CN116570640B - 葵花盘生物碱及衍生物在降尿酸溶解痛风石产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到葵花盘相关原料技术领域，具体为一种葵花盘生物碱及衍生物在降尿酸溶解痛风石产品中的应用。本发明通过将新鲜去籽的葵花盘进行粉碎后，用枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌分段对粉碎后的葵花盘进行发酵改性，得到高浓度的葵花盘生物碱，黄酮和小分子肽等衍生物，再进行造粒得到一种富含葵花盘生物碱及其衍生物的颗粒冲剂。可以用于降低尿酸，溶解痛风石，平衡体内酸碱平衡，抑制黄嘌呤氧化酶合成尿酸，促进体内尿酸排泄和肠道蠕动，修复受损肝肾细胞，消肿抗炎止痛，预防治疗高尿酸血症，缓解痛风炎症，降低血压，提高免疫力。
Description
技术领域
本发明涉及到葵花盘相关原料技术领域，主要涉及葵花盘生物碱及其衍生物的制备，特别涉及葵花盘生物碱及其衍生物在制备降低尿酸和溶解痛风石产品中的应用。
背景技术
向日葵，又名葵花(通称)，向日葵、月照葵(山西)，菊科，一年生草本，高3~4米，全株被刚毛:粗壮，直立，中心髓部极发达。叶互生，阔卵形:基部截形、阔楔形或心形，先端尖，边缘有锯齿，两面均被白色刺状毛。头状花序单生，圆盘状，直径可达25~30厘米;总苞片绿色。卵圆形或卵状披针形，先端尾状长尖，有长毛;舌状花黄色，管状花棕紫色。瘦果长卵形或椭圆形，灰棕色或黑色。花期6~7月，果期9月。向日葵药性平淡味淡甘，无毒，有驱气，平肝，清温热，散滞气，具益气补肾之花盘、根、茎、叶和子实均可入药，《中药大辞典》中记载:“向日葵子可以透脓血，治血痢，慢性骨髓炎:皮壳可治耳鸣;叶片中含有一种类似奎宁成分的抗疟药物，可降血压，解毒;花瓣可以祛风明目，治头晕、牙痛;根系有清热利湿、行气止痛的功效；花盘可清湿热，利小便、消炎症、降血压;茎秆髓部对治疗尿道结石有良好的疗效;茎秆中的汁液可治愈伤口。”以往向日葵的药用价值只体现在民间验方或传统中药领域，随着中药现代化的逐步发展，向日葵的药用价值开始逐步被人们所认识，有关于向日葵药用成分及其作用机制研究仍然屈指可数。目前，国内对向日葵属植物化学成分研究主要集中在向日葵种籽油、绿原酸、多糖等方面。国外对向日葵叶、花盘的化学成分研究较多。自二十世纪60年代起，德国、美国、日本、西班牙等国的许多学者对向日葵属植物的化学成分及种间亲缘关系为重点进行了系统研究。1990年以后，Macis等人对向日葵中的化感活性物质成分进行了详细的研究。迄今为止，研究人员已从向日葵属植物地上部分中分离出170多个化合物，化学成分类型较多。
发明内容
有鉴于此，本发明通过将新鲜去籽的葵花盘进行粉碎后，用枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌液体培养基对粉碎后的葵花盘进行分段发酵提取，得到高纯度的葵花盘生物碱，黄酮和小分子肽等衍生物，可以用于降低尿酸，溶解痛风石，平衡体内酸碱平衡，抑制黄嘌呤氧化酶合成尿酸，促进体内尿酸排泄和肠道蠕动，修复受损肝肾细胞，消肿抗炎止痛，预防治疗高尿酸血症，缓解痛风炎症，降低血压，提高免疫力；具体合成步骤如下：
S1、葵花盘的预处理：将新鲜采摘的成熟向日葵去籽,得到葵花盘，进行清洗后，使用破壁机进行粉碎，收集粉碎后的残渣和汁液，得到葵花盘粉碎物，混匀备用；
S2、枯草芽孢杆菌的活化：菌种：Bacillus subtilis(保藏编号CGMCC(B)63501),将Bacillus subtilis接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于烘箱中33-37℃进行培养，培养至形成微黄色菌落；
S3、植物乳杆菌的活化：菌种：Lactobacillus plantarum(保藏编号ATCC14917)，将Lactobacillus plantarum接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于烘箱中30-35℃进行培养，培养至形成黄色菌落；
