CN105085703A

CN105085703A - 一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法

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Publication number: CN105085703A
Application number: CN201510584508.5A
Authority: CN
Inventors: 潘莹; 许经伟; 吴忆春; 李明; 赵春海; 张柱岐
Original assignee: Binzhou Polytechnic
Current assignee: Binzhou Polytechnic
Priority date: 2015-09-15
Filing date: 2015-09-15
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2035-09-15
Also published as: CN105085703B

Abstract

本发明涉及一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，包括以下步骤:采用水提、醇沉法从冬枣中提取出一次粗多糖；将一次粗多糖采用酶-三氯乙酸法进行脱蛋白处理，离心分离得到一次上清液；将一次上清液加入活性炭进行脱色处理，得到二次上清液；二次上清液经膜过滤得二次粗多糖；将二次粗多糖上离子交换柱一次层析，得多糖DP1粗品和多糖DP2粗品；将一次层析后的多糖DP1粗品和多糖DP2粗品分别上凝胶色谱柱进行二次层析，得到多糖DP1纯品和多糖DP2纯品。本发明中从冬枣中分离、纯化所得到的冬枣多糖制得的冬枣多糖DP1、多糖DP2具有一定的抗氧化活性，产品纯度高、能耗低，高品质的多糖为将来在食品、保健品、化妆品等领域更好的开发利用奠定了基础。

Description

一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法

技术领域

本发明涉及多糖提取技术领域，尤其涉及一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法。

背景技术

冬枣(Zizyphusjujubecv.Dongzao)为鼠李科枣属植物，是枣树(Zizyphusjujubecv)的果实，为我国特有的一种晚熟鲜食枣。主要产于山东、河北等地，目前在鲁北地区种植面积已超过数百万亩，故又称鲁北冬枣。冬枣因其果形美观，色泽鲜艳，果肉脆嫩多汁，富含19种人体所需的氨基酸和多种维生素，还含有丰富的钙、钾、铁、锌、铜等多种矿物质微量元素和较多的药用物质，如多糖、黄酮类、环磷酸腺苷等，有很高的食疗价值和多种保健功效，备受人们喜爱。冬枣糖分含量很高，且随着成熟度的增加，多糖含量也增加，在半红期达到最高值（参见文献：王百千,2012）。而多糖作为植物组织中的一类重要活性物质，近年来由于植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、抗氧化等多种生物活性、毒副作用小和不易造成残留等优点，对植物多糖的研究日趋增加。因此提取多糖并分离纯化制备高纯度的多糖对于开发生物活性产品具有十分重要的意义。

糖类化合物广泛分布在自然界中，其可分为单糖、低聚糖和多聚糖三类以及它们的衍生物树胶和黏液质等。其中多糖是一类天然高分子化合物，不仅是生物体重要的营养物质，而且在生物体的生命活动中发挥重要的功能，与脂质、蛋白质、核酸一起被视为生物体中最重要的4种生物大分子物质。

多糖又称多聚糖，是由醛糖或酮糖通过脱水形成糖苷键，并以糖苷键线性或分枝连接而成的链状聚合物。一般聚合度大于10，分子量为数万至数百万。目前国内外有关冬枣的研究报道，主要集中在枣树的栽培管理、果实的贮藏与加工、病虫害防治等方面，冬枣多糖提取分离纯化工艺研究报道较少，目前有资料报道冬枣多糖的提取工艺，主要为热水浸提、超声提取、微波提取以及微波辅助酶提，但提取出来的多糖含有大量的蛋白质、色素以及其他一些小分子杂质，产品纯度低、能耗高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种冬枣多糖的分离纯化方法，以冬枣为原料，采用水提、醇沉法得到一次粗多糖，并对提取的一次粗多糖进行了脱蛋白和脱色处理，膜过滤后的二次粗多糖，再依次利用离子交换一次层析、凝胶色谱柱二次层析方法首次制备出两种冬枣多糖纯品DP1和DP2，并对其理化性质、分子量、单糖组成等进行了鉴定，且制得的冬枣多糖DP1、多糖DP2具有一定的抗氧化活性，产品纯度高、能耗低，高品质的多糖为将来在食品、保健品、化妆品等领域更好的开发利用奠定了基础。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，包括以下步骤：（1）采用水提、醇沉法从冬枣中提取出一次粗多糖；（2）将所述一次粗多糖采用酶-三氯乙酸法进行脱蛋白处理，离心分离得到一次上清液；（3）将所述一次上清液加入活性炭进行脱色处理，得到二次上清液；（4）所述二次上清液经膜过滤得二次粗多糖；（5）将所述二次粗多糖上离子交换柱一次层析，得多糖DP1粗品和多糖DP2粗品；（6）将一次层析后的多糖DP1粗品和多糖DP2粗品分别上凝胶色谱柱进行二次层析，得到多糖DP1纯品和多糖DP2纯品。

