燕麦粉碎至200目，按固液比为1:6(g/mL)加入水，于100℃下熬煮40min，过滤，获得药食同源提取液；
榨汁工序，按如下重量份取各果蔬：南瓜8份、刺梨5份、火龙果2份、柚子7份、苹果6份、雪花梨10份、猕猴桃5份，将南瓜、刺梨、火龙果、柚子、苹果、雪花梨、猕猴桃中加入水，果蔬和水的重量比为1:5，榨汁得到果蔬汁；
一次发酵工序，将药食同源提取液、果蔬汁分别加入蜂蜜和益生菌，置入陶缸中，置于地下窖式车间，每日环境灭菌，据发酵过程控制有氧发酵或无氧发酵，然后发酵12个月，分别得到药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物；其中，药食同源提取液中加入蜂蜜重量的72％，益生菌重量的43％；果蔬汁益生菌中加入蜂蜜重量的28％，益生菌重量的16％，益生菌中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌的重量比为1:0.8:1.3；
二次发酵工序，将药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物混合后加入剩余益生菌，进行96h快速发酵，得到二次发酵物，在5000rpm下离心25min，去除沉淀，0.22μm滤膜过滤两次，即得酵素饮料。
实施例3：
一种药食同源酵素饮料的制备方法，酵素饮料用原料包括如下重量百分比的成分：药食同源原料70％、果蔬22％、蜂蜜8％和1×106CFU/mL的益生菌1％，制备方法具有以下工序：
粉碎工序，按如下重量份取各各药食同源原料：火麻仁5份、桃仁3份、蜂蜜6份、陈皮2.5份、燕麦4份，将药食同源原料火麻仁、桃仁、蜂蜜、陈皮、燕麦粉碎至200目，按固液比为1:6(g/mL)加入水，于100℃下熬煮40min，过滤，获得药食同源提取液；
榨汁工序，按如下重量份取各果蔬：南瓜8份、刺梨5份、火龙果2份、柚子7份、苹果6份、雪花梨10份、猕猴桃5份，将南瓜、刺梨、火龙果、柚子、苹果、雪花梨、猕猴桃中加入水，果蔬和水的重量比为1:5，榨汁得到果蔬汁；
一次发酵工序，将药食同源提取液、果蔬汁分别加入蜂蜜和益生菌，置入陶缸中，置于地下窖式车间，每日环境灭菌，据发酵过程控制有氧发酵或无氧发酵，然后发酵12个月，分别得到药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物；其中，药食同源提取液中加入蜂蜜重量的72％，益生菌重量的43％；果蔬汁益生菌中加入蜂蜜重量的28％，益生菌重量的16％，益生菌中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌的重量比为1:0.8:1.3；
二次发酵工序，将药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物混合后加入剩余益生菌、葡萄糖和N-乙酰神经氨酸，N-乙酰神经氨酸和葡萄糖的重量比为1:30，进行96h快速发酵，得到二次发酵物，在5000rpm下离心25min，去除沉淀，0.22μm滤膜过滤两次，即得酵素饮料。
将酵素饮料中加入质量分数为78wt％的TCA水溶液至终浓度为5％，静置过夜后于4℃、5000rpm下离心15min，除去蛋白沉淀；上清液中加入97wt％乙醇至终浓度为80％，混匀，4℃静置过夜，于4℃、5000rpm下离心15min，收集沉淀；沉淀用去离子水复溶后转移至8000-14000Da透析袋中，透析72h，浓缩后冷冻干燥得到粗多糖；将粗多糖溶于蒸馏水，配制质量浓度为5g/L的粗多糖溶液，经0.45mm水系针头滤膜过滤后，上样于SephadexG75凝胶层析柱(16mm×100mm)，采用0.1mol/L的NaCl溶液进行洗脱，洗脱下来的多糖片段采用自动部分收集器连续收集40管(5mL/管)收集。利用苯酚硫酸法于490nm处跟踪检测洗脱情况，横坐标设定为收集管数，纵坐标设定为吸光度值，作出洗脱图，合并洗脱峰，经透析脱盐后，冷冻干燥，得到初步纯化多糖；将初步纯化多糖溶于蒸馏水，配制质量浓度为5g/L的粗多糖溶液，经0.45mm水系针头滤膜过滤后，上样至150mm×3mm阴离子交换柱，依次用0、0.1mol/LNaCl、0.25mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl线性梯度洗脱，洗脱速度为1mL/min，自动部分收集器收集流分，各管取样以苯酚硫酸法测定总糖含量，初步纯化多糖经阴离子交换柱层析分离的洗脱曲线如图1所示，并将流分按峰合并后经透析、浓缩、冷冻干燥后得到得到纯化的不同多糖组分。