S4、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的液体培养基的制备：将步骤S2中活化的枯草芽孢杆菌和步骤S3中活化的植物乳杆菌分别转接于500-1000ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的摇瓶中发酵6~10h即可得到接种量在1.5×108~3.5×109cfu•g-1的枯草芽孢杆菌以及植物乳杆菌发酵菌液；
S5、葵花盘的发酵：①先将S4制备得到的草芽孢杆菌发酵液接种到步骤S1中预处理得到的葵花盘粉碎物在30~37℃进行12~24小时有氧发酵，②然后加入植物乳杆菌发酵液在30~35℃进行12~24小时的无氧发酵；
S6、发酵产物的提取：取发酵液后加入3%H2O2溶液对枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进行灭活，加入CaCl2静置15-30min后离心取上清，加入50%-75%的乙醇，再次离心，收集上清液，进行抽滤，再通过冷凝回流装置进行30-60min回流提取，提取完后保持温度为55℃，调pH=9.0加入碱性蛋白酶进行搅拌水解，水解成后进行浓缩，即可得到高纯度的葵花盘生物碱，黄酮和小分子肽等衍生物；
S7、葵花盘提取物的造粒：在S6中制备得到的浓缩液中加入不同用量的颗粒剂辅料混合放入干锅中，不断揉搓至“手捏成团，压之即散”的状态，之后将得到的软材料压挤过筛网，将制得的颗粒放入60℃烘箱内干燥得到含有葵花盘生物碱及其衍生物的颗粒冲剂。
优选地：所述步骤S1所用的葵花盘为新鲜葵花盘。
优选地：所述S2与S3所用的固体培养基配制材料为牛肉膏：3.0g，蛋白胨：10.0g，NaCl：5.0g，琼脂：15-25g，水：1000ml，同时调节pH为7.4-7.6。
优选地：所述步骤S1所用液体培养基材料为若配置1000mL的液体培养基，则取牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g加蒸馏水配置，用5mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.2~7.4。
优选地：所述步骤S5中使用的葵花盘处理物与液体发酵液的的质量比为5：1。
优选地：所述步骤S6中加入CaCl2有助于去除果胶，加入量为每500ml加入1g。
优选地：所述步骤S6中提取液与浓缩液的体积比为5：1时停止浓缩。
优选地：步骤S7所述的颗粒剂辅料为可溶性淀粉和乳糖。
优选地：所述步骤S7所述的颗粒剂辅料为可溶性淀粉和乳糖在使用前要过50目的筛网。
本发明的有益效果在于：
1、本发明通过简单的发酵有效降低了生产成本。
2、本发明通过筛选发现，使用特定的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌巧妙进行分段液体发酵，先进行有氧发酵后，产生了大量的代谢物和次代谢物，再进行厌氧发酵进一步提取，可以协同有效提高了葵花盘肽及其衍生物的提取率，增加了有效生物活性产品，从而大大增强了效果。
3、本发明最终得到的产品为颗粒冲剂，方便患者的使用。
4、本发明造粒过程中尽可能少的使用辅料，减少对患者身体负担的增加。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1、对比例1,2和3总生物碱，总黄酮和小分子肽的提取率图。
图2为实施例2、对比例4和5总生物碱，总黄酮和小分子肽的提取率对比图。
图3为实施例3、对比例6和7总生物碱，总黄酮和小分子肽的提取率对比图。
图4为实施例4造粒结果图。
图5对比例8造粒结果图。
图6对比例9造粒结果图。
具体实施方式
为了使本发明专利所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明内容，并不用于限定本发明专利。
实施例1：S1、葵花盘的预处理：将新鲜采摘的成熟向日葵去籽,得到葵花盘，进行清洗后，使用破壁机进行粉碎，收集粉碎后的残渣和汁液，得到葵花盘粉碎物，混匀备用；