（1）粗多糖的提取：挑选大小均匀、无腐烂和无机械伤的冬枣，洗净去核切成片状在60℃烘干后粉碎过60目筛，制得冬枣干粉末，按照冬枣粉与水的质量比为1:20～1:30，室温条件下浸泡30分钟后，经热水浸提，得到粗多糖提取液和滤渣；将粗多糖提取液进行浓缩，浓缩至原体积的1/2～1/4得浓缩液，向该浓缩液中加入质量浓度90%～100%的乙醇进行醇沉，乙醇与浓缩液的体积比为2～4倍，醇沉4～8h，醇沉后进行离心，得冬枣粗多糖沉淀物，将所述冬枣粗多糖沉淀物在60℃条件下真空干燥即得一次粗多糖。

（2）脱蛋白：将步骤（1）中制得的所述粗多糖配成浓度为1%（g/mL）的粗多糖溶液，向所述粗多糖溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，其中，脱蛋白的酶解温度为40-60℃，加酶量为150-450U/mL，酶解时间为1-2h；酶解后在沸水浴中灭酶15分钟后自然冷却，冷却后加入三氯乙酸（质量分数20%）得质量浓度为5%-9%的一次混合溶液，将所述混合溶液置于4℃冰箱中静置过夜，在转速为5000rpm/min条件下离心10分钟，收集一次上清液备用。

（3）脱色：将步骤（2）中所述一次上清液用1%的氢氧化钠溶液调节PH值至7.0后，加入活性炭，活性炭与上清液的量为1:100（g/mL）得二次混合溶液，在温度为40℃条件下脱色40min，将脱色后的所述二次混合溶液在转速为5000rpm/min条件下离心10分钟，收集二次上清液备用。

(4)过滤：将步骤（3）中的所述二次上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，过滤后减压浓缩，在60℃条件下真空干燥，得二次粗多糖。

（5）离子交换法一次层析：采用DEAE-52纤维素柱进行一次层析，将步骤（4）中的二次粗多糖上样，依次用蒸馏水、0.2mol/L的NaCl、0.3mol/L的NaCl和0.5mol/L的NaCl进行分段洗脱，再经减压浓缩、在流水、蒸馏水中分别透析48h、24h后分别得多糖DP1粗品和多糖DP2粗品。

（6）二次层析：采用SephadexG-100凝胶色谱柱进行二次层析，分别将步骤（5）中的多糖DP1粗品和DP2粗品上样，均用蒸馏水洗脱，减压浓缩、60℃真空干燥后制得多糖DP1纯品和多糖DP2纯品。

（7）理化性质测定：步骤（6）中所述多糖DP1纯品和所述多糖DP2纯品的浓度和分子量均测定采用凝胶色谱法测定，所述多糖DP1纯品和所述多糖DP2纯品的组成、比旋度、糖醛酸含量分别采用糖腈乙酰酯化衍生-气相色谱法、旋光光度法和硫酸-咔唑法测定。

所述多糖DP1组成主要为阿拉伯糖和葡萄糖，测定可知，阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为6.6:1:6.8:2.1，所述多糖DP2组成主要为阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖，测定可知，鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩尔比为1.4:11.0:1:3.2:4.8；另外，对多糖DP1和多糖DP2的抗氧化活性进行测定，实验证明DP1和DP2具有一定的清除羟自由基清除率，对DPPH的清除率多糖DP2明显高于多糖DP1。

