CN114478284A - 青梅酵素中γ-氨基丁烯酸的分离方法及应用 - Google Patents

青梅酵素中γ-氨基丁烯酸的分离方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了青梅酵素中γ‑氨基丁烯酸的分离方法及应用，属于化学医药技术领域。本发明采用植物乳杆菌作为发酵菌，在青梅汁中发酵获得青梅酵素，然后从青梅酵素中提取分离得到γ‑氨基丁烯酸目标物。本发明提取分离所得的γ‑氨基丁烯酸能改善睡眠质量，促进人体入睡的功效。

Description

青梅酵素中γ-氨基丁烯酸的分离方法及应用
技术领域
本发明涉及青梅酵素中γ-氨基丁烯酸的分离方法及应用，属于化学医药技术领域。
背景技术
青梅(Prunusmume Sieb.et Zucc.)是蔷薇科李属植物，主要分布于长江流域及华南、西南地区一带。青梅果实不仅营养丰富，还具有许多保健功能，青梅果汁经天然或人工发酵可以产生酵素，青梅酵素能提高免疫力人；改善睡眠质量；促进人体肠道运动，可改善便秘；改善牙龈炎，缓解牙龈肿痛；酒前服用可预防醉酒；有祛斑的功效色，使皮肤细腻，面色红润。
目前已知青梅酵素含有丰富的SOD(超氧化物歧化酶)，具有延缓人体衰老，消除局部炎症等方面，有关青梅酵素中的其他功效成分还不清楚。
发明内容
本发明首次从青梅酵素中提取分离到一种γ-氨基丁烯酸，并确定该化合物为青梅酵素中助眠作用的主要功效成分。
本发明采用植物乳杆菌作为发酵菌，在青梅汁中发酵获得青梅酵素，然后从青梅酵素中提取分离到一种γ-氨基丁烯酸，发现其能改善睡眠质量，促进人体入睡的功效。
本发明的第一个目的是提供一种分离提取制备γ-氨基丁烯酸的方法包括以下步骤：
(1)提取：将青梅酵素过滤，取清液，减压浓缩到20-25％体积即得青梅酵素浓缩物。
(2)分离：将步骤(1)所得青梅酵素浓缩物进行柱层析，用水和不同浓度乙醇溶液洗脱，得γ-氨基丁烯酸。
在本发明一种实施方式中，所述γ-氨基丁烯酸的结构式为：
Figure BDA0003501629590000011
在本发明一种实施方式中，青梅酵素通过如下方法制得：
(a)青梅清洗、压榨、过滤，获得青梅压榨汁；
(b)向所得青梅压榨汁加入蔗糖，溶解后得到青梅汁糖液；
(c)向所得青梅汁糖液中加入大豆蛋白粉、植物乳杆菌进行发酵，发酵结束后，即得青梅酵素。
在本发明一种实施方式中，蔗糖与青梅压榨汁的质量比为1：2。
在本发明一种实施方式中，大豆蛋白粉相对青梅汁糖液的质量分数为5％-8％；具体可选6.25％。
在本发明一种实施方式中，植物乳杆菌的酶活为100亿CFU/g。
在本发明一种实施方式中，植物乳杆菌相对青梅汁糖液的质量分数为2％-5％；具体可选2％。
在本发明一种实施方式中，发酵是指在30±2℃温度下发酵30，然后温度降至20±2℃继续发酵30日。
在本发明一种实施方式中，步骤(2)括如下过程：
将青梅酵素浓缩物上DEAE离子交换层析柱，依次用去离子水、0.05、0.1、0.15mol/L的NaCl水溶液进行梯度洗脱，收集0.05mol/L的NaCl水溶液洗脱部分；
减压浓缩后上样到SephadexLH-20层析柱，依次用去离子水、5％的乙醇水溶液洗脱，收集5％乙醇洗脱部分；
去溶剂后上样到ODS-AQ层析柱，用去离子水、体积分数为5％、10％、15％的乙醇进行梯度洗脱，收集10％的乙醇洗脱部分，浓缩、干燥，得到γ-氨基丁烯酸产物。
在本发明一种实施方式中，步骤(2)具体包括如下过程：
将青梅酵素浓缩物上DEAE离子交换层析柱，依次用去离子水、0.05、0.1、0.15mol/L的NaCl水溶液进行梯度洗脱每次洗脱2个柱体积，收集0.05mol/L的NaCl水溶液洗脱部分，减压浓缩后上样到SephadexLH-20层析柱，先用水洗脱1个柱体积，再用5％的乙醇水溶液洗脱2个柱体积，收集5％乙醇洗脱部分，去溶剂后上样到ODS-AQ层析柱，用去离子水、体积分数为5％、10％、15％的乙醇进行梯度洗脱，每梯度洗脱1个柱体积，收集10％的乙醇洗脱部分，浓缩、干燥，得到γ-氨基丁烯酸产物。
本发明的第二个目的是提供一种含有上述方法得到的γ-氨基丁烯酸在制备用于促进睡眠的药物中的应用，但不包括疾病的诊断和治疗方法。
附图说明
图1为γ-氨基丁烯酸的1H-NMR图；
图2为γ-氨基丁烯酸的13C-NMR图；
图3为二氨基柠檬酸的135DEPT-NMR图。
具体实施方式
实施例1：
青梅酵素的制备：
青梅清晰、压榨、过滤，获得青梅压榨汁；取8kg过滤好的青梅压榨汁加入4g蔗糖，充分溶解得到青梅汁糖液12g，加入大豆蛋白粉(购于武汉秉和食品配料有限公司生产)0.75kg，搅拌均匀后再加入活化的植物乳杆菌(酶活为100亿CFU/g，购于山东中科嘉亿生物工程公司，批号20210417)0.25kg，控制温度30±2℃，发酵30日；将发酵温度降至20±2℃，继续发酵30日结束，即得青梅酵素。
从青梅酵素中提取纯化γ-氨基丁烯酸方法，其步骤如下：
将青梅酵素过滤，取清液，减压浓缩到25％体积，即得青梅酵素浓缩物。
将青梅酵素浓缩物上DEAE离子交换层析柱，依次用去离子水、0.05、0.1、0.15mol/L的NaCl水溶液进行梯度洗脱每次洗脱2个柱体积，收集0.05mol/L的NaCl水溶液洗脱部分，减压浓缩后上样到SephadexLH-20层析柱，先用水洗脱1个柱体积，再用5％的乙醇水溶液洗脱2个柱体积，收集5％乙醇洗脱部分，去溶剂后上样到ODS-AQ层析柱，用去离子水、体积分数为5％、10％、15％的乙醇进行梯度洗脱，每梯度洗脱1个柱体积，收集10％的乙醇洗脱部分，减压浓缩后得一个单体化合物—γ-氨基丁烯酸，该化合物产物为无色无定形粉末，易溶水、可溶于含水甲醇、乙醇。
利用HPLC测定所得的γ-氨基丁烯酸的收率为86.92％，纯度为96.33％。
利用核磁共振对所获得的物质结构进行鉴定：
1H-NMR(500MHz，D2O)δ7.06(1H,d,J＝6.0),6.40(1H,d,J＝6.0),4.49(2H,d,J＝16.0).
13C-NMR(500MHz，D2O)δ160.5,121.9,113.0,58.6.
相应归属信息见表1。
Figure BDA0003501629590000031
表1产物γ-氨基丁烯酸的1H和13C核磁共振数据
Figure BDA0003501629590000032
化合物为无色无定形粉末，易溶于水，可溶于甲醇、乙醇。
1H-NMR中有δ7.06，6.40二个H信号，这二个H应为双健上的氢，δ4.49处的2个H应为-CH2上的氢。13C-NMR呈现4个碳信号，其中δ113.0，121.9为二个双键碳信号，δ160.5的碳应为羧基碳，从化学位移看只有与双键相连的羧基才是这个值，因此得出羧基与双键相连，135DEPT谱中δ58.6为-CH2-碳信号，从化学位移值可知他与-NH2相连。综上所述该化合物为γ-氨基丁烯酸，这是首次从青梅和青梅酵素中发现的化合物。
实施例2：活性用途
利用动物实验对γ-氨基丁烯酸助眠功效进行检测，购入四周龄SPF级雄性ICR小白鼠40只，体重16.0±2.0g，随机分组，每组10只，分为空白对照组(K)，阳性对照组(γ-氨基丁酸300mg/kg)，γ-氨基丁烯酸低剂量组(100mg/kg)、γ-氨基丁烯酸高剂量组(300mg/kg)。适应性喂养一周后，空白对照组灌胃1g/kg/d生理盐水，各实验组灌胃相应剂量的样品，连续7d，在第7d给药30min后，用监控摄像观察并记录：(1)灌胃给药30min后各组小鼠的睡眠率(各组内入睡小鼠数量与小鼠总数量的比值，连续观察并记录1周)；(2)灌胃给药结束后12h内各组小鼠的睡眠时间。
表2远志萃取物对小鼠睡眠情况的影响
Figure BDA0003501629590000041
注：与空白对照组比较，*p<0.05；**p<0.01。
可以得出γ-氨基丁烯酸低剂量能提高动物的睡眠率，延长睡眠时间，高剂量有极显著的提高，比同等剂量的γ-氨基丁酸效果更好。

