CN103788226A - 冬枣多糖的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种冬枣多糖的提取方法。该方法包括下述的步骤：选取无虫眼无霉变颗粒饱满的冬枣，清洗干净，晾干；去枣核，保留枣肉，将枣肉切碎；将复合酶处理枣肉，酶解液置于微波炉，加水，微波提取，得提取液；将提取液过滤，得滤液，浓缩滤液，加乙醇至浓缩滤液中，离心，收集沉淀，将沉淀溶于水中，再次用乙醇沉淀，离心，沉淀用无水乙醇、丙酮反复洗涤，加热干燥，得冬枣多糖粗品。本发明和传统的酸、碱提取相比，节省了成本，避免了环境污染，采用复合酶提取，在提高大枣多糖产品的纯度与得率的前提下，提高了冬枣多糖的提取效率，有利于冬枣多糖的开发和综合利用。

Description

冬枣多糖的提取方法

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种冬枣多糖的提取方法。 

背景技术                          

冬枣营养丰富，除了含有大量的糖以外，还含有19种人体必需的氨基酸、大量的无机盐类、多种维生素、膳食纤维等，其中多糖的含量高达50%以上，高于金丝小枣20%。多糖是红枣中重要的活性物质，可作为免疫促进剂，控制细胞的分裂和分化，有明显的抗体活性和促进淋巴细胞增殖的作用，具有抗癌、抗氧化、抗衰老等生理活性，可广泛应用于医药、保健品及功能食品。

冬枣多糖的作用如下： 

抗疲劳作用：长时间以来，运动性疲劳一直是人们研究的热点，但是至今没有一个完整的定论。大多数人认为，运动性疲劳的产生与运动中体内自由基的累积有关，尤其是高强度的力竭性运动。氧自由基的积累会引起脂质的过氧化，从而损伤线粒体膜等生物膜，引发一系列细胞代谢机能紊乱，使肌肉工作能力下降产生疲劳。王海元通过给小鼠湖口服不同剂量的红糖多糖，然后测小鼠游泳至力竭的时间。结果表明：一定课题的红枣多糖可延长小鼠游泳至力竭的时间，表明红枣多糖具有较强的抗疲劳作用。同时红枣多糖可以通过增加储备来提高运动能力，保证了机体在长时间运动时的能量来源，延缓运动疲劳的发生。

抗氧化作用：机体在生命活动的氧化代谢过程中不断的产生各种活性氧自由基，它们独立存在，含有一个或多个不成对的电子或分子，自由基易损伤组织，引起各种疾病，包括肿瘤、衰老、心脑系统损伤，与神经系统及糖尿病并发症等很多疾病的发生有密切的关系。因此，氧自由基被称为万病之源。李小平等人对提取的红枣多糖粗品的抗氧化作用进行了探讨，结果表明，红枣多糖能提高小鼠血液，肝脏及脑组织中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，降低小鼠血液、肝脏及脑组织丙二醛含量，表明红枣多糖体内具有抗氧化作用。 

抗补体作用，补体系统是一类存在于人和脊椎动物正常新鲜血清中的非特异性球蛋白，大多是以酶的前体形式存在于血清中，需经过抗原-抗体复合物或其它因子激活后，才能发挥生物学活性作用。全是补体系统的非正常激活会引起人体免疫系统的过度反应，造成人体自身正常组织细胞的损伤，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎的自身免疫病。张庆等人研究了国产大枣果料粗多糖体外对补体活性及混合淋巴细胞培养反应的影响，结果表明，大枣粗多糖具有明显的抗补体活性，且具有浓度依赖关系，促进小鼠脾细胞的增殖作用呈现先升高后下降的趋势。 

调节血脂的作用：血脂是血浆中的中性脂肪和类脂的总称，包括甘油三酯、胆固醇 、磷脂、糖脂、固醇和类固醇等，它们是生命细胞的基础代谢的必需物质。但是当血脂含量升高后，就会提高动脉粥样硬化症、冠心病、脑血栓、高血压等心血管病症的发病率。李小平探讨了红枣多糖粗品对血脂水平的调节作用，结果表明，红枣多糖能抑制高脂饲料所致的小鼠血清甘油三脂、总胆固醇和动脉继样硬化指数的升高，抑制高密度脂蛋白固醇的降低，表明红枣多糖粗品能抑制高脂饲料所致小鼠血脂的升高，具有降血脂的作用。 