本发明的有益效果是，

（1）采用酶-三氯乙酸法结合的方法进行脱蛋白处理，操作简便，无须重复多次，蛋白质脱除率高、多糖损失少。

（2）采用活性炭脱色的方法，相比于其它脱色方法，如树脂、过氧化氢脱色，成本低，脱色率和多糖保留率高。

（3）用离子交换树脂进行分离时采用分段洗脱就可以完成，方便收集洗脱液。

（4）本发明对制备出的两种多糖组成以及纯度进行了鉴定，明确了各多糖组分的理化性质，通过研究表明冬枣多糖DP1、多糖DP2具有一定的抗氧化活性，为更好的进行冬枣多糖开发奠定了基础。

附图说明

图1为本发明中的DEAE-52纤维素柱一次层析后的洗脱曲线图。

图2为本发明中的多糖DP1粗品经过SephadexG-100柱后的洗脱曲线图。

图3为本发明中的多糖DP2粗品经过SephadexG-100柱后的洗脱曲线图。

图4为多糖DP1纯品和DP2纯品羟自由基清除率的测定曲线图。

图5为多糖DP1纯品和DP2纯品的DPPH清除率测定曲线图。

具体实施方式

为了能够清楚的说明本方案的技术特点，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，包括以下步骤：

（1）粗多糖的提取：将烘干并粉碎的冬枣粉末，按照冬枣粉与水的质量比为1:25，室温条件下浸泡30分钟后，经热水浸提，得到粗多糖提取液和滤渣；将粗多糖提取液进行浓缩，浓缩至原体积的1/3得浓缩液，向该浓缩液中加入质量浓度95%的乙醇进行醇沉，加入乙醇与浓缩液的体积比为3倍，醇沉6h，醇沉后进行离心，得冬枣粗多糖沉淀物，将所述冬枣粗多糖沉淀物在60℃条件下真空干燥即得一次粗多糖。

（2）脱蛋白：将步骤（1）中制得的所述粗多糖配成体积浓度为1%的粗多糖溶液，向所述粗多糖溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，其中，脱蛋白的酶解温度为40℃，加酶量为450U/mL、酶解时间为1.5h；酶解后在沸水浴中灭酶15分钟后自然冷却，冷却后加入三氯乙酸（质量分数20%）得质量浓度为7%的一次混合溶液，将所述混合溶液置于4℃冰箱中静置过夜，在转速为5000rpm/min条件下离心10分钟，收集一次上清液备用，取上清液测定蛋白质脱除率和多糖保留率。

（3）脱色：将实施例1、实施例2和实施例3的步骤（2）中所述一次上清液用1%的氢氧化钠溶液调节PH值至7.0后，加入1%活性炭得二次混合溶液，在温度为40℃条件下脱色40min，将脱色后的所述二次混合溶液在转速为5000rpm/min条件下离心10分钟，收集二次上清液备用。

（4）过滤：将实施例1、实施例2和实施例3的步骤（3）中的所述二次上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，过滤后真空干燥，得二次粗多糖。

（5）一次层析：采用DEAE-52纤维素柱进行一次层析，将步骤（4）中的二次粗多糖上样，依次用蒸馏水、0.2mol/L的NaCl、0.3mol/L的NaCl和0.5mol/L的NaCl进行分段洗脱，流速为1mL/min，以每管5mL收集洗脱液，用苯酚-硫酸法于490nm处检测，合并各吸收的洗脱液，经减压浓缩装入透析袋，在流水、蒸馏水中分别透析48h、24h后分别得多糖DP1粗品和多糖DP2粗品，如图1所示。

（6）二次层析：采用SephadexG-100凝胶色谱柱进行二次层析，分别将步骤（5）中的多糖DP1粗品和多糖DP2粗品上样，均用蒸馏水洗脱，浓缩、真空干燥后制得多糖DP1纯品和多糖DP2纯品。

实施例2

一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，包括以下步骤：

（1）粗多糖的提取：将烘干并粉碎的冬枣粉末，按照冬枣粉与水的质量比为1:20，室温条件下浸泡30分钟后，经热水浸提，得到粗多糖提取液和滤渣；将粗多糖提取液进行浓缩，浓缩至原体积的1/2得浓缩液，向该浓缩液中加入质量浓度90%的乙醇进行醇沉，加入乙醇与浓缩液的体积比为2倍，醇沉4h，醇沉后进行离心，得冬枣粗多糖沉淀物，将所述冬枣粗多糖沉淀物在60℃条件下真空干燥即得一次粗多糖。