S2、枯草芽孢杆菌的活化：菌种：Bacillus subtilis(保藏编号CGMCC(B)63501),由北京三药科技有限公司提供，将Bacillus subtilis接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于烘箱中37℃进行培养，培养至形成微黄色菌落；
S3、植物乳杆菌的活化：菌种：Lactobacillus plantarum(保藏编号ATCC14917)，由上海沪峥生物科技有限公司提供，将Lactobacillus plantarum接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于烘箱中35℃进行培养，培养至形成黄色菌落；
S4、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的液体培养基的制备：将步骤S2中活化的枯草芽孢杆菌和步骤S3中活化的植物乳杆菌分别转接于500ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的摇瓶中发酵6h即可得到1.5×108cfu•g-1的枯草芽孢杆菌以及1.8×108cfu•g-1植物乳杆菌发酵菌液；
S5、葵花盘的发酵：①将步骤S1中预处理得到的葵花盘粉碎物，加入到枯草芽孢杆菌发酵液中在35℃进行12小时有氧发酵，②加入植物乳杆菌发酵液在35℃进行12小时的无氧发酵；
S6、发酵产物的提取：取发酵液后加入3%H2O2溶液对枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进行灭活，加入CaCl2静置15min后离心取上清，加入75%的乙醇，再次离心，收集上清液，进行抽滤，再通过冷凝回流装置进行30min回流提取，提取完后保持温度为55℃，调pH=9.0加入碱性蛋白酶进行搅拌水解，水解完成后进行浓缩，即可得到高纯度的葵花盘生物碱，黄酮和小分子肽等衍生物；
S7、葵花盘提取物的造粒：在S6中制备得到的浓缩液中加入不同用量的颗粒剂辅料混合放入干锅中，不断揉搓至“手捏成团，压之即散”的状态，之后将得到的软材料压挤过筛网，将制得的颗粒放入60℃烘箱内干燥得到含有葵花盘生物碱及其衍生物的颗粒冲剂。
对比例1：除步骤S4中的植物乳杆菌换成植物乳杆菌ACCC11095由上海沪峥生物科技有限公司提供，其余均与实施例1相同。
对比例2：除步骤S4中的植物乳杆菌换成植物乳杆菌ATCC8014由上海北诺生物科技有限公司提供，其余均与实施例1相同。
对比例3：不进行发酵，直接将S1处理得到的葵花盘进行回流酶解，其余均与实施例1相同。
取步骤S6得到的浓缩液进行成分检测，其中总黄酮检测方法参考(乔子安.葵花盘中黄酮成分鉴定及葵花盘颗粒剂的制备工艺研究[D].吉林:吉林大学,2021.)；总生物碱检测方法参考(刘小波,薛均来,赵海峰.洮南地区与其他地区葵花盘有效成分含量比较分析[J].家庭医药.就医选药,2017(07):124-125.)；小分子肽检测方法参考(郭宝生,杨翊研,胡峻涵,韩葳葳,李婉南.用响应面法优化酶水解法制备葵花盘小分子肽[J].吉林大学学报(理学版),2019,57(05):1275-1280.)。
通过对比图1中实施例1、对比例1-3的提取率，可以发现将植物乳杆菌(ATCC14917)替换成其他株的植物乳杆菌，会导致提取率的大幅下降，不进行发酵更会导致提取率显著下降。可能是由于植物乳杆菌(ATCC14917)具有特殊的生理活性，其他植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌并不能产生协同作用，甚至还会产生竞争，尤其换成植物乳杆菌(ACCC11095)时小分子肽的提取率下降程度更加显著，说明植物乳杆菌ACCC11095还会减少发酵提取的衍生物的多样性。
实施例2：S1、葵花盘的预处理：将新鲜采摘的成熟向日葵去籽,得到葵花盘，进行清洗后，使用破壁机进行粉碎，收集粉碎后的残渣和汁液，得到葵花盘粉碎物，混匀备用；
S2、枯草芽孢杆菌的活化：菌种：Bacillus subtilis(保藏编号CGMCC(B)63501),由北京三药科技有限公司提供，将Bacillus subtilis接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于烘箱中35℃进行培养，培养至形成微黄色菌落；
