CN113956373B - 一种裂盖马鞍菌多糖及其分离提取方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种裂盖马鞍菌多糖及其分离提取方法和用途，其中裂盖马鞍菌多糖为甘露聚糖，分子量为2.55×10⁵Da。本发明裂盖马鞍菌多糖具有很好的体外免疫调节活性，可以增强巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力，提高炎症介质(NO)和炎症因子(TNF‑α、IL‑1β、IL‑6)的表达。本发明裂盖马鞍菌多糖是天然无毒，具有研发免疫增强剂的应用前景。

Description

一种裂盖马鞍菌多糖及其分离提取方法和用途

技术领域

本发明涉及一种裂盖马鞍菌多糖及其分离提取方法和用途，属于天然产物提取和生物活性领域。

背景技术

免疫(immunity)是指机体免疫系统对一切异物或抗原性物质进行非特异或特异性识别和排斥清除的一种生理学功能。在正常生理条件下，机体的免疫系统依靠其先天具有的免疫能力及后天获得的免疫能力共同发挥免疫作用，保持机体的生理功能相对稳定。当机体免疫功能低下或受抑制时，机体的免疫系统受到损害、免疫细胞活性受到影响，从而导致多种疾病的发生。临床应用的免疫调节剂大都存在着一定程度的毒性作用和不良反应，因此，寻找和开发天然无毒的免疫调节剂成为科学研究工作者的热点。

巴楚蘑菇(Helvella leucopus)又叫裂盖马鞍菌，是非褶菌目马鞍菌科马鞍菌属的药食真菌，主要分布于新疆南部塔里木盆地、叶尔羌河和塔里木河流域的胡杨林下，其味道鲜美，营养丰富。目前，国内外有关巴楚蘑菇的研究较少，主要集中在营养成分、生物学特性、多糖提取以及粗多糖的体内外抗氧化活性等方面。前期研究表明，巴楚蘑菇多糖具有很好的体外清除自由基能力和体内抗氧化活性。大量的研究发现许多免疫性疾病与机体的自由基损伤有密切的关系。自由基(free radical)，化学上也称为“游离基”，生物体系主要遇到的是氧自由基，一定量的氧自由基在机体内是必不可少的，它参与了机体生理活动的多个有益环节，比如生物体的免疫和信号传导等过程。正常的生理情况下，体内自由基不断地产生，也不断地被抗氧化剂所清除，使之维持在一个正常的生理水平上，过多或过少都会给机体造成损伤。在某些病理情况下，机体内积累过多的活性氧自由基将会引起细胞中核酸双链断裂，蛋白质或多肽链断裂、变性，膜脂质过氧化形成多种脂质过氧化物等一系列生物学反应，导致组织细胞、亚细胞和分子结构的破坏，从而使免疫功能受损，诱发许多疾病的发生。食用菌多糖的结构是其生物活性的基础，但裂盖马鞍菌多糖的结构和免疫调节活性尚未见报道。

发明内容

本发明提供了一种裂盖马鞍菌多糖及其分离提取方法和用途。本发明裂盖马鞍菌多糖具有很好的体外免疫调节活性，具有研发免疫增强剂的应用前景。

本发明裂盖马鞍菌多糖，为甘露聚糖，分子量为2.55×10⁵Da。

本发明裂盖马鞍菌多糖的分离提取方法，包括如下步骤：

步骤1：分离提取

将裂盖马鞍菌子实体粉末经90℃水提2h，重复提取3次，合并提取液，上清液用4倍乙醇沉淀，得到粗多糖；

步骤2：sevag法脱蛋白

将步骤1获得的粗多糖水溶液、三氯甲烷和正丁醇按照体积比5：4：1的比例混合，磁力搅拌2-3h，离心后收集上清液；重复上述处理步骤直至蛋白质完全去除，获得脱蛋白裂盖马鞍菌粗多糖溶液；

步骤3：透析除杂

将步骤2获得的脱蛋白裂盖马鞍菌多糖溶液旋蒸浓缩除去有机试剂，使用3500KDa的透析袋，流水透析48h，蒸馏水透析24h，再次旋蒸浓缩至浓稠状液体，真空冷冻干燥，即得裂盖马鞍菌粗多糖；