抗肿瘤作用：研究表明，多糖具有较强的抗肿瘤作用。多糖的抗肿瘤机制有两种：一种是具有通过激活机体的免疫系统，诱导细胞分化，刺激造血、抗转移、抗新生血管的生成，诱导NO产生等生物活性的多糖，这类多糖与机体的免疫细胞通过分子水平的接触，免疫细胞被激活，释放出某些类型的细胞转导信号民，从而激发和增强免疫反应，再通过增强机体的免疫功能间接抑制或杀死肿瘤细胞。另一种是具有细胞毒性的多糖，可以直接杀死肿瘤细胞。辛娟在体外通过MTT法检测大枣多糖提取物对人肝癌细胞株增殖与活力的影响。结果表明，大枣多糖提取物可以明显的抑制人体肝癌细胞的增殖，并且可以诱导细胞的凋亡。 

目前对常见的新疆、河北等地区的枣多糖研究较多，主要通过传统提方法包括碱提取法、酶提取法、热水提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法对枣多糖进行提取，提取效率较低，对影响因子考察单一，影响枣多糖的提取效率，同时由于冬枣自身结构特点（质脆，多汁，残渣少等），目前对冬枣多糖的提取研究较少，目前文献中主要用单一溶剂乙醇进行提取。 

以碱法提取为例。冬枣多分子质量较大，含朋糖醛酸的多糖和酸性多糖在热水中溶解度较小，而采用碱水提取效率较高。采用碱液提取时，一般以0.1-1ml/L氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钠溶液为溶剂。杨云等人在提取香精后的大枣渣中分别加入20倍体积的碳酸钠、氢氧化钠、氧化钙溶液，于60度的热水中温浸2小时，发现大枣多糖得率由高到低的顺序是碳酸钠提取，氧化钙提取，氢氧化钠提取；此外，杨云等人还用正交试验法对碱提取大枣多糖的工艺进行优选，得到了最佳的工艺：加入20倍枣渣体积的0.5mol/L的碳酸钠溶液，于80℃温浸3小时。 

上述的方法其缺点是，碱法提取作用剧烈，对枣内部的细胞破坏较大，而且还需对碱液作后续的处理。因此需要针对上述的缺陷进行改进，设计一种提取率高，作用条件温和的提取方法。 

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种提取率高且安全的冬枣多糖的提取方法，本发明结合传统对普通枣多糖的提取方法，通过响应面方法综合考察了因素对冬枣多糖提取的影响，发明出一种新型的提取冬枣多糖的方法。 

本发明的冬枣多糖的提取方法是通过下述的技术方案来实现的： 

冬枣多糖的提取方法，该方法包括下述的步骤：

（1）选取无虫眼无霉变颗粒饱满的冬枣 ，清洗干净，晾干；

（2）除去冬枣的枣核，保留枣肉，将枣肉切碎；

（3）将切碎的枣肉置于微波炉，加入水，调整微波功率和pH值，微波提取，得提取液；

（4）将提取液趁热过滤，得滤液，浓缩滤液，加入乙醇至浓缩滤液中，离心，收集沉淀，将沉淀溶于水中，再次用乙醇沉淀，离心，沉淀用无水乙醇、丙酮反复洗涤，加热干燥，得冬枣多糖粗品。

上述的水与枣肉的重量比为18-22：1。 

上述的微波的功率为500-550W。 

上述的提取过程中调节pH值为6.8-7.2。 

步骤（4）中将滤液浓缩至原滤液原体积的1/5-1/3。 

步骤（4）中，两次沉淀所加95%乙醇的量均为浓缩液体积的4-6倍。 

步骤（3）中，微波提取的时间为60s。 

作为本发明的一种改进，在微波处理之前加入复合酶分步酶解红枣，具体为：步骤（2）后，将切碎的枣肉加入水，再加入复合酶酶解，所述的复合酶酶解的条件为：加入占红枣果肉重1%的果胶酶酶解，调节溶液pH值为7，40℃下提取2小时； 

再加入酸性蛋白酶和淀粉酶，所述的酸性蛋白酶和淀粉酶与果胶酶的重量比例如下：酸性蛋白酶、果胶酶、淀粉酶=95：3：2，酶解pH为4.2，酶解温度为40℃，酶解时间为2小时；95℃下灭酶5min。