同样将实施例2得酵素饮料按照上述纯化方法，经阴离子交换柱层析分离的洗脱曲线如图2所示，并将流分按峰合并后经透析、浓缩、冷冻干燥后得到得到纯化的不同多糖组分。从图1和图2可以看出，用0mol/L NaCl溶液洗脱时，均未见有洗脱峰出现；用0.1mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl溶液洗脱时，均有洗脱峰出现；用0.25mol/L NaCl溶液洗脱时，本实施例4有洗脱峰出现，而实施例2未见有洗脱峰出现。这说明本实施例4制备方法产生新的胞外多糖，以0.25mol/L NaCl溶液洗脱得到的级分即为新的胞外多糖。
新的胞外多糖的分子质量采用高效液相法测定，先将不同分子量(5，12，25和50ku)的标准葡聚糖配制成5g/L的溶液，上样于葡聚糖凝胶SephadexG75(10mm×400mm)，用0.1mol/L的NaCl溶液(pH＝7.0)在室温下按照0.5mL/min等度洗脱，洗脱液采用苯酚硫酸法跟踪检测，记录保留时间(TR)，各标准品的TR为横坐标，其分子量(Mw)的对数为纵坐标绘制标准曲线，得出Mw与TR对应的标准曲线方程，y＝12.0263-0.39857x，R2＝0.99901，其中，y为分子量(Mw)的对数，x为TR。然后再将新的胞外多糖样品按上述步骤进样，TR为19.084，将对应TR代入标准曲线方程即得出相应的分子量，胞外多糖的分子质量为26302Da。
新的胞外多糖中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法，测得新的胞外多糖中蛋白含量为3.05％。
新的胞外多糖的单糖和糖醛酸组成分析采用高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测测定，称取5mg样品于具塞试管，在冰浴下条件下缓慢滴加12MH2SO40.5mL，搅拌至样品完全溶解。反应30min后将样品中H2SO4浓度稀释至2M，于100℃油浴中水解6h。待其冷却至室温，用超纯水稀释至一定浓度，过0.22μm水系滤膜后进样分析。色谱柱为150mm×3mm阴离子交换柱；流速为0.5mL/min；流动相(AH2O，B250mmol/LNaOH，C1mol/LNaOAc)三元梯度洗脱；工作电极Au，参比电极Ag/AgCl，进样体积为10μL；柱温为30℃。结果为：新的胞外多糖主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和氨基半乳糖组成，其摩尔比为6.3:2.1:3.2:1。
实施例4：
酵素饮料中总酶酶活的提高能够进一步提高酵素饮料在维持肠道内细菌群的平衡、促进消化吸收、清除肠道内垃圾等等方面的功效，为了实现上述目的，本实施例在，与实施例2的不同之处在于：在榨汁工序，加入的水中含有0.01-0.2wt‰的甘草酸铵，这可能是因为甘草酸铵一方面能够改善细胞膜的通透性，加速乳酸菌和酵母菌之间的物质之间的物质交换，促进乳酸菌的新陈代谢，从而提高酶产量；另一方面可能是因为甘草酸铵可作为乳酸菌发酵产酶的氮源，能够促进乳酸菌产酶；从而最终提高了酶的活性。
试验例1：
酵素饮料的酶活的测定
1.脂肪酶活力的测定
用0.025mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)配制浓度为2％的酵素饮料待测溶液，用酚酞作为指示剂，用标准氢氧化钠溶液来滴定脂肪酸，根据实验消耗的氢氧化钠的体积来计算脂肪酶的活力。规定：在pH为7.5，环境温度为40℃时，1mL的液体酵素溶液水解脂肪酶1min产生1μmol的脂肪酸，即为一个脂肪酶活力单位，以U/mL表示。然后根据如下公式计算脂肪酶活力：酶活力(U/mL)＝(B-A)×c/0.05×50×1/15×n＝200/3×(B-A)×C×n，式中：
B-氢氧化钠标准溶液的消耗体积，mL；
A-空白对照组氢氧化钠标准溶液的消耗体积，mL；
C-氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；
0.05-氢氧化钠标准溶液浓度的换算系数；
50-氢氧化钠溶液的脂肪酸含量；
15-反应时间，min；
n-稀释倍数。
2.蛋白酶活力的测定