S3、植物乳杆菌的活化：菌种：Lactobacillus plantarum(保藏编号ATCC14917)，由上海沪峥生物科技有限公司提供，将Lactobacillus plantarum接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于烘箱中30℃进行培养，培养至形成黄色菌落；
S4、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的液体培养基的制备：将步骤S2中活化的枯草芽孢杆菌和步骤S3中活化的植物乳杆菌分别转接于1000ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的摇瓶中发酵10h即可得到接种量在3.5×109cfu•g-1的枯草芽孢杆菌以及2.8×109cfu•g-1植物乳杆菌发酵菌液；
S5、葵花盘的发酵：①将步骤S1中预处理得到的葵花盘粉碎物，加入到枯草芽孢杆菌发酵液中在35℃进行24小时有氧发酵，②加入植物乳杆菌发酵液在35℃进行24小时的无氧发酵；
S6、发酵产物的提取：取发酵液后加入3%H2O2溶液对枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进行灭活，加入CaCl2静置25min后离心取上清，加入75%的乙醇，再次离心，收集上清液，进行抽滤，再通过冷凝回流装置进行30min回流提取，提取完后保持温度为55℃，调pH=9.0加入碱性蛋白酶进行搅拌水解，水解完成后进行浓缩，即可得到高纯度的葵花盘生物碱，黄酮和小分子肽等衍生物；
S7、葵花盘提取物的造粒：在S6中制备得到的浓缩液中加入不同用量的颗粒剂辅料混合放入干锅中，不断揉搓至“手捏成团，压之即散”的状态，之后将得到的软材料压挤过筛网，将制得的颗粒放入60℃烘箱内干燥得到含有葵花盘生物碱及其衍生物的颗粒冲剂。
对比例4：除将步骤S4中只使用枯草芽孢杆菌的外，其余均与实施例2相同。
对比例5：除将步骤S4中只使用植物乳杆菌外，其余均与实施例2相同。
图2为实施例2，对比例3和对比例4对葵花盘中的活性物质提取率对比图，由结果可知，只使用枯草芽孢杆菌(CGMCC(B)63501)进行发酵，各种物质的提取率相对较小，因为枯草芽孢杆菌(CGMCC(B)63501)属于好氧菌对于发酵液中无氧处发酵的不彻底导致提取率下降，同理植物乳杆菌(ATCC14917)属于厌氧或兼氧菌，也会因为发酵不充分，导致提取率降低。说明枯草芽孢杆菌(CGMCC(B)63501)和植物乳杆菌(ATCC14917)的发酵具有协同作用，能显著提高提取率。
实施例3：S1、葵花盘的预处理：将新鲜采摘的成熟向日葵去籽,得到葵花盘，进行清洗后，使用破壁机进行粉碎，收集粉碎后的残渣和汁液，得到葵花盘粉碎物，混匀备用；
S2、枯草芽孢杆菌的活化：菌种：Bacillus subtilis(保藏编号CGMCC(B)63501),由北京三药科技有限公司提供，将Bacillus subtilis接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于烘箱中35℃进行培养，培养至形成微黄色菌落；
S3、植物乳杆菌的活化：菌种：Lactobacillus plantarum(保藏编号ATCC14917)，由上海沪峥生物科技有限公司提供，将Lactobacillus plantarum接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于烘箱中35℃进行培养，培养至形成黄色菌落；
S4、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的液体培养基的制备：将步骤S2中活化的枯草芽孢杆菌和步骤S3中活化的植物乳杆菌分别转接于800ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的摇瓶中发酵8h即可得到接种量大约在2.5×109cfu•g-1的枯草芽孢杆菌以及2.3×109cfu•g-1植物乳杆菌发酵菌液；