作为本发明的另一种改进，在微波处理之前加入复合酶同步酶解红枣，具体为：步骤（2）后，将切碎的枣肉加入水，再加入复合酶酶解，加入果胶酶、酸性蛋白酶和淀粉酶，所述的复合酶的重量比例如下：酸性蛋白酶、果胶酶、淀粉酶=95：3：2，酶解pH为4.2，酶解温度为40℃，酶解时间为2小时；95℃下灭酶5min。 

本发明的有益效果为：本发明的提取方法，包括冬枣、粉碎、提取上清液、乙醇浸提等步骤，不需要增加复杂的去蛋白等提取工序，就可以大幅提高多糖的提取率，多糖的得率达到6.4%左右。本发明考虑了多因素对多糖提取的影响，在乙醇浸提步骤中乙醇与上清液的体积比例、提取过程中水的温度、提取上清液步骤中的处理时间、提取上清液步骤中水与粉碎的冬枣的质量比等对多糖得率的影响多方面进行了改进，增加多糖的提取率，并避免了使用酸、碱提取，节省了成本，避免了环境污染，提高了冬枣多糖的提取效率，有利于冬枣多糖的开发和综合利用。 

附图说明

图1温度和微波复合作用下对提取率的响应面优化图； 

图2微波和料液比复合作用下对提取率的响应面优化图；

图3温度和乙醇浓度复合作用下对提取率的响应面优化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。 

实施例1 

冬枣多糖的提取方法，其特征在于，所述的方法包括下述的步骤：

（1）选取无虫眼无霉变颗粒饱满的冬枣 ，清洗干净，晾干；

（2）除去冬枣的枣核，保留枣肉，将枣肉切碎；

将切碎的枣肉加入到水中，使料液比为1：10，再加入复合酶酶解，复合酶酶解的条件为：加入占红枣果肉重1%的果胶酶酶解，调节溶液pH值为7，40℃下提取2小时；

再加入酸性蛋白酶和淀粉酶，所述的酸性蛋白酶和淀粉酶与果胶酶的重量比例如下：酸性蛋白酶、果胶酶、淀粉酶=95：3：2，酶解pH为4.2，酶解温度为40℃，酶解时间为2小时；95℃下灭酶5min，得酶解液；

（3）将上述的酶解液置于微波炉，加入水，水与枣肉的重量比为20：1，调整微波功率520W和pH值7，微波提取，得提取液；

（4）将提取液趁热过滤，得滤液，然后在真空旋转蒸发浓缩为原体积的l/4后，缓缓加入浓缩液五倍体积的95％乙醇，离心，收集多糖沉淀，沉淀复溶于水中，再次用五倍体积的95％乙醇沉淀，离心，沉淀用无水乙醇、丙酮反复洗涤，水浴加热干燥，得到冬枣多糖粗品。

多糖含量测定方法 

苯酚硫酸法测定多糖含量

①苯酚-硫酸法原理

糖类在强无机酸条件下经脱水反应生成醛类，反应生成的醛类与各种酚类缩合产生特有的有色物质，不同的多糖和单糖经显色反应后具有不同的最大吸收峰，己糖在490nm处有最大吸收峰，戊糖和糖醛酸在480nm处有最大吸收峰，吸收值与糖含量呈线性关系^[16]。冬枣多糖在浓硫酸脱水作用下反应生成的醛类与苯酚缩合产生特有的有色物质，在490nm处有最大吸收峰。

②5％苯酚溶液的配制 

称取苯酚50g，加铝片0.1g，NaHCO₃0.05g，蒸馏，收集180～182℃的馏分，快速称取馏分12.5g，置250mL深色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，避光，冷藏，备用。

③标准溶液的配制 

称取105℃烘干至恒质量的葡萄糖98.2mg，置于100mL容量瓶中，加入适量的蒸馏水使其溶解，定容。静置10min后，精密移取上述溶液10mL置于100mL容量瓶中，定容。即配得0.0982mg/mL的葡萄糖标准溶液。

④标准曲线的制作 

各试管加入5%重蒸苯酚试液1mL充分振荡摇匀后，迅速加入浓硫酸5mL，混匀，摇匀后放置5 min，置沸水浴中加热15 min，取出后迅速冷却至室温，于490nm波长处测定吸光度。以质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

⑤换算因数的测定：精密称取60℃干燥至恒重的冬枣多糖20mg，加蒸馏水溶解，并定容至100mL的容量瓶中，摇匀。准确吸取上述溶液0.50mL，加水至1.00mL，用制作标准曲线同样的方法测其吸光度值。按f=W/CD计算换算因素，其中W为冬枣多糖质量（mg），C为多糖液中葡萄糖的质量（mg/mL），D为多糖的稀释倍数。测得f=2.33。 