（2）脱蛋白：将步骤（1）中制得的所述粗多糖配成体积浓度为1%的粗多糖溶液，向所述粗多糖溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，其中，脱蛋白的酶解温度为50℃，加酶量为300U/mL、酶解时间为1h；酶解后在沸水浴中灭酶15分钟后自然冷却，冷却后加入三氯乙酸（质量分数20%）得质量浓度为5%的一次混合溶液，将所述混合溶液置于4℃冰箱中静置过夜，在转速为5000rpm/min条件下离心10分钟，收集一次上清液备用，取上清液测定蛋白质脱除率和多糖保留率。

（5）一次层析：采用DEAE-52纤维素柱进行一次层析，将步骤（4）中的二次粗多糖上样，依次用蒸馏水、0.2mol/L的NaCl、0.3mol/L的NaCl和0.5mol/L的NaCl进行分段洗脱，，流速为1mL/min，以每管5mL收集洗脱液，用苯酚-硫酸法于490nm处检测，合并各吸收的洗脱液，经减压浓缩装入透析袋，在流水、蒸馏水中分别透析48h、24h后分别得多糖DP1粗品和多糖DP2粗品，如图1所示。

（6）二次层析：采用SephadexG-100凝胶色谱柱进行二次层析，分别将步骤（5）中的多糖DP1粗品和DP2粗品上样，均用蒸馏水洗脱，浓缩、真空干燥后制得多糖DP1纯品和多糖DP2纯品。

实施例3

一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，包括以下步骤：

（1）粗多糖的提取：将烘干并粉碎的冬枣粉末，按照冬枣粉与水的质量比为1:30，室温条件下浸泡30分钟后，经热水浸提，得到粗多糖提取液和滤渣；将粗多糖提取液进行浓缩，浓缩至原体积的1/4得浓缩液，向该浓缩液中加入质量浓度100%的乙醇进行醇沉，加入乙醇与浓缩液的体积比为4倍，醇沉8h，醇沉后进行离心，得冬枣粗多糖沉淀物，将所述冬枣粗多糖沉淀物在60℃条件下真空干燥即得一次粗多糖。

（2）脱蛋白：将步骤（1）中制得的所述粗多糖配成体积浓度为1%的粗多糖溶液，向所述粗多糖溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，其中，脱蛋白的酶解温度为60℃，加酶量为150U/mL、酶解时间为2h；酶解后在沸水浴中灭酶15分钟后自然冷却，冷却后加入三氯乙酸（质量分数20%）得质量浓度为9%的一次混合溶液，将所述混合溶液置于4℃冰箱中静置过夜，在转速为5000rpm/min条件下离心10分钟，收集一次上清液备用，取上清液测定蛋白质脱除率和多糖保留率。

（5）一次层析：采用DEAE-52纤维素柱进行一次层析，将步骤（4）中的二次粗多糖上样，依次用蒸馏水、0.2mol/L的NaCl、0.3mol/L的NaCl和0.5mol/L的NaCl进行分段洗脱，流速为1mL/min，以每管5mL收集洗脱液，用苯酚-硫酸法于490nm处检测，合并各吸收的洗脱液，经减压浓缩装入透析袋，在流水、蒸馏水中分别透析48h、24h后分别得多糖DP1粗品和多糖DP2粗品。

其中，酶解脱蛋白温度对冬枣多糖蛋白质脱除率的影响如表一，酶法脱蛋白时间对冬枣多糖蛋白质脱除率影响如表二，木瓜蛋白酶加入量对冬枣多糖蛋白质脱除率影响如表三，酶解法脱蛋白正交试验因素水平如表四，酶解法脱蛋白正交试验因素水平结果如表五，三氯乙酸量对蛋白质脱除率及多糖蛋白质脱除率的影响如表六。