Claims (10)

1.一种分离提取制备γ-氨基丁烯酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取：将青梅酵素过滤，取清液，减压浓缩到20-25％体积即得青梅酵素浓缩物。
(2)分离：将步骤(1)所得青梅酵素浓缩物进行柱层析，用水和不同浓度乙醇溶液洗脱，得γ-氨基丁烯酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述γ-氨基丁烯酸的结构式为：
Figure FDA0003501629580000011
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)括如下过程：
将青梅酵素浓缩物上DEAE离子交换层析柱，依次用去离子水、0.05、0.1、0.15mol/L的NaCl水溶液进行梯度洗脱，收集0.05mol/L的NaCl水溶液洗脱部分；
减压浓缩后上样到SephadexLH-20层析柱，依次用去离子水、5％的乙醇水溶液洗脱，收集5％乙醇洗脱部分；
去溶剂后上样到ODS-AQ层析柱，用去离子水、体积分数为5％、10％、15％的乙醇进行梯度洗脱，收集10％的乙醇洗脱部分，浓缩、干燥，得到γ-氨基丁烯酸产物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，青梅酵素通过如下方法制得：
(a)青梅清洗、压榨、过滤，获得青梅压榨汁；
(b)向所得青梅压榨汁加入蔗糖，溶解后得到青梅汁糖液；
(c)向所得青梅汁糖液中加入大豆蛋白粉、植物乳杆菌进行发酵，发酵结束后，即得青梅酵素。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，蔗糖与青梅压榨汁的质量比为1：2。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，大豆蛋白粉相对青梅汁糖液的质量分数为5％-8％。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，植物乳杆菌的酶活为100亿CFU/g。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，植物乳杆菌相对青梅汁糖液的质量分数为2％-5％。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵是指在30±2℃温度下发酵30，然后温度降至20±2℃继续发酵30日。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法在制备用于促进睡眠的药物中的应用。
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