⑥冬枣多糖的计算 

多糖提取率（%）=粗多糖质量/冬枣质量×100%。

实施例2 

冬枣多糖的提取方法，其特征在于，所述的方法包括下述的步骤：

（1）选取无虫眼无霉变颗粒饱满的冬枣 ，清洗干净，晾干；

（2）除去冬枣的枣核，保留枣肉，将枣肉切碎；

将切碎的枣肉加入到水中，再加入复合酶酶解，加入果胶酶、酸性蛋白酶和淀粉酶，所述的复合酶的重量比例如下：酸性蛋白酶、果胶酶、淀粉酶=95：3：2，酶解pH为4.2，酶解温度为40℃，酶解时间为2小时；95℃下灭酶5min，得酶解液；

（3）将上述的酶解液置于微波炉，加入水，水与枣肉的重量比为20：1，调整微波功率520W和pH值7，微波提取，得提取液；

（4）将提取液趁热过滤，得滤液，然后在真空旋转蒸发浓缩为原体积的l/4后，缓缓加入浓缩液五倍体积的95％乙醇，离心，收集多糖沉淀，沉淀复溶于水中，再次用五倍体积的95％乙醇沉淀，离心，沉淀用无水乙醇、丙酮反复洗涤，水浴加热干燥，得到冬枣多糖粗品。

实施例3 

表1微波功率对冬枣多糖提取率的影响

    由表1可以知道及附图1可以看出，微波功率在130～520W范围内冬枣多糖的提取率随着微波功率的增加而逐渐提高，而在520W以后，冬枣多糖提取率反而随着微波功率的增加而减少，在520W时冬枣多糖提取率为最大。

由理论可以得到以下分析，当微波提取时间、溶剂pH值和液固比一定时，功率越高，提取率就越高，提取就越完全；但是如果超过一定限度，则会使提取体系压力升高到冲开容器安全阀的程度，使溶液溅出，造成损失，产生误差。因此，微波提取冬枣多糖最佳功率为520W。 

表2微波提取时间对冬枣多糖提取率的影响 

从表2可以知道及图2可以看出，在开始时，随着微波提取时间的增加，冬枣多糖提取率迅速增加，40s时达到最大；在40s之后随着微波提取时间的延长，冬枣多糖提取率呈现减少的趋势。

由理论可以得到以下分析，微波提取时间可明显提高提取率，起初随着微波提取时间增加，提取率增加。一方面，微波同时提高了冬枣内部的温度和压力，推动力增加，扩散速率加快；另一方面，细胞壁受到破碎而孔径增大，传质阻力减小。但随着微波提取时间延长，冬枣多糖提取率呈现下降态势，原因可能是由于微波作用时间过长，降低某些反应的活化能，使原来不能自发进行的反应变得易于发生，使多糖分子之间、多糖分子与其它分子之间形成新的作用力，增加了分子之间碰撞机会，阻止了多糖分子加入溶液，也可能是蛋白质变性沉淀后包裹在果肉颗粒表面，导致了冬枣多糖提取率下降。因此，微波提取冬枣多糖最佳提取时间为40s。 

表3液固比对冬枣多糖提取率的影响  

由表3可以知道及附图3可以看出，当液固比增大时，冬枣多糖提取率随着增加，增加幅度很大，但是液固比超过20：1mL/g后，冬枣多糖产率随着减小，减小的幅度不小。

由理论可以得到以下分析，液固比(提取剂用量即水的用量)对于多糖的提取率有很大影响，在一定范围内水量越大，多糖提取越完全，但水量的多少对后续的浓缩、醇沉和离心步骤效率影响很大，所以控制适当的水量是十分重要的。当液固比大于20：1(mL/g)时，离心后并不是所有多糖都以沉淀形式沉淀到离心管底部，而是有些多糖还以絮状形式漂浮在乙醇水溶液的最上层，所以收集多糖沉淀时，絮状多糖不可避免地被损失。因此，微波提取冬枣多糖最佳液固比为20：1（mL/g）。 

表4溶剂pH值对冬枣多糖提取率的影响  

由表4可以知道，在溶剂pH值在3～7范时，随着溶剂pH值的增加冬枣多糖提取率会相应增加，增加幅度很大，但是当溶剂pH值在7～9时，随着溶剂PH值增加冬枣多糖提取率会相应减少，减小幅度很大，溶剂pH值在9～11范围时，随着溶剂pH值增加冬枣多糖提取率会相应减少，减少幅度很小。