由表一可知，随着温度从40℃到60℃逐步升高，冬枣多糖蛋白质脱除率逐渐减小，故选择最佳脱蛋白温度为40℃。

由表二可知，随着脱蛋白时间的增加，蛋白质脱除率逐渐增加，到了2h后开始变小，从节约时间的角度考虑，最佳脱蛋白时间为1～2h。

由表三可知,随着木瓜蛋白酶加入量的增加,蛋白质脱除率逐渐增加,当加酶量由150U/mL增加至300U/mL时，蛋白质脱除率增加了3.00%，而当加酶量由300U/mL增加至450U/mL蛋白质脱除率增加了1.08%，从450U/mL之后蛋白质脱除率增加的幅度较小，故选择木瓜蛋白酶最佳加入量为300U/mL～450U/mL。

采用加权评分法，权重系数为0.5，综合评分=（蛋白质脱除率/最大值）×100×0.5+（多糖保留率/最大值）×100×0.5。

由表四和表五可知，影响冬枣多糖蛋白质脱除率的先后顺序为：酶解温度＞酶解时间＞加酶量，其中酶解温度具有显著效应；影响冬枣多糖保留率的先后顺序为：加酶量＞酶解时间＞酶解温度，均无显著效应。采用综合加权法，最终确定木瓜蛋白酶脱蛋白的最佳工艺为：加酶量为450U/mL，在40℃下酶解1.5h，此时冬枣多糖蛋白质脱除率为40.99%，多糖保留率为90.19%。

随着三氯乙酸浓度的增加，蛋白质脱除率逐渐增加，同时多糖保留率逐渐减小，当三氯乙酸浓度由7%增加至9%时，蛋白质脱除率增加了0.843%，而多糖保留率几乎不变，综合考虑蛋白质脱除率和多糖保留率，确定三氯乙酸最佳脱蛋白浓度为9%。

实施例4

一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，包括以下步骤：

（1）粗多糖的提取：将烘干并粉碎的冬枣粉末，按照冬枣粉与水的质量比为1:25，室温条件下浸泡30分钟后，经热水浸提，得到粗多糖提取液和滤渣；将粗多糖提取液进行浓缩，浓缩至原体积的1/4得浓缩液，向该浓缩液中加入质量浓度95%的乙醇进行醇沉，加入乙醇与浓缩液的体积比为2倍，醇沉8h，醇沉后进行离心，得冬枣粗多糖沉淀物，将所述冬枣粗多糖沉淀物在60℃条件下真空干燥即得一次粗多糖。

（2）脱蛋白：将步骤（1）中制得的所述粗多糖配成体积浓度为1%的粗多糖溶液，向所述粗多糖溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，其中，脱蛋白的酶解温度为40℃，加酶量为450U/mL、酶解时间为1.5h；酶解后在沸水浴中灭酶15分钟后自然冷却，冷却后加入浓度为9%的三氯乙酸得一次混合溶液，将所述混合溶液置于4℃冰箱中静置过夜，在转速为5000rpm/min条件下离心10分钟，收集一次上清液备用，取上清液测定蛋白质脱除率和多糖保留率。

理化性质测定：实施例4中的步骤（6）中所述多糖DP1纯品和所述多糖DP2纯品的浓度和分子量均测定采用凝胶色谱法测定，所述多糖DP1纯品和所述多糖DP2纯品的组成、比旋度、糖醛酸含量分别采用糖腈乙酰酯化衍生-气相色谱法、旋光仪测定和硫酸-咔唑法测定。

一、冬枣多糖DP1和DP2组分纯度和分子量测定采用凝胶色谱法：

将标准葡聚糖T10、T20、T40、T70、T500、DP1纯品和DP2纯品分别配成3mg/mL浓度，各取1mL分别上SephadexG-100凝胶色谱柱（1.6×40cm），用蒸馏水洗脱，流速为0.3mL/min，以每管1.5mL收集洗脱液，用苯酚-硫酸法逐管检测，记录不同相对分子质量的多糖经过凝胶柱的洗脱体积（）和用蓝色葡聚糖-2000上柱求得柱的外水体积（），以/为纵坐标，lg为横坐标，计算曲线方程，并绘制冬枣多糖洗脱曲线，根据洗脱曲线判断多糖纯度是否均一。

由标准葡聚糖的洗脱体积（）和蓝色葡聚糖-2000外水体积（）及其分子量,得标准曲线方程为/=-0.5978lgMw+6.9012，R²=0.9973，两种冬枣多糖DP1和DP2的分子量分别为1.04×10⁴Da、3.02×10⁵Da。