S5、葵花盘的发酵：①将步骤S1中预处理得到的葵花盘粉碎物，加入到枯草芽孢杆菌发酵液中在37℃进行24小时有氧发酵，②加入植物乳杆菌发酵液在35℃进行24小时的无氧发酵；
S6、发酵产物的提取：取发酵液后加入3%H2O2溶液对枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进行灭活，加入CaCl2静置30min后离心取上清，加入75%的乙醇，再次离心，收集上清液，进行抽滤，再通过冷凝回流装置进行30min回流提取，提取完后保持温度为55℃，调pH=9.0加入碱性蛋白酶进行搅拌水解，水解完成后进行浓缩，即可得到高纯度的葵花盘生物碱，黄酮和小分子肽等衍生物；
S7、葵花盘提取物的造粒：在S6中制备得到的浓缩液中加入不同用量的颗粒剂辅料混合放入干锅中，不断揉搓至“手捏成团，压之即散”的状态，之后将得到的软材料压挤过筛网，将制得的颗粒放入60℃烘箱内干燥得到含有葵花盘生物碱及其衍生物的颗粒冲剂。
对比例6：除步骤S4中的枯草芽孢杆菌替换为双歧杆菌ATCC55813由上海瑞生科技有限公司提供外，其余均与实施例3相同。
对比例7：除步骤S2中的枯草芽孢杆菌替换为干酪乳杆菌ATCC393由深圳子科生物科技有限公司提供外，其余均与实施例3相同。
图3为实施例3，对比例5和6的提取率对比图。由结果可知。将枯草芽孢杆菌(CGMCC(B)63501)替换为双歧杆菌(ATCC55813)或干酪乳杆菌(ATCC393)导致提取率降低的原因可能是因为这两种菌均为厌氧菌，并且全部为厌氧菌发酵会导致提取物中总黄酮的提取率显著下降，可能还会减少提取物中衍生物的多样性。
实施例4：S1、葵花盘的预处理：将新鲜采摘的成熟向日葵去籽,得到葵花盘，进行清洗后，使用破壁机进行粉碎，收集粉碎后的残渣和汁液，得到葵花盘粉碎物，混匀备用；
S2、枯草芽孢杆菌的活化：菌种：Bacillus subtilis(保藏编号CGMCC(B)63501),由北京三药科技有限公司提供，将Bacillus subtilis接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于烘箱中37℃进行培养，培养至形成微黄色菌落；
S3、植物乳杆菌的活化：菌种：Lactobacillus plantarum(保藏编号ATCC14917)，由上海沪峥生物科技有限公司提供，将Lactobacillus plantarum接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于烘箱中35℃进行培养，培养至形成黄色菌落；
S4、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的液体培养基的制备：将步骤S2中活化的枯草芽孢杆菌和步骤S3中活化的植物乳杆菌分别转接于600ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的摇瓶中发酵8h即可得到接种量在8.5×108cfu•g-1的枯草芽孢杆菌以及植物乳杆菌发酵菌液；
S5、葵花盘的发酵：首先将步骤S1中预处理得到的葵花盘粉碎物，加入到枯草芽孢杆菌发酵液中在35℃进行24小时有氧发酵，然后加入植物乳杆菌发酵液在35℃进行24小时的无氧发酵；
S6、发酵产物的提取：取发酵液后加入3%H2O2溶液对枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进行灭活，加入CaCl2静置20min后离心取上清，加入75%的乙醇，再次离心，收集上清液，进行抽滤，再通过冷凝回流装置进行30min回流提取，提取完后保持温度为55℃，调pH=9.0加入碱性蛋白酶进行搅拌水解，水解完成后进行浓缩，即可得到高纯度的葵花盘生物碱，黄酮和小分子肽等衍生物；
S7、葵花盘提取物的造粒：在S6中制备得到的浓缩液中加入不同用量的颗粒剂辅料混合放入干锅中，不断揉搓至“手捏成团，压之即散”的状态，之后将得到的软材料压挤过筛网，将制得的颗粒放入60℃烘箱内干燥得到含有葵花盘生物碱及其衍生物的颗粒冲剂。