由理论可以得到以下分析，溶剂的酸碱性可能会影响冬枣细胞壁的通透性或者会使细胞壁的物质变性，影响溶出，签于各种因素的综合作用，在pH控制在7，时间控制在60s情况下，综合分析温度、微波、料液比、乙醇比例对冬枣多糖的提取的影响。 

(A)，溶剂pH值 (B)，微波提取时间(C)，液固比(D)。为优化提取条件，采用响应面方法设计实验。 

响应面实验结果和分析 

表5响应面实验设计表

表6 试验安排表

 

模拟回归方程如下：    R1 =+6.06-0.075 * A+0.21 * B-2.500E-003 * C-0.29 * D   +0.14 * A * B+0.038 * A * C +0.38 * A * D+0.25 * B * C+0.51 * B * D-0.41 * C * D-0.92 * A2-0.26 * B2-0.13* C2-0.17 * D2

理论计算提取率值为8.29%。    

表7                            

经过酸性蛋白酶处理后，pH控制在7，时间控制在60s情况下，功率为359W，温度90，料液比30%，乙醇浓度为70%，条件下做两次实验进行验证，两次实验所得到的冬枣多糖的提取率分别为8.18%和8.26%，取平均值8.22%。

本方法通过复酸性蛋白的处理提高了多糖的提取率，降低了冬枣中蛋白对多糖纯度的影响，同时四种因素的复合应用合理配比，大大缩短了提取时间（文献报道枣多糖提取在10h左右），本方法多糖的计算表示更加科学即：多糖提取率（%）=粗多糖质量/冬枣质量×100%，直接反应了冬枣多糖的含量。 

  

Claims (9)

1.冬枣多糖的提取方法，其特征在于，所述的方法包括下述的步骤：

（1）选取无虫眼无霉变颗粒饱满的冬枣 ，清洗干净，晾干；

（2）除去冬枣的枣核，保留枣肉，将枣肉切碎；

（3）将切碎的枣肉置于微波炉，加入水，调整微波功率和pH值，微波提取，得提取液；

（4）将提取液趁热过滤，得滤液，浓缩滤液，加入乙醇至浓缩滤液中，离心，收集沉淀，将沉淀溶于水中，再次用乙醇沉淀，离心，沉淀用无水乙醇、丙酮反复洗涤，加热干燥，得冬枣多糖粗品。

2.如权利要求1所述的一种冬枣多糖的提取方法，其特征在于，所述的水与枣肉的重量比为18-22：1。

3.如权利要求1所述的一种冬枣多糖的提取方法，其特征在于，所述的微波的功率为500-550W。

4.如权利要求1所述的一种冬枣多糖的提取方法，其特征在于，所述的提取过程中调节pH值为6.8-7.2。

5.如权利要求1所述的一种冬枣多糖的提取方法，其特征在于，所述的步骤（4）中将滤液浓缩至原滤液原体积的1/5-1/3。

6.如权利要求1所述的一种冬枣多糖的提取方法，其特征在于，所述的步骤（4）中，两次沉淀所加95%乙醇的量均为浓缩液体积的4-6倍。

7.如权利要求1所述的一种冬枣多糖的提取方法，其特征在于，所述的步骤（3）中，微波提取的时间为60s。

8.如权利要求1所述的一种冬枣多糖的提取方法，其特征在于，所述的步骤（2）后，将切碎的枣肉加入水，再加入复合酶酶解，所述的复合酶酶解的条件为：加入占红枣果肉重1%的果胶酶酶解，调节溶液pH值为7，40℃下提取2小时；

再加入酸性蛋白酶和淀粉酶，所述的酸性蛋白酶和淀粉酶与果胶酶的重量比例如下：酸性蛋白酶、果胶酶、淀粉酶=95：3：2，酶解pH为4.2，酶解温度为40℃，酶解时间为2小时；95℃下灭酶5min。

9.如权利要求1所述的一种冬枣多糖的提取方法，其特征在于，所述的步骤（2）后，将切碎的枣肉加入水，再加入复合酶酶解，加入果胶酶、酸性蛋白酶和淀粉酶，所述的复合酶的重量比例如下：酸性蛋白酶、果胶酶、淀粉酶=95：3：2，酶解pH为4.2，酶解温度为40℃，酶解时间为2小时；95℃下灭酶5min。

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