如图2和图3所示，洗脱曲线中DP1和DP2峰形尖锐，对称性好，说明其纯度较高，分子量分布较为均一。

二、冬枣多糖纯品DP1和DP2组成的测定：

2.1、分别称取10mg多糖样品DP1、DP2和标准单糖（鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、葡萄糖、D-半乳糖）各加入3mL的2mol/L三氟乙酸，封管后110℃下水解4h，待水解产物冷却至室温，加入3mL甲醇，50℃氮吹浓缩至干，重复3次，尽量除尽三氟乙酸，得多糖水解产物；

2.2、水解产物中分别加入10mg盐酸羟胺，5mg肌醇，0.5mL无水吡啶，混匀90℃水浴加热30min，取出，冷却至室温，加入0.5mL无水乙肝，90℃水浴加热30min，制得多糖样品糖腈乙酰化产物，在氮吹仪上浓缩至干，加入1.0mL氯仿复溶，溶液经0.45μm滤膜过滤后进GC分析。

其中，气相色谱条件为：SE-30毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm），FID检测器，氢气体积流量为16mL/min，空气体积流量150mL/min，氮气体积流量20mL/min，进样口温度230℃，检测器温度240℃，色谱柱采用程序升温，起始温度130℃，以5℃/min升至180℃/min，保持2min，再以5℃/min升至220℃/min，保持10min。

三、冬枣多糖纯品DP1和DP2比旋度测定：

将冬枣多糖DP1和DP2分别配制成10mg/mL溶液，在20℃下用1dm的旋光管测定其旋光度分别为：+20.55°、+68.01°。

四、冬枣多糖纯品DP1和DP2糖醛酸含量测定：

将冬枣多糖DP1、DP2配制成1mg/mL溶液，以半乳糖醛酸为对照，采用硫酸-咔唑法，在523nm处测定吸光度，绘制标准曲线为A=0.0058C+0.03，浓度范围为：10.7～107μg/mL，R²=0.993，DP1和DP2中糖醛酸的含量分别为2.2759%、5.5603%。

综上，冬枣多糖纯品DP1和DP2的理化性质测定结果，如下表七：

结果表明，DP1的组成主要为阿拉伯糖和葡萄糖，DP2主要组成为阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖。

五、多糖纯品DP1和DP2的抗氧化活性研究

5.1羟自由基清除率的测定

操作步骤：

将冬枣多糖纯品DP1和DP2用蒸馏水分别配成0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、2.4、3.2、4、4.8、6.4、8mg/mL浓度溶液，采用邻二氮菲法进行羟自由基清除率的测定，以Vc为对照。取1mL0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中依次加入2mL50mmmol/LpH7.4磷酸盐缓冲溶液和1mL蒸馏水，充分混合后，加入1mL0.75mmol/L硫酸亚铁溶液，混匀后，加入1mL0.01%双氧水，于37℃水浴60min后，在536nm测定其吸光度，所测得的数据为损伤管的吸光值A_损。未损管以1mL蒸馏水代替损伤管中1mL0.01%双氧水，操作方法同损伤管，可测得536nm未损伤管的吸光值A_未。样品管以1mL样品代替损伤管中的1mL蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得536nm样品管的吸光值A_样。清除率I的计算公式：

I（%）=

结果如图4所示，在一定浓度范围内随着多糖浓度的增加，羟自由基清除率逐渐增加，其中DP1和DP2在8mg/mL时，羟自由基清除率分别为28.52%、78.79%，表明冬枣多糖纯品DP1和DP2都具有一定的清除羟自由基清除率的作用。

5.2DPPH清除率的测定

采用二苯代苦味肼基自由基（DPPH）体系测定冬枣多糖DP1和DP2的DPPH清除率，并以Vc为对照。用无水乙醇配制DPPH溶液的浓度为2×10^-4mol/L，取一系列浓度为0.0025、0.005、0.01、0.02、0.04、0.05、0.1、0.2、0.4mg/mL的多糖溶液2.0mL加入DPPH溶液2.0mL摇匀后，暗处放置30min，以2.0mL无水乙醇和2.0mLDPPH混合液为空白，以2.0mL多糖液和2.0mL无水乙醇为对照，以Vc为对照，分别在517nm处测定吸光度，按照公式清除率（%）=[1-(A_样品-A_对照)/A_空白]×100%。