步骤4：纯化

将步骤3获得的裂盖马鞍菌粗多糖(150mg)溶于3mL去离子水中，置于DEAE-FastFlow离子交换柱中，分别用去离子水、0.1mol/LNaCl、0.3mol/LNaCl和0.5mol/LNaCl溶液以1mL/min的流速进行梯度洗脱，自动收集器进行收集(每个浓度20管，每管5mL)，苯酚硫酸法检测收集主要组分(0.3M)，浓缩，透析并于冷冻干燥机冻干；将0.3M的主要组分置于Sepharose CL-6B分子筛(1.5×100cm)中进一步纯化，流速为0.5mL/min，自动收集器进行收集，每管4mL，按上述方法检测和收集洗脱液，并结合高效液相色谱检测纯度，对均质多糖组分进行收集、浓缩和冻干，即得裂盖马鞍菌多糖均质多糖组分。

本发明获得的裂盖马鞍菌均质多糖组分的分子量为2.55×10⁵Da，是一种甘露聚糖。红外光谱图显示裂盖马鞍菌均质多糖组分含有α和β构型，存在吡喃环，有多糖的典型特征峰。

本发明裂盖马鞍菌多糖的用途，是在制备免疫增强剂中的应用。

本发明以巨噬细胞RAW264.7为研究对象，研究无毒副作用的裂盖马鞍菌多糖的免疫增强作用。实验结果从图5、图6可知，裂盖马鞍菌多糖可以增强巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力，提高炎症介质(NO)和炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达，并呈浓度依赖性，具有开发成免疫增强剂和保健食品的应用前景。

附图说明

图1是裂盖马鞍菌多糖的高效液相色谱图。

图2是裂盖马鞍菌多糖的红外光谱图。

图3是标准单糖(3B)和裂盖马鞍菌多糖水解经PMP衍生化的高效液相色谱图(3A)(*-溶剂峰，1-甘露糖，2-鼠李糖，3-葡萄糖醛酸，4-半乳糖醛酸，5-葡萄糖，6-半乳糖，7-阿拉伯糖)。

图4是裂盖马鞍菌多糖对巨噬细胞RAW264.7的存活率的影响；图5是裂盖马鞍菌多糖对巨噬细胞RAW264.7吞噬能力的影响，与空白组比较具有显著性差异(*p<0.05，**p<0.01)。

图6是裂盖马鞍菌多糖对RAW264.7细胞NO产生及TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响，与空白组比较具有显著性差异(*p<0.05，**p<0.01)。

具体实施方式

以下通过具体的实施例描述本发明的制备，结构表征及降糖降脂活性，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。

实施例1：裂盖马鞍菌多糖的提取和分离纯化

1、分离提取

将裂盖马鞍菌清洗，烘干，粉碎并过40目筛。称取500g裂盖马鞍菌粉末，加入2L蒸馏水，搅拌均匀后超声提取5分钟，然后置于90℃水浴锅中水浴，每30min搅拌一次，2h后使用四层纱布过滤，收集上清液，向滤渣中加入2L蒸馏水，重复上述提取过程3次，合并上清液；将得到的上清液离心(4000rpm/min，10min)，弃沉淀，收集上清液，旋蒸浓缩至150mL，加入4倍体积的无水乙醇在4℃冰箱过夜沉淀，离心(4500rpm/min，10min)，收集沉淀，并用尽量少的蒸馏水溶解，再次离心(4500rpm/min，10min)，除去水不溶性物质，即得粗多糖水溶液。

2、sevag法脱蛋白

将步骤1获得的粗多糖水溶液、三氯甲烷和正丁醇按照体积比为5：4：1的比例混合，磁力搅拌2-3h，离心(7500rpm/min，10min)，收集上清液；重复上述处理步骤直至蛋白质完全去除，获得脱蛋白裂盖马鞍菌粗多糖溶液。

3、透析除杂

将步骤2获得的脱蛋白裂盖马鞍菌多糖溶液旋蒸浓缩除去有机试剂，然后装入截留分子量为3500Da的透析袋中，流动自来水中透析48h，然后在蒸馏水中磁力搅拌透析24h，每4小时换一次蒸馏水，透析完成后取出，旋蒸浓缩，真空冷冻干燥48h，即得裂盖马鞍菌粗多糖。