取1mL质量浓度各不相同的酪氨酸标准溶液，其质量浓度分别为0、10、20、30、40、50mg/L，向其中添加5mL浓度为0.4mol/L的碳酸钠溶液以及1mL福林试剂溶液，在温度为40℃时，反应20min。反应完全后去除反应液，用分光光度计在波长为680nm时测定溶液的吸光度值。以酪氨酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出酪氨酸标准曲线标准曲线方程为y＝0.0110x-0.0063，R2＝0.9987，其中，y为吸光度，x为样品浓度；
取浓度为10g/L的酪素溶液1mL与待测样品液1mL混合均匀，于40℃环境温度下反应10rnin；静置后过滤得到滤液，取滤液1mL，碳酸钠溶液5mL、福林试剂1mL，混合均匀后，于40℃环境温度下反应20rnin；用分光光度计在波长为680nm时测定溶液的吸光度值。空白对照组：取待测样品液1mL，加入三氯乙酸，反应充分，使蛋白酶失去活性，其它操作方法同实验组。根据如下公式计算蛋白酶活力：蛋白酶活力(U/mL)＝A×K×4/10，式中：
A-实验组酵素饮料的吸光度；
K-吸光度等于1时酪氨酸的量；
4-反应溶液的总体积，mL；
10-反应时间，min。
3.超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定
在25℃水浴锅内，对焦性没食子酸溶液进行预热，然后按照表1添加适量溶液到试管内，然后将试管置于上述条件下，水浴锅中放置25min。摇匀后，在325nm处对吸光度进行测定，每半分钟测定1次为A0。加入0.5mL不同浓度样品，在减少0.5mL蒸馏水，再加入焦性没食子酸，同一条件下测得吸光值为ASOD。通过下式对抑制率和超氧化物歧化酶活力进行计算：抑制率(％)＝(△A0-△ASOD)/△A0×100；酶活力(U/mL)＝抑制率/50％×V1/V2×n，式中：
V1-溶液总体积，mL；
V2-酵素样品液的体积，mL；
△ASOD-样品吸光度值的变化速率；
△A0-邻苯三酚的自动氧化速率；
N-稀释倍数。
实施例1-4酵素饮料中脂肪酶、蛋白酶、SOD酶和总酶酶活如图3所示，可以看出，实施例1-4酵素饮料中总酶酶活均大于1300.00U/mL；实施例1-2酵素饮料中脂肪酶酶活为11.00-12.00U/mL，蛋白酶酶活为800.00-1000.00U/mL，SOD酶酶活为400.00-600.00U/mL；相较于实施例1-2，实施例3酵素饮料中脂肪酶、蛋白酶、SOD酶和总酶酶活得到一定的提升，但是提升不大，这说明葡萄糖和N-乙酰神经氨酸的加入对酵素饮料中脂肪酶、蛋白酶、SOD酶和总酶酶活无不良影响；相较于实施例1-3，实施例4酵素饮料中脂肪酶、蛋白酶、SOD酶和总酶酶活得到显著的提升，这说明甘草酸铵的加入能够显著提升酵素饮料中脂肪酶、蛋白酶、SOD酶和总酶酶活，这可能是因为甘草酸铵一方面能够改善细胞膜的通透性，加速乳酸菌和酵母菌之间的物质之间的物质交换，促进乳酸菌的新陈代谢，从而提高酶产量；另一方面可能是因为甘草酸铵可作为乳酸菌发酵产酶的氮源，能够促进乳酸菌产酶；从而最终提高了酶的活性。
试验例2：
1.酵素饮料对小鼠肠胃消化功能的影响
选取体重相近健康小鼠100只，分5组，分别为试验组1、2、3和对照组，每组20只。对照组用普通鼠饲料喂养，试验组1、2、3、4小鼠分别用1mL实施例1、实施例2、实施例3、实施例4酵素饮料灌胃，每天1次。饲养4周后，随机抽取每组小鼠各5只，灌营养性半固体糊，0.8g/只，30min后剖腹取出全部胃肠，自幽门括约肌取胃。测得胃全重、胃净重，按照如下公式计算出胃内残留率，胃内残留率＝[(胃全重-胃净重)/营养性半固体糊重]×100％，以检测其胃排空功能。结果如图4，可以看出，试验组1、2、3小鼠的胃内残留率明显低于对照组小鼠，这说明酵素饮料有促进肠胃消化的功能。同时小鼠的胃内残留率：试验组1＜试验组2＜试验组3＜试验组4，这可能是因为相较于实施例1-2，实施例3酵素饮料中脂肪酶、蛋白酶、SOD酶和总酶酶活得到一定的提升，但是提升不大，这说明葡萄糖和N-乙酰神经氨酸的加入对酵素饮料中脂肪酶、蛋白酶、SOD酶和总酶酶活无不良影响；相较于实施例1-2，实施例4酵素饮料中脂肪酶、蛋白酶、SOD酶和总酶酶活得到显著的提升。
2.酵素饮料对调节小鼠肠道菌群的影响
