CN114478284B - 青梅酵素中γ-氨基丁烯酸的分离方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了青梅酵素中γ‑氨基丁烯酸的分离方法及应用,属于化学医药技术领域。本发明采用植物乳杆菌作为发酵菌,在青梅汁中发酵获得青梅酵素,然后从青梅酵素中提取分离得到γ‑氨基丁烯酸目标物。本发明提取分离所得的γ‑氨基丁烯酸能改善睡眠质量,促进人体入睡的功效。
Description
技术领域
本发明涉及青梅酵素中γ-氨基丁烯酸的分离方法及应用,属于化学医药技术领域。
背景技术
青梅(Prunusmume Sieb.et Zucc.)是蔷薇科李属植物,主要分布于长江流域及华南、西南地区一带。青梅果实不仅营养丰富,还具有许多保健功能,青梅果汁经天然或人工发酵可以产生酵素,青梅酵素能提高免疫力人;改善睡眠质量;促进人体肠道运动,可改善便秘;改善牙龈炎,缓解牙龈肿痛;酒前服用可预防醉酒;有祛斑的功效色,使皮肤细腻,面色红润。
目前已知青梅酵素含有丰富的SOD(超氧化物歧化酶),具有延缓人体衰老,消除局部炎症等方面,有关青梅酵素中的其他功效成分还不清楚。
发明内容
本发明首次从青梅酵素中提取分离到一种γ-氨基丁烯酸,并确定该化合物为青梅酵素中助眠作用的主要功效成分。
本发明采用植物乳杆菌作为发酵菌,在青梅汁中发酵获得青梅酵素,然后从青梅酵素中提取分离到一种γ-氨基丁烯酸,发现其能改善睡眠质量,促进人体入睡的功效。
本发明的第一个目的是提供一种分离提取制备γ-氨基丁烯酸的方法包括以下步骤:
(1)提取:将青梅酵素过滤,取清液,减压浓缩到20-25%体积即得青梅酵素浓缩物。
(2)分离:将步骤(1)所得青梅酵素浓缩物进行柱层析,用水和不同浓度乙醇溶液洗脱,得γ-氨基丁烯酸。
在本发明一种实施方式中,所述γ-氨基丁烯酸的结构式为:
在本发明一种实施方式中,青梅酵素通过如下方法制得:
(a)青梅清洗、压榨、过滤,获得青梅压榨汁;
(b)向所得青梅压榨汁加入蔗糖,溶解后得到青梅汁糖液;
(c)向所得青梅汁糖液中加入大豆蛋白粉、植物乳杆菌进行发酵,发酵结束后,即得青梅酵素。
在本发明一种实施方式中,蔗糖与青梅压榨汁的质量比为1:2。
在本发明一种实施方式中,大豆蛋白粉相对青梅汁糖液的质量分数为5%-8%;具体可选6.25%。
在本发明一种实施方式中,植物乳杆菌的酶活为100亿CFU/g。
在本发明一种实施方式中,植物乳杆菌相对青梅汁糖液的质量分数为2%-5%;具体可选2%。
在本发明一种实施方式中,发酵是指在30±2℃温度下发酵30,然后温度降至20±2℃继续发酵30日。
在本发明一种实施方式中,步骤(2)括如下过程:
将青梅酵素浓缩物上DEAE离子交换层析柱,依次用去离子水、0.05、0.1、0.15mol/L的NaCl水溶液进行梯度洗脱,收集0.05mol/L的NaCl水溶液洗脱部分;
减压浓缩后上样到SephadexLH-20层析柱,依次用去离子水、5%的乙醇水溶液洗脱,收集5%乙醇洗脱部分;
去溶剂后上样到ODS-AQ层析柱,用去离子水、体积分数为5%、10%、15%的乙醇进行梯度洗脱,收集10%的乙醇洗脱部分,浓缩、干燥,得到γ-氨基丁烯酸产物。
在本发明一种实施方式中,步骤(2)具体包括如下过程:
将青梅酵素浓缩物上DEAE离子交换层析柱,依次用去离子水、0.05、0.1、0.15mol/L的NaCl水溶液进行梯度洗脱每次洗脱2个柱体积,收集0.05mol/L的NaCl水溶液洗脱部分,减压浓缩后上样到SephadexLH-20层析柱,先用水洗脱1个柱体积,再用5%的乙醇水溶液洗脱2个柱体积,收集5%乙醇洗脱部分,去溶剂后上样到ODS-AQ层析柱,用去离子水、体积分数为5%、10%、15%的乙醇进行梯度洗脱,每梯度洗脱1个柱体积,收集10%的乙醇洗脱部分,浓缩、干燥,得到γ-氨基丁烯酸产物。
本发明的第二个目的是提供一种含有上述方法得到的γ-氨基丁烯酸在制备用于促进睡眠的药物中的应用,但不包括疾病的诊断和治疗方法。
附图说明
图1为γ-氨基丁烯酸的1H-NMR图;
图2为γ-氨基丁烯酸的13C-NMR图;
图3为二氨基柠檬酸的135DEPT-NMR图。
具体实施方式
实施例1:
青梅酵素的制备:
青梅清晰、压榨、过滤,获得青梅压榨汁;取8kg过滤好的青梅压榨汁加入4g蔗糖,充分溶解得到青梅汁糖液12g,加入大豆蛋白粉(购于武汉秉和食品配料有限公司生产)0.75kg,搅拌均匀后再加入活化的植物乳杆菌(酶活为100亿CFU/g,购于山东中科嘉亿生物工程公司,批号20210417)0.25kg,控制温度30±2℃,发酵30日;将发酵温度降至20±2℃,继续发酵30日结束,即得青梅酵素。
从青梅酵素中提取纯化γ-氨基丁烯酸方法,其步骤如下:
将青梅酵素过滤,取清液,减压浓缩到25%体积,即得青梅酵素浓缩物。