4、纯化

将裂盖马鞍菌粗多糖(150mg)溶于3mL去离子水，置于DEAE-fast flow离子交换柱(2.5cm×30cm)中，分别用去离子水、0.1mol/LNaCl、0.3mol/LNaCl和0.5mol/LNaCl溶液以1mL/min的流速进行梯度洗脱，自动收集器进行收集(每个浓度20管，每管5mL)，苯酚硫酸法检测收集主要组分(0.3M)，浓缩，透析并于冷冻干燥机冻干。将0.3M的主要组分置于Sepharose CL-6B分子筛(1.5×100cm)中进一步纯化，流速为0.5mL/min，自动收集器进行收集，每管4mL，按上述方法检测和收集洗脱液，并结合HPLC的出峰纯度检测，对均质多糖组分进行收集、浓缩和冻干即得裂盖马鞍菌多糖均质组分。使用的色谱柱为TSKgel G5000PWxl，规格为7.8mm×300mm。

实施例2：裂盖马鞍菌多糖的结构表征

1、分子量测定

分别精确配制1mg/mL的裂盖马鞍菌多糖HLP-1、T-3、T-7、T-10、T-1000、T-2000的溶液1mL，并用0.22μm的微孔过滤膜过滤制样。利用高效液相色谱法检测其出峰时间，上样量为30μL。根据标准品葡聚糖的出峰时间，得出分子量计算公式，并计算裂盖马鞍菌多糖的分子量。

2、单糖组成测定

裂盖马鞍菌多糖的单糖组成分析采用酸水解-柱前PMP衍生化方法处理样品，再用高效液相色谱法测定。精确称取裂盖马鞍菌多糖(10mg)溶于5mL的2moL/L的三氟乙酸(TFA)中，充氮气封管，在110℃油锅水解6h。再用旋转蒸发仪反复旋干，加适量的去离子水，再旋干，如此反复几次直到溶液PH显示中性为止。加入1mL蒸馏水，备用。

标准单糖和已水解的样品溶液中加入50μL，0.5M PMP甲醇溶液和50μL、0.3M NaOH溶液，在70℃的水浴锅中反应30min进行PMP柱前衍生化，然后用50μL的0.3M的HCl中和至中性。所得产物使用高效液相色谱检测，选用DAD检测器。HPLC柱温为30℃，色谱柱为ZorboxEclipse XDB-C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)，在波长为254nm条件下检测。检测流动相选用两种，流动相A为乙酸铵缓冲溶液(200mmoL/L)，流动相B为乙腈。时间梯度洗脱0-30min，初始设置为流动相A：流动相B＝86％：14％，最终洗脱到比例为流动相A：流动相B＝74％：26％，进样量为10μL。

3、红外光谱分析

裂盖马鞍菌多糖的红外光谱结构进行分析采用溴化钾压片法，压成薄片，在4000-400cm^-1的频率范围内进行测定。称取1mg的裂盖马鞍菌多糖，与100mgKBr(1:100)研磨均匀后检测。

实验结果：

裂盖马鞍菌多糖为甘露聚糖，分子量为2.55×10⁵Da。其红外光谱具有五个典型吸收峰，分别是3404cm^-1、2925cm^-1、1649cm^-1、1649cm^-1和1053cm^-1的位置。在3404cm^-1处出现的强而宽的峰是因为醇羟基(O-H)伸缩振动引起的，因存在分子间氢键而出现宽锋；在2925cm^-1处出现的中尖峰是饱和烷烃振动区域内，是由C-H伸缩振动产生的。在1649cm^-1处的中峰是由O-H的弯曲振动引起的，在1649cm^-1处是由C-O不对称伸缩振动引起的吸收峰。在1053cm^-1处的吸收峰认为存在吡喃环。在819cm^-1和677cm^-1处出现弱的吸收峰认为此多糖存在α和β构型。