对比例8：除步骤S7中的颗粒辅料中的可溶性淀粉换成糊精外，其余均与实施例4相同。
对比例9：除步骤S7中的颗粒辅料中的乳糖换成甘露醇外，其余均与实施例4相同。
图4-6为制粒产品结果图，通过对比可知，实施4颗粒大小均一，容易制粒，不粘连，而将可溶性淀粉换成糊精以后，颗粒质地较硬，颗粒大小相对不均匀，将可溶性淀粉换成甘露醇以后，颗粒质地较软，易粘连不易制粒。
动物实验：
本实施例所使用的小鼠为购自济南朋悦实验动物繁育有限公司的SPF级Balb/c雄性小鼠，生产许可证号为：SCXK(鲁)2019_0003。
动物实验：采用三周龄的雄性小鼠，体重15-22g，卫生级别为SPF级。将100只小鼠随机分笼，每笼5只实验正式开始前在25℃恒温供氧环境适应性饲养一周，随后逐一称重、标记并记录初始体重。待小鼠完全适应环境后将其随机分为正常组、模型组、别嘌呤醇组、实施例组(共4组)和对比例组(共3组)，每组10只。
空白对照组：0.9%生理盐水，灌胃；
模型组：氧嗪酸钾100mg/kg·d腹腔注射+次黄嘌呤500mg/kg·d灌胃；
别嘌呤醇组：别嘌呤醇7.6mg/kg·d灌胃+氧嗪酸钾100mg/kg·d腹腔注射+次黄嘌呤500mg/kg·d灌胃；
给药组分为实施例组(共4组)和对比例(共3组)。
实施例1组：实施例1制备的颗粒物10mg/kg·d灌胃+氧嗪酸钾100mg/kg·d腹腔注射+次黄嘌呤500mg/kg·d灌胃；
实施例2组：实施例2制备的颗粒物10mg/kg·d灌胃+氧嗪酸钾100mg/kg·d腹腔注射+次黄嘌呤00mg/kg·d灌胃；
实施例3组：实施例3制备的颗粒物10mg/kg·d灌胃+氧嗪酸钾100mg/kg·d腹腔注射+次黄嘌呤500mg/kg·d灌胃；
实施例4组：实施例4制备的颗粒物10mg/kg·d灌胃+氧嗪酸钾100mg/kg·d腹腔注射+次黄嘌呤500mg/kg·d灌胃；
对比例1组：对比例1制备的颗粒物10mg/kg·d灌胃+氧嗪酸钾100mg/kg·d腹腔注射+次黄嘌呤500mg/kg·d灌胃；
对比例3组：对比例3制备的颗粒物10mg/kg·d灌胃+氧嗪酸钾100mg/kg·d腹腔注射+次黄嘌呤500mg/kg·d灌胃；
对比例5组：对比例5制备的颗粒物10mg/kg·d灌胃+氧嗪酸钾100mg/kg·d腹腔注射+次黄嘌呤500mg/kg·d灌胃；
实验持续进行15天后对小鼠进行肾脏剥离。
小鼠样本收集：第16天，眼球取血后，颈椎脱臼处死小鼠，解剖内脏，称取肝肾脾重量，收集样品并记录备用。将收集的血液置于EP管中，静止30min，以3500rpm/min转速，4℃离心10min，取上清淡黄色澄清液即血清，-20℃冻存，供小鼠血液生化指标检测使用。
眼球取血后，颈椎脱臼处死小鼠，解剖内脏，于冰浴上将肝脏迅速取出，以生理盐水冲洗，滤纸吸水，称取肝肾脾重量，收集样品并记录备用，冻于-20℃。
实验数据处理：实验数据以均数±标准差()表示，组间比较，统计方法采用单因素方差分析(OnewayANOVA)；组间比较，统计方法采用t检验。*P<0.05认为有显著性差异，**P<0.01认为有极显著性差异，结果用SPSS17.0统计软件分析。
结果讨论：
将各组对小鼠高尿酸血症模型的尿酸、尿素氮、肌酐以及黄嘌呤氧化酶活性水平的影响结果列入表1中。由表1可知，与空白对照组相比，模型组的小鼠血清中尿酸水平显著增加，模型组的小鼠血清中黄嘌呤氧化酶活性显著增加，模型组的小鼠肝脏中黄嘌呤氧化酶活性显著增加，模型组的小鼠血清中肌酐水平并未显著增加，模型组的小鼠血清中尿素氮并未显著增加。这表明，通过上述造模方法，小鼠高尿酸血症模型建立成功，并且对小鼠的肾脏损伤较小。
由表1可知，与空白对照组相比，别嘌呤醇对照组的小鼠血清中尿酸水平显著降低，别嘌呤醇对照组的小鼠血清中黄嘌呤氧化酶活性并未显著增加，别嘌呤对照组的小鼠肝脏中黄嘌呤氧化酶活性显著增加，别嘌呤对照组的小鼠血清中尿素氮显著增加，别嘌呤醇对照组的小鼠血清中肌酐水平显著增加。这表明，别嘌呤醇对照组的给药产品，虽然能够降低小鼠血清中尿酸水平，但是对于小鼠的肾脏产生了损伤。
由表1可知，与空白对照组相比，实施例1组、实施例2组、实施例3组和实施例4组对应的小鼠血清中尿酸水平均显著降低，而对比例1组、对比例5组和对比例3组对应的小鼠血清中尿酸水平则显著升高。这表明本发明实施例提供的发酵产物具有显著降低小鼠血清中尿酸水平的作用。与模型组相比，实施例1组、实施例2组、实施例3组和实施例4组对应的小鼠血清中XO活性均显著降低至于空白对照组相当的水平，表明二者能够恢复或者抑制小鼠血清中XO活性，避免对于小鼠的损伤，通过对小鼠肝脏中XO活性的检测表明处相同的趋势，这表明本发明实施例1和实施例2制备的发酵产物不仅能够降低小鼠血清中尿酸水平，还能避免对小鼠肝脏产生损伤。同样地，对小鼠血清中BUN和CR含量的检测发现，实施例1组和实施例2组表现出相同的趋势。
表1，n=5
| 组别 | UA(μmol/L) | XO(U/L血清) | XO(U/g肝脏) | BUN(mmol/L) | CR(μmol/L) |
| 空白对照组 | 110.32±12.17* | 37.34±3.47* | 45.12±2.37* | 9.29±0.42* | 46.35±1.74* |
| 模型组 | 291.71±24.85** | 50.87±1.02** | 84.56±2.19* | 11.23±0.72** | 50.35±1.41* |
| 别嘌呤醇对照组 | 52.64±2.91** | 58.44±0.82* | 52.12±1.92* | 36.98±4.38* | 70.12±2.04* |
| 实施例1组 | 47.22±1.59* | 39.97±0.43** | 53.62±1.52** | 10.16±1.07* | 50.02±1.72* |
| 实施例2组 | 48.26±2.23** | 40.61±0.21** | 52.29±2.06* | 10.55±0.85* | 49.96±1.65* |
| 实施例3组 | 46.45±8.14** | 40.43±0.15** | 52.63±1.61** | 10.71±0.75* | 50.13±1.79** |
| 实施例4组 | 48.75±6.93** | 40.78±0.63** | 52.34±1.96* | 10.62±0.51* | 50.26±1.61** |
| 对比例1组 | 203.34±52.61* | 49.17±3.44* | 83.76±1.62** | 19.93±2.71** | 65.89±6.19* |
| 对比例3组 | 239.16±61.79** | 51.82±2.51* | 82.81±1.97* | 20.53±2.35** | 66.15±2.03* |
| 对比例5组 | 211.07±80.23* | 51.96±1.94* | 85.14±2.01** | 19.96±2.28** | 68.02±2.51* |
葵花盘提取物中含有大量总黄酮，总生物碱和小分子肽。其中小分子肽可以载着生物碱和黄铜快速进入血液。血液中游离状态的生物碱可以抑制嘌呤合成，降低血液中尿酸；黄酮具有减轻肾脏压力，稳定肾小管的作用；葵花碱小分子肽还可以抗肾间质细胞，调控肾运转尿酸蛋白；两者均具有保护肾脏，加速尿酸排泄的作用。游离尿酸反复排除体外，血尿酸浓度降低，尿酸水平低于300μmol/L时可以促使溶解、剥离沉积在人体关节、组织上的尿酸盐结晶体，使尿酸盐结晶体变小，可以渐渐溶解尿酸盐结晶体大量堆积形成的痛风石，直至消失。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种葵花盘生物碱及其衍生物的制备方法，其特征在于：使用枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌分段对葵花盘进行发酵改性，具体制备方法如下：
S1、葵花盘的预处理：将新鲜采摘的成熟向日葵去籽,得到葵花盘，进行清洗后，使用破壁机进行粉碎，收集粉碎后的残渣和汁液，得到葵花盘粉碎物，混匀备用；
S2、选用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏编号CGMCC(B)63501进行活化；