由图5可知，随着冬枣多糖DP1和DP2浓度的增加，DPPH清除率逐渐成递增趋势，当样液浓度为0.4mg/mL时，DP1和DP2的DPPH清除率分别为9.97%、24.54%。

Claims

1.一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤:

（1）采用水提、醇沉法从冬枣中提取出一次粗多糖；

（2）将所述一次粗多糖采用酶-三氯乙酸法进行脱蛋白处理，离心分离得到一次上清液；

（3）将所述一次上清液加入活性炭进行脱色处理，得到二次上清液；

（4）所述二次上清液经膜过滤得二次粗多糖；

（5）将所述二次粗多糖上离子交换柱一次层析，得多糖DP1粗品和多糖DP2粗品；

（6）将一次层析后的多糖DP1粗品和多糖DP2粗品分别上凝胶色谱柱进行二次层析，得到多糖DP1纯品和多糖DP2纯品。

2.如权利要求1所述的一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，其特征在于，所述步骤（1）中水提、醇沉法提取所述一次粗多糖具体为：将烘干并粉碎的冬枣粉末，按照冬枣粉与水的质量比为1:20～1:30，室温条件下浸泡30分钟后，经热水浸提，得到粗多糖提取液和滤渣；将粗多糖提取液进行浓缩，浓缩至原体积的1/2～1/4得浓缩液，向该浓缩液中加入质量浓度90%～100%的乙醇进行醇沉，乙醇与浓缩液的体积比为2～4倍，醇沉4～8h，醇沉后进行离心，得冬枣粗多糖沉淀物，将所述冬枣粗多糖沉淀物在60℃条件下真空干燥即得一次粗多糖。

3.如权利要求2所述的一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，其特征在于，所述热水浸提的提取温度80-100℃，料液比为1:20-1:30，浸提时间为2-4h。

4.如权利要求1或2所述的一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，其特征在于，所述步骤（2）的脱蛋白处理具体为：将步骤（1）中制得的所述粗多糖配成体积浓度为1%的粗多糖溶液，向所述粗多糖溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，酶解后在沸水浴中灭酶15分钟，自然冷却，冷却后加入三氯乙酸得质量浓度为5%-9%的一次混合溶液，将所述混合溶液置于4℃冰箱中静置过夜，在转速为5000rpm/min条件下离心10分钟，收集一次上清液备用。

5.如权利要求4所述的一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，其特征在于，脱蛋白的酶解温度为40-60℃，加酶量为150-450U/mL，酶解时间为1-2h。

6.如权利要求4所述的一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，其特征在于，所述步骤（3）的脱色处理具体为：将步骤（2）中所述一次上清液用1%的氢氧化钠溶液调节pH值至7.0后，加入1%活性炭得二次混合溶液，在温度为40℃条件下脱色40min，将脱色后的所述二次混合溶液在转速为5000rpm/min条件下离心10分钟，收集二次上清液备用。

7.如权利要求1所述的一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，其特征在于，所述步骤（4）膜过滤具体为：将步骤（3）中的所述二次上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，过滤后减压浓缩、真空干燥，得二次粗多糖。

8.如权利要求1所述的一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，其特征在于，所述步骤（5）离子交换柱一次层析具体为：选用DEAE-52纤维素柱进行一次层析，将步骤（4）中的二次粗多糖配成一定浓度上样，依次用蒸馏水、0.2mol/L的NaCl、0.3mol/L的NaCl和0.5mol/L的NaCl进行分段洗脱，再经浓缩、透析后分别得多糖DP1粗品和多糖DP2粗品。

9.如权利要求7所述的一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，其特征在于，所述步骤（6）凝胶色谱柱二次层析具体为：SephadexG-100凝胶色谱柱进行二次层析，分别将步骤（5）中的多糖DP1粗品和多糖DP2粗品上样，均用蒸馏水洗脱，浓缩、真空干燥后制得多糖DP1纯品和多糖DP2纯品。

10.如权利要求8或9所述的一种从冬枣中分离、纯化多糖的方法，其特征在于，所述多糖DP1纯品组成主要为阿拉伯糖和葡萄糖，所述多糖DP2纯品组成主要为阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖。