CN107540755A - 一种西山焦枣多糖提取工艺 - Google Patents
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Abstract
一种西山焦枣多糖提取工艺，属于农产品深加工技术领域；本发明主要提供一种西山焦枣多糖提取工艺，所提取的西山焦枣多糖提取率高、还具有良好的抗氧化性能；包括以下步骤：热水浸提、乙醇沉淀、脱蛋白质、透析除杂和二次乙醇沉淀，在热水浸提过程中采用超声波辅助浸提，不仅能缩短浸提时间，更能保持西山焦枣多糖的抗氧化性能，具有潜在的抗癌保健功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种农产品深加工技术领域，具体涉及一种西山焦枣多糖提取工艺。
背景技术
西山焦枣为鼠李科枣属植物的成熟果实，是安徽省池州市贵池区特产，生长在高海拔的皖南山区，清甜脆嫩，皮薄核小，肉质细腻，含有较多糖类、脂肪、蛋白质、熊果酸、胡萝卜素、维生素C、B族维生素、维生素P以及钙、铁、磷和环磷酸腺苷等营养成分，具有益阳补血，调理生机，养心定神，防止动脉血管硬化等功效，其中枣多糖是生物活性多糖的一种，研究表明多糖及其复合物对癌症、免疫紊乱、糖尿病、肝损伤、高血压、脑血栓等有显著的疗效，因此作为绿色膳食保健产品成分，具有广阔的市场前景。1983年，日本学者友田正司等用柱层析的方法，分离得到活性多糖，并对其分子组成结构进行了研究。由于红枣是我国的特色果品，国外学者研究较少，对其很多营养功能性质了解较少，国内对枣多糖的研究起始于1998年，林勤保等分离纯化得到中性多糖和酸性多糖并对其组分进行分离研究，随之国内学者开始对红枣多糖进行研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种西山焦枣多糖提取工艺，所提取西山焦枣多糖提取率高且具有较高的抗氧化性能。
本发明所采取的技术方案是：
一种西山焦枣多糖提取工艺，包括如下步骤：
（1）热水浸提：将西山焦枣去核后研至粉末，准确称量1重量份的西山焦枣粉末放入25～35重量份水中，水温70～90℃，并用超声波振荡器辅助提取，保持超声波功率在70～90W，提取20～30min，提取1次，抽滤得到提取液；
（2）乙醇沉淀：将步骤（1）中的提取液浓缩50%，浓缩液与乙醇以体积比1:4混合进行沉淀，静置2 h，待沉淀析出，离心分离，将沉淀物烘干，得粗多糖；
（3）脱蛋白质：称量步骤（2）中的粗多糖样品2～3g加水溶解至100 mL，加入氯仿-异戊醇溶液25 mL，其中氯仿与异戊醇的体积比为4:1，放置于萃取装置之中进行充分震荡，获取上层清夜，反复进行3次萃取；
（4）透析除杂：将脱蛋白后的多糖溶液装进透析袋里面并放进盛有蒸馏水的大容器内，放于搅拌器上透析2～3天；
（5）二次乙醇沉淀：将步骤（4）中的透析后的多糖溶液与乙醇以体积比1:4混合进行沉淀，静置2 h，待沉淀析出，离心分离，将沉淀物烘干，得西山焦枣多糖。
进一步地，所述步骤（1）中的浸提用水为30重量份，水温80℃，超声波功率在80W。
本发明的有益效果是：本发明所述的一种西山焦枣多糖提取工艺，不仅提取的产率高，所提取出的多糖其抗氧化性能好，具有优良的抗癌潜质。
附图说明
图1为葡萄糖标准曲线图；
图2为超声功率与提取率的关系曲线图；
图3为浸提时间对提取率的影响曲线图；
图4为液料比对提取率的影响曲线图；
图5为温度对提取率的影响曲线图；
图6为提取次数对提取率的影响曲线图；
图7为西山焦枣多糖的红外光谱图；
图8为多糖·OH对的清除效果(n=3)曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。
实施例1
一种西山焦枣多糖提取工艺，包括如下步骤：
（1）热水浸提：将西山焦枣去核后研至粉末，准确称量1重量份的西山焦枣粉末放入25重量份水中，水温70℃，并用超声波振荡器辅助提取，保持超声波功率在70W，提取20min，提取1次，抽滤得到提取液；
（2）乙醇沉淀：将步骤（1）中的提取液浓缩50%，浓缩液与乙醇以体积比1:4混合进行沉淀，静置2 h，待沉淀析出，离心分离，将沉淀物烘干，得粗多糖；
（3）脱蛋白质：称量步骤（2）中的粗多糖样品2g加水溶解至100 mL，加入氯仿-异戊醇溶液25 mL，其中氯仿与异戊醇的体积比为4:1，放置于萃取装置之中进行充分震荡，获取上层清夜，反复进行3次萃取；
（4）透析除杂：将脱蛋白后的多糖溶液装进透析袋里面并放进盛有蒸馏水的大容器内，放于搅拌器上透析2天；
（5）二次乙醇沉淀：将步骤（4）中的透析后的多糖溶液与乙醇以体积比1:4混合进行沉淀，静置2 h，待沉淀析出，离心分离，将沉淀物烘干，得西山焦枣多糖。
实施例2
一种西山焦枣多糖提取工艺，包括如下步骤：
（1）热水浸提：将西山焦枣去核后研至粉末，准确称量1重量份的西山焦枣粉末放入35重量份水中，水温90℃，并用超声波振荡器辅助提取，保持超声波功率在90W，提取30min，提取1次，抽滤得到提取液；
（2）乙醇沉淀：将步骤（1）中的提取液浓缩50%，浓缩液与乙醇以体积比1:4混合进行沉淀，静置2 h，待沉淀析出，离心分离，将沉淀物烘干，得粗多糖；
（3）脱蛋白质：称量步骤（2）中的粗多糖样品3g加水溶解至100 mL，加入氯仿-异戊醇溶液25 mL，其中氯仿与异戊醇的体积比为4:1，放置于萃取装置之中进行充分震荡，获取上层清夜，反复进行3次萃取；
（4）透析除杂：将脱蛋白后的多糖溶液装进透析袋里面并放进盛有蒸馏水的大容器内，放于搅拌器上透析3天；
（5）二次乙醇沉淀：将步骤（4）中的透析后的多糖溶液与乙醇以体积比1:4混合进行沉淀，静置2 h，待沉淀析出，离心分离，将沉淀物烘干，得西山焦枣多糖。
实施例3
一种西山焦枣多糖提取工艺，包括如下步骤：
（1）热水浸提：将西山焦枣去核后研至粉末，准确称量1重量份的西山焦枣粉末放入30重量份水中，水温80℃，并用超声波振荡器辅助提取，保持超声波功率在80W，提取25min，提取1次，抽滤得到提取液；
（2）乙醇沉淀：将步骤（1）中的提取液浓缩50%，浓缩液与乙醇以体积比1:4混合进行沉淀，静置2 h，待沉淀析出，离心分离，将沉淀物烘干，得粗多糖；
（3）脱蛋白质：称量步骤（2）中的粗多糖样品2.5g加水溶解至100 mL，加入氯仿-异戊醇溶液25 mL，其中氯仿与异戊醇的体积比为4:1，放置于萃取装置之中进行充分震荡，获取上层清夜，反复进行3次萃取；
（4）透析除杂：将脱蛋白后的多糖溶液装进透析袋里面并放进盛有蒸馏水的大容器内，放于搅拌器上透析2天；
（5）二次乙醇沉淀：将步骤（4）中的透析后的多糖溶液与乙醇以体积比1:4混合进行沉淀，静置2 h，待沉淀析出，离心分离，将沉淀物烘干，得西山焦枣多糖。
实施例4 西山焦枣多糖纯度测定实验
本实验利用苯酚-硫酸法来测定焦枣多糖的浓度，其原理为多糖类的成分在硫酸作用下，水解成单糖，脱水形成糖醛衍生物，和苯酚缩合成有色化合物，采用分光光度法，在最大吸收波长490 nm处，对照标准曲线，计算出多糖的浓度；提取液中含有较多的单糖或双糖，影响结果，因此本实验采用提取液浓缩醇沉再溶解的方法，具体方法如下：
4.1葡萄糖标准曲线：以葡萄糖为样标，精确称取干燥恒重的葡萄糖25.0 mg，定容至250 mL，配制成100 mg/L的葡萄糖溶液。取蒸馏水2 mL为空白对照，取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL葡萄糖在比色管中加水至2.0 mL，加入15%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加进5.0mL浓硫酸，摇匀，静置10 min，置于沸水浴中加热15 min，取出用自来水冷却至室温，用蒸馏水的反应液作空白对照，以最大吸收波长490 nm处测定吸光度A值，以A490作为纵坐标，以葡萄糖的浓度为横坐标作标准曲线。
依据分光光度法在波长490 nm处测定吸光度A490，绘制出标准曲线，如图1所示，得回归方程为：A=0.0126C-0.0517，R=0.9867；
A为吸光度；C为浓度（mg/L）；R为线性相关系数；
多糖的提取率计算公式：
提取率（%）﹦（C×稀释倍数×V×10-6）/m×100%；
式中：C为分光光度计间接测定的焦枣多糖的浓度，单位：mg/L；
V为提取液体积，单位：mL；
m为样品质量，单位：g；
4.2 超声波功率对提取率的影响
由图2所示，设定温度为80℃，提取时间为25min，料液比为30:1时，伴随着超声波功率的增加，焦枣多糖提取率也将渐渐增大，当超声波功率大于80 W之后，提取率增加相对较少。当功率超过90后提取率反而有所降低，可能原因为超声功率提高时，水分子运动加速，能量传递被加强、扩散，可溶性物质溶解速度加快，功率过大时超声波产生的强烈机械波引起细胞内部各种物质结构的变化，使枣多糖部分多糖降解。
4.31浸提时间对提取率的影响
如图3，设定温度为80℃，提取功率为90W，料液比为30:1时，焦枣多糖提取率随着浸提时间的增加而逐渐增加，当提取时间超过25min后，提取率增加不甚明显，这说明提取25min后，溶液中的多糖与焦枣中多糖浓度差变小，基本达到平衡状态，继续提取耗能、耗时间，因此浸提时间应选在25min左右适宜。
4.4 料液比对提取率的影响
如图4，设定温度为80℃，提取功率为90W，提取时间为25min时，伴随着液料比的增加，多糖的提取率也会渐渐增加，但当液料比到达1:30后，多糖的提取率的增加就变得迟缓。而容积体积的增加会延长浓缩时间，生产成本增加，所以液料比选择在1:30左右较好。
4.5 温度对提取率的影响
设定提取功率为90W，液料比为30:1，提取时间为25min，由图5可知，伴随温度的升高，多糖的提取率渐渐升高，表明温度较低不利于多糖的提取，大多数植物多糖不易溶解于冷水中易溶于热水，有利于多糖的浸出。但由于温度过高，如在80 ℃左右时，焦枣提取液的粘度变得过大，这也许应该会有两个原因：一是焦枣细胞在高温下会处于“崩溃”、溶解的状况；也有可能破坏有效成分，使多糖降解以及降低多糖活性，而导致提取率降低，而且温度太高，还会导致蛋白质等杂质的浸提出的量增加，应当选在70 ℃~90 ℃之间为宜，这样使后续处理更简单。
4.6 提取次数对提取率的影响
由图6可知，多糖一次提取率5.36%，随着提取次数增加，多糖提取率增大并不明显，5次提取合并提取率为5.67%，考虑到多次提取能耗较高，因此建议采用一次提取法。
4.7 焦枣多糖的正交实验
在单因素实验的基础之下，对多糖的提取工艺，利用正交试验设计进行了分析和优化。热水浸提法的单因素实验对条件选择具有针对性，缩短了实验的时间，摒除了水平数选择的盲目性。正交实验使用的是三水平四因素的正交表L9(34)。
表1 水平因素
| 水平 | 料液比A（g /mL） | 时间B（min） | 温度C（℃） | 提取功率D(W) |
| 1 | 1:25 | 20 | 80 | 80 |
| 2 | 1:30 | 25 | 90 | 90 |
| 3 | 1:35 | 30 | 100 | 100 |
正交实验结果及结果分析
表2 正交实验结果
| 编号 | A | B | C | D | 提取率（%） |
| 1 | 1.25 | 20 | 80 | 80 | 4.21 |
| 2 | 1.25 | 25 | 90 | 90 | 5.43 |
| 3 | 1.25 | 30 | 100 | 100 | 5.49 |
| 4 | 1.30 | 20 | 90 | 100 | 5.38 |
| 5 | 1.30 | 25 | 100 | 80 | 5.17 |
| 6 | 1.30 | 30 | 80 | 90 | 4.87 |
| 7 | 1.35 | 20 | 100 | 90 | 5.02 |
| 8 | 1.35 | 25 | 80 | 100 | 5.26 |
| 9 | 1.35 | 30 | 90 | 80 | 5.41 |
| Ⅰj | 5.04 | 4.87 | 4.78 | 4.93 | |
| Ⅱj | 5.14 | 5.29 | 5.40 | 5.38 | |
| Ⅲj | 5.23 | 5.26 | 5.23 | 5.11 | |
| 极差（Dj） | 0.19 | 0.42 | 0.62 | 0.45 | |
| 主次顺序 | 4 | 3 | 1 | 2 |
注：
Ⅰj ———第j列“1”水平所对应的试验指标的平均值；
Ⅱj———第j列“2”水平所对应的试验指标的平均值；
Ⅲj———第j列“3”水平所对应的试验指标的平均值；
极差（Dj）-—第j的极差；