选取体重相近健康小鼠100只，分5组，分别为试验组1、2、3、4和对照组，每组20只。对照组用普通鼠饲料喂养，试验组1、2、3、4小鼠分别用1mL实施例1、实施例2、实施例3、实施例4酵素饮料灌胃，每天1次，饲养4周后，随机抽取每组小鼠各4只，引颈处死，无菌操作、收集盲肠于灭菌EP管，用于检测盲肠肠道中的乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的数量。精密称取0.1g盲肠内容物于灭菌EP管中，剪碎内容物与生理盐水混合均匀，加入1mL无菌生理盐水，涡旋混匀至少1min，作为原液。以无菌生理盐水做10倍梯度稀释，稀释至10-10。用MRS培养基筛选计数乳酸杆菌；以BP培养基筛选计数金黄色葡萄球菌；以麦康凯培养基筛选计数大肠杆菌；以SS培养基计数沙门氏菌。采用倾注法计数:吸取0.1mL稀释倍数为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的内容物混匀液，分别至无菌培养基平皿，乳酸细菌培养基、金黄色葡萄球菌的鉴别培养基、SS琼脂培养基、麦康凯培养基高压后晾温后倒入平皿，左右上下轻轻摇晃使培养基与菌液混匀。待平皿晾凉后倒置在37℃恒温箱培养48h，进行细菌计数。图5为盲肠肠道中的乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的数量，可以看出，试验组1、2、3、4小鼠盲肠肠道中乳酸杆菌的数量明显高于对照组小鼠，试验组1、2、3、4小鼠盲肠肠道中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的数量明显低于对照组小鼠，这说明实施例1-4明酵素饮料对小鼠体内的乳酸杆菌有明显的促生长作用，而对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌作用，即本发明发酵饮料具有调节肠道菌群的功效。且试验组3小鼠盲肠肠道中乳酸杆菌的数量明显高于试验组2，这是因为实施例3酵素饮料中新的胞外多糖的产生能够进一步调节肠道内菌群。同时实施例4中加入甘草酸铵得到的酵素饮料对肠道内菌群无不良影响。
试验例3：
酵素饮料对抗生素引起的小鼠结肠炎症的影响
1.选取体重相近健康小鼠120只，分5组，随机选取20只小鼠作为正常组，其余100只为模型组。诱导期间模型组小鼠每天灌胃服用300mg/kg头孢菌素诱导肠道菌失调模型，灌胃4周；正常组的小鼠也采用灌胃的方法服用同样量的超纯水。建模4周后，把100只模型组的小鼠随机分为5组(每组N＝20)：对照组和试验组1、2、3、4，其中，对照组在治疗期间每天给小鼠服用相同量的超纯水；试验组1、2、3、4小鼠分别用1mL实施例1、实施例2、实施例3、实施例4酵素饮料灌胃进行治疗，每天1次。正常组小鼠灌胃服用相同量的超纯水。给药饲养4周后，引颈处死，通过眼眶静脉取血收集血液样品以制备血清。收集器官，称重，储存在-80℃备用。
2.收集的小鼠血液室温自然沉降1h左右，在3000rpm/min条件下，离心15min，收集上层血清；根据厂家说明书指导，检测小鼠血清中IgG、LPS的含量。结果如图6，可以看出，建模后，模型组小鼠血清中IgG和LPS的含量明显高于正常组小鼠血清中；经过酵素饮料治疗后，与对照组相比，试验组1、2、3、4小鼠血清中IgG和LPS含量显著降低；与正常组相比，试验组1、2、3、4小鼠血清中IgG和LPS含量较低；这说明头孢菌素的使用会引起小鼠血清中IgG和LPS含量的上升，而酵素饮料的使用会降低小鼠血清中IgG和LPS的含量，且实施例3酵素饮料的效果优于实施例1-2，同时实施例4酵素饮料的效果和实施例3相当，这是因为实施例3酵素饮料中新的胞外多糖的产生能够进一步降低IgG和LPS的含量。同时实施例4中加入甘草酸铵得到的酵素饮料对降低IgG和LPS的含量无不良影响。
3.RT-qPCR
根据TRIzol试剂说明，称取50mg左右的结肠组织样品进行总RNA的提取，然后以提取的总RNA为模板，录反应得到cDNA；采用qRT-PCR法，以cDNA作为模板，β-actin作为内参，分析基因在结肠组织中的表达。20μL扩增反应体系如下：
混匀离心后置于荧光定量PCR仪上，反应程序如下：95℃预变性4min；然后在95℃10s，60℃20s，72℃10s条件下循环45次n。反应完成后将数据整理，按2-ΔΔCt的方法处理数据。