实施例3：裂盖马鞍菌多糖的免疫调节活性

1、裂盖马鞍菌多糖对巨噬细胞存活率及吞噬作用的影响

细胞活性采用MTT实验进行测定。将RAW264.7细胞(1×10⁴细胞/孔)种于96孔板中于37℃条件下过夜，用浓度为25μg/mL至400μg/mL的HLP-1处理24h。阳性对照为LPS(1μg/mL)，空白对照为等体积培养基。过夜后，去除培养液，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，孵育4h，移除上清后加入100μL DMSO，避光振摇10min，用酶标仪测量其490nm处的OD值。

用中性红法测定巨噬细胞的吞噬能力。将RAW264.7细胞(1×10⁵细胞/孔)种于48孔板中过夜。在37℃条件下，用浓度为25μg/mL至400μg/mL的HLP-1处理24h。阳性对照为LPS(1μg/mL)，空白对照为等体积培养基。24h后，去除培养液，每孔加入100μL中性红(0.05％)，放置5min，用PBS缓冲液轻轻洗涤3次，于显微镜下观察其形态。每孔加入100μL细胞裂解液(50％乙醇：1％乙酸＝1:1)，4℃下孵育2h后转至室温下孵育12h。用酶标仪测量其540nm处的OD值。

2、裂盖马鞍菌多糖对巨噬细胞NO释放量和细胞因子水平的影响

将RAW264.7细胞(1×10⁵细胞/孔)种于96孔板中过夜，在37℃条件下，用浓度为25μg/mL至400μg/mL的HLP-1处理24h。阳性对照为LPS(1μg/mL)，空白对照为等体积培养基。然后，取细胞上清液(50μL)与等体积的Griess试剂(50μLA液和50μLB液)混合，在37℃黑暗中培养10min。通过生成NaNO₂标准曲线来测定NaNO₂的浓度。用酶标仪测量其540nm处的OD值。

将RAW264.7细胞在96孔板中以1×10⁵细胞/孔的密度培养过夜，并用浓度依次增加的HLP-1溶液(25，100，400μg/mL)处理。阳性对照为LPS(1μg/mL)，空白对照为等体积培养基。24h后吸取上清液在4℃下用1000g离心10min。根据说明手册，使用ELISA试剂盒测定TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度。

实验结果：

裂盖马鞍菌多糖HLP-1的体外免疫调节活性研究表明HLP-1可以增强巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力，提高炎症介质(NO)和炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达。

Claims (2)

1.一种裂盖马鞍菌多糖，其特征在于：

所述裂盖马鞍菌多糖为甘露聚糖，分子量为2.55×10⁵Da；

所述裂盖马鞍菌多糖是通过如下方法分离提取获得：

步骤1：分离提取

将裂盖马鞍菌子实体粉末经90℃水提2h，重复提取3次，合并提取液，上清液用4倍乙醇沉淀，得到粗多糖；

步骤2：sevag法脱蛋白

将步骤1获得的粗多糖水溶液、三氯甲烷和正丁醇混合，磁力搅拌2-3h，离心后收集上清液；重复上述处理步骤直至蛋白质完全去除，获得脱蛋白裂盖马鞍菌粗多糖溶液；

步骤3：透析除杂

将步骤2获得的脱蛋白裂盖马鞍菌多糖溶液旋蒸浓缩除去有机试剂，流水透析48h，蒸馏水透析24h，再次旋蒸浓缩至浓稠状液体，真空冷冻干燥，即得裂盖马鞍菌粗多糖；

步骤4：纯化

将步骤3获得的裂盖马鞍菌粗多糖150mg溶于3mL去离子水中，置于DEAE-Fast Flow离子交换柱中，分别用去离子水、0.1mol/LNaCl、0.3mol/LNaCl和0.5mol/LNaCl溶液以1mL/min的流速进行梯度洗脱，收集0.3M组分，浓缩，透析并于冷冻干燥机冻干；将该组分置于Sepharose CL-6B分子筛中进一步纯化，自动收集器进行收集，浓缩并冻干，即得裂盖马鞍菌多糖均质多糖组分。

2.一种权利要求1所述的裂盖马鞍菌多糖的用途，其特征在于：

所述裂盖马鞍菌多糖用于制备具有免疫增强功效的药剂或保健食品；

所述裂盖马鞍菌多糖具有体外免疫调节活性，可以增强巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力，提高炎症介质NO和炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。

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