将青梅酵素浓缩物上DEAE离子交换层析柱,依次用去离子水、0.05、0.1、0.15mol/L的NaCl水溶液进行梯度洗脱每次洗脱2个柱体积,收集0.05mol/L的NaCl水溶液洗脱部分,减压浓缩后上样到SephadexLH-20层析柱,先用水洗脱1个柱体积,再用5%的乙醇水溶液洗脱2个柱体积,收集5%乙醇洗脱部分,去溶剂后上样到ODS-AQ层析柱,用去离子水、体积分数为5%、10%、15%的乙醇进行梯度洗脱,每梯度洗脱1个柱体积,收集10%的乙醇洗脱部分,减压浓缩后得一个单体化合物—γ-氨基丁烯酸,该化合物产物为无色无定形粉末,易溶水、可溶于含水甲醇、乙醇。
利用HPLC测定所得的γ-氨基丁烯酸的收率为86.92%,纯度为96.33%。
利用核磁共振对所获得的物质结构进行鉴定:
1H-NMR(500MHz,D2O)δ7.06(1H,d,J=6.0),6.40(1H,d,J=6.0),4.49(2H,d,J=16.0).
13C-NMR(500MHz,D2O)δ160.5,121.9,113.0,58.6.
相应归属信息见表1。
表1产物γ-氨基丁烯酸的1H和13C核磁共振数据
化合物为无色无定形粉末,易溶于水,可溶于甲醇、乙醇。
1H-NMR中有δ7.06,6.40二个H信号,这二个H应为双健上的氢,δ4.49处的2个H应为-CH2上的氢。13C-NMR呈现4个碳信号,其中δ113.0,121.9为二个双键碳信号,δ160.5的碳应为羧基碳,从化学位移看只有与双键相连的羧基才是这个值,因此得出羧基与双键相连,135DEPT谱中δ58.6为-CH2-碳信号,从化学位移值可知他与-NH2相连。综上所述该化合物为γ-氨基丁烯酸,这是首次从青梅和青梅酵素中发现的化合物。
实施例2:活性用途
利用动物实验对γ-氨基丁烯酸助眠功效进行检测,购入四周龄SPF级雄性ICR小白鼠40只,体重16.0±2.0g,随机分组,每组10只,分为空白对照组(K),阳性对照组(γ-氨基丁酸300mg/kg),γ-氨基丁烯酸低剂量组(100mg/kg)、γ-氨基丁烯酸高剂量组(300mg/kg)。适应性喂养一周后,空白对照组灌胃1g/kg/d生理盐水,各实验组灌胃相应剂量的样品,连续7d,在第7d给药30min后,用监控摄像观察并记录:(1)灌胃给药30min后各组小鼠的睡眠率(各组内入睡小鼠数量与小鼠总数量的比值,连续观察并记录1周);(2)灌胃给药结束后12h内各组小鼠的睡眠时间。
表2远志萃取物对小鼠睡眠情况的影响
注:与空白对照组比较,*p<0.05;**p<0.01。
可以得出γ-氨基丁烯酸低剂量能提高动物的睡眠率,延长睡眠时间,高剂量有极显著的提高,比同等剂量的γ-氨基丁酸效果更好。
Claims (8)
1.一种分离提取制备γ-氨基丁烯酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取:将青梅酵素过滤,取清液,减压浓缩到20-25%体积即得青梅酵素浓缩物;
(2)分离:将青梅酵素浓缩物上DEAE离子交换层析柱,依次用去离子水、0.05、0.1、0.15mol/L的NaCl水溶液进行梯度洗脱,收集0.05mol/L的NaCl水溶液洗脱部分;
减压浓缩后上样到SephadexLH-20层析柱,依次用去离子水、5%的乙醇水溶液洗脱,收集5%乙醇洗脱部分;
去溶剂后上样到ODS-AQ层析柱,用去离子水、体积分数为5%、10%、15%的乙醇进行梯度洗脱,收集10%的乙醇洗脱部分,浓缩、干燥,得到γ-氨基丁烯酸产物;
青梅酵素通过如下方法制得:
(a)青梅清洗、压榨、过滤,获得青梅压榨汁;
(b)向所得青梅压榨汁加入蔗糖,溶解后得到青梅汁糖液;
(c)向所得青梅汁糖液中加入大豆蛋白粉、植物乳杆菌进行发酵,发酵结束后,即得青梅酵素。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,蔗糖与青梅压榨汁的质量比为1:2。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,大豆蛋白粉相对青梅汁糖液的质量分数为5%-8%。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,植物乳杆菌的酶活为100亿CFU/g。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,植物乳杆菌相对青梅汁糖液的质量分数为2%-5%。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,发酵是指在30±2℃温度下发酵30日,然后温度降至20±2℃继续发酵30日。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法在制备用于促进睡眠的药物中的应用。
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