S3、选用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保藏编号ATCC14917进行活化；
S4、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌发酵菌液的制备：将步骤S2中活化得到的枯草芽孢杆菌和步骤S3中活化得到的植物乳杆菌分别转接于500-1000ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的摇瓶中发酵6~10h，即可得到接种量在1.5×108~3.5×109cfu•g-1的枯草芽孢杆菌以及植物乳杆菌发酵菌液；
S5、葵花盘的发酵：①将步骤S1中预处理得到的葵花盘粉碎物，加入到S4制备得到的枯草芽孢杆菌发酵菌液中在30~37℃进行12~24小时有氧发酵，②加入植物乳杆菌发酵液在30~35℃进行12~24小时的无氧发酵；
S6、发酵产物的提取：取发酵液后加入3%H2O2溶液对枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进行灭活，加入CaCl2静置15-30min后离心取上清液，然后加入50%-75%的乙醇，再次离心，收集上清液，进行抽滤，再通过冷凝回流装置进行30-60min回流提取，提取完后保持温度为55℃，调pH=9.0加入碱性蛋白酶进行搅拌水解，水解完成后进行浓缩，即可得到高纯度的葵花盘生物碱，黄酮和小分子肽衍生物；
S7、葵花盘提取物的造粒：在S6中制备得到的浓缩液中加入不同用量的颗粒剂辅料混合放入干锅中，不断揉搓至“手捏成团，压之即散”的状态，之后将得到的软材料压挤过筛网，将制得的颗粒放入60℃烘箱内干燥得到含有葵花盘生物碱及其衍生物的颗粒冲剂；
所述颗粒剂辅料为可溶性淀粉和乳糖。
2.根据权利要求1所述的葵花盘生物碱及其衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤S1所用的葵花盘为新鲜葵花盘。
3.根据权利要求1所述的葵花盘生物碱及其衍生物的制备方法，其特征在于：所述S2与S3所用的固体培养基配制材料为牛肉膏：3.0g，蛋白胨：10.0g，NaCl：5.0g，琼脂：15-25g，水：1000ml，同时调节pH为7.4-7.6。
4.根据权利要求1所述的葵花盘生物碱及其衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤S1所用液体培养基材料为若配置1000mL的液体培养基，则取牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g加蒸馏水配置，用5mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.2~7.4。
5.根据权利要求1所述的葵花盘生物碱及其衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤S5中使用的葵花盘粉碎物与液体发酵液的质量比为5：1。
6.根据权利要求1所述的葵花盘生物碱及其衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤S6中CaCl2加入量为每500ml加入1g。
7.根据权利要求1所述的葵花盘生物碱及其衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤S6中提取液与浓缩液的体积比为5：1时停止浓缩。
8.根据权利要求1所述的葵花盘生物碱及其衍生物的制备方法，其特征在于：步骤S7所述的颗粒剂辅料为可溶性淀粉和乳糖。
9.根据权利要求8所述的葵花盘生物碱及其衍生物的制备方法，其特征在于：步骤S7所述的颗粒剂辅料为可溶性淀粉和乳糖在使用前要过50目的筛网。
10.权利要求1~7任意一项所述制备方法得到的葵花盘生物碱及其衍生物。
11.权利要求10所述的的葵花盘生物碱及其衍生物在制备降低尿酸和溶解痛风石药品中的应用。
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