小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-22和IFN-γ五种炎症细胞因子mRNA的含量如图7，可以看出，建模后，模型组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-22和IFN-γ的mRNA相对表达量明显高于正常组小鼠血清中；经过酵素饮料治疗后，与对照组相比，试验组1、2、3、4小鼠血清中小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-22和IFN-γ的mRNA相对表达量显著降低；与正常组相比，小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-22和IFN-γ的mRNA相对表达量较低；这说明头孢菌素的使用会引起小鼠小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-22和IFN-γ的mRNA相对表达量的上升，而酵素饮料的使用会降低小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-22和IFN-γ的mRNA相对表达量，且实施例3酵素饮料的效果优于实施例1-2，同时实施例4酵素饮料的效果和实施例3相当。以上结果表明，酵素饮料能够在一定程度上降低IgG和LPS的含量、炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-22和IFN-γ)的表达量，从而有效抑制细胞炎症反应，从而减轻抗生素引起的结肠炎症，减轻甚至消除抗生素对机体的炎症和毒性，改善肠道健康。且实施例3酵素饮料中新的胞外多糖的产生能够进一步降低炎症细胞因子的表达量。同时实施例4中加入甘草酸铵得到的酵素饮料对降低炎症细胞因子的表达量无不良影响。
表1RT-qPCR反应中使用的引物序列
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
Claims (10)
1.一种药食同源酵素饮料的制备方法，酵素饮料用原料包括：药食同源原料、果蔬、天然发酵催化剂和益生菌，所述制备方法具有以下工序：
提取工序，将所述药食同源原料按中医原理组方，熬煮，获得药食同源提取液；
榨汁工序，将所述果蔬榨汁得到果蔬汁；
一次发酵工序，将药食同源提取液、果蔬汁分别利用天然发酵催化剂和益生菌至少发酵12个月，分别得到药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物；以及，
二次发酵工序，将药食同源提取液发酵物和果蔬汁发酵物混合后再利用益生菌进行发酵，得到二次发酵物，固液分离，即得酵素饮料。
2.根据权利要求1所述的一种药食同源酵素饮料的制备方法，其特征在于：所述药食同源原料包括选自：火麻仁、郁李仁、桃仁、肉豆蔻、香薷、山楂、陈皮、白茅根、燕麦中的一种或几种；所述果蔬选自：大豆、南瓜、冬瓜、香蕉、刺梨、杨桃、火龙果、柚子、冬枣、苹果、雪花梨、猕猴桃中的一种或几种；所述益生菌包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌。
3.根据权利要求1所述的一种药食同源酵素饮料的制备方法，其特征在于：所述天然发酵催化剂为蜂蜜。
4.根据权利要求1所述的一种药食同源酵素饮料的制备方法，其特征在于：所述一次发酵工序具体为：将所述药食同源提取液、果蔬汁分别加入天然发酵催化剂和益生菌，置入陶缸中，然后至少发酵12个月。
5.根据权利要求1所述的一种药食同源酵素饮料的制备方法，其特征在于：所述一次发酵环境为地下窖式车间，每日环境灭菌，据发酵过程控制有氧发酵或无氧发酵。
6.根据权利要求1所述的一种药食同源酵素饮料的制备方法，其特征在于：所述二次发酵工序中，加入益生菌，进行72-120h快速发酵。
7.一种药食同源酵素饮料，通过权利要求1-5任一项所述的制备方法获得。
8.根据权利要求6所述的一种药食同源酵素饮料，其特征在于：所述酵素饮料中总酶酶活≥1300.00U/mL。优选地，蛋白酶酶活≥800.00U/mL。
9.权利要求7或8所述的酵素饮料在制备调理肠道功能的食品或保健品中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述酵素饮料在制备调理抗生素引起的肠道功能破坏的食品或保健品中的用途。
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|---|---|---|---|---|
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| CN106261373A (zh) * | 2016-08-12 | 2017-01-04 | 熊乾华 | 酵素饮料及其制备方法 |
| CN110250502A (zh) * | 2019-07-08 | 2019-09-20 | 朱万军 | 富含sod发酵酵素液及其制备方法 |
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