按正交试验设计，共进行9次提取，每次平行三次，结果如表2所示：各个因素影响多糖提取率的排列顺序为：因素C>因素D>因素B>因素A，最佳的提取条件是：C2D3B2A3，也就是温度90 ℃，超声功率90w，浸提时间25min，料液比1:30，枣多糖的产率可达到5.58%。
实施例5 西山焦枣多糖的表征
图7为在500—4000 cm-1范围内进行的IR扫描图谱，图谱是具有糖类的特征吸收峰；在3200~3700 cm-1范围处出现一个较宽的峰，这是糖分子内部或分子之间氢键O-H伸缩振动引起的结果；2930 cm-1处的吸收是次甲基（-CH2）中的C-H伸缩振动引起的；1630 cm-1处的吸收峰应为-CHO的C=O伸缩振动引起，而1380 cm-1处的峰很尖锐，属于C-H变角振动，它与C-H处的吸收伸缩振动一同构成了糖类的特征吸收峰。1110 cm-1处的吸收峰是糖环的特征吸收峰，是由多糖中的C-O糖苷键振动吸收引起的。此谱图表明实验所得物质是焦枣多糖。
实施例6 焦枣活性多糖对羟基自由基（·OH）的清除作用
原理：建立Fenton体系。以EDTA Na2-Fe2+与H2O2反应，反应生成羟基自由基（·OH），后者可氧细胞内的脱氧核糖，损害细胞新陈代谢，产生有色物质，分光光度计在532nm处有强吸收峰。当有生物活性分子存在时，可延缓脱氧核糖的氧化，有色物质生成量少；从而根据吸光度的大小，计算其半抑制浓度（IC50），以判断活性物质清除羟基自由基（·OH）的能力。
方法：配制不同浓度的Coixan 标品、焦枣多糖样液，各取0.1mL于试管中，加入0.2mL EDTA Na2-Fe2+溶液(1mmol/L)和0.5 mL的2-脱氧核糖溶液(1mmol/L)，用磷酸缓冲液(pH为7.4，浓度为0.1mmol/L)定容为 1.8mL ，再加入0.2 mL H2O2(10mmol/L)，在温度为37℃，恒温水浴中振荡反应30min后，先后加质量分数为2.8%(w/w) 三氯乙酸溶液1.0mL，质量分数为 1.0%(w/w)硫代巴比妥(TBA)溶液1.0mL，充分混合均匀后，沸水浴15min后，冷却室温为，测定吸光值As。另外空白，同上处理，不加样液，测定532nm处测定吸光值Ae; 测定吸光值AO，最终清除羟基自由基（·OH）的能力SA(%)计算式为:
SA(%)=[1-(As-AO)/(Ae-AO)]×100
Fenton反应是模拟生物体内产生羟基自由基（·OH）的反应。羟基自由基（·OH）是活性氧中反应活性较高的自由基，对生物体有较大的危害，它可攻击细胞膜导致损伤，或者破坏DNA，诱导DNA复制错误，引起细胞突变和死亡，从而导致机体衰老、癌症和其它疾病。
如图8所示，本实验对比了在超声条件下和无超声条件下提取的西山焦枣活性多糖对羟基自由基（·OH）清除能力，根据试验结果可知，对Fenton体系所产生的羟基自由基（·OH），西山焦枣多糖具有良好的清除的能力，而且在试验浓度范围内，超声提取的焦枣多糖和热水提取的焦枣多糖均呈现明显递增。其中超声提取的西山焦枣多糖对羟基自由基（·OH）的清除能力优于普通热水水提法提取的西山焦枣多糖，二者消除羟基自由基（·OH）的IC50分别为0.48g/L与0.57g/L，差异显著(p<0.05)；而当其浓度达到0.50g/L时，超声提取的焦枣多糖对羟基自由基（·OH）的清除能力是无超声提取的焦枣多糖的1.31倍，可能原因是普通热水提取需要3 h左右，超声提取方法极大的缩短提取时间，只需要0.5h，避免了多糖长时间处于高温环境，使多糖生物活性得到较大的保留。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (2)
1.一种西山焦枣多糖提取工艺，其特征在于，包括如下步骤：
（1）热水浸提：将西山焦枣去核后研至粉末，准确称量1重量份的西山焦枣粉末放入25～35重量份水中，水温70～90℃，并用超声波振荡器辅助提取，保持超声波功率在70～90W，提取20～30min，提取1次，抽滤得到提取液；
（2）乙醇沉淀：将步骤（1）中的提取液浓缩50%，浓缩液与乙醇以体积比1:4混合进行沉淀，静置2 h，待沉淀析出，离心分离，将沉淀物烘干，得粗多糖；
（3）脱蛋白质：称量步骤（2）中的粗多糖样品2～3g加水溶解至100 mL，加入氯仿-异戊醇溶液25 mL， 其中氯仿与异戊醇的体积比为4:1，放置于萃取装置之中进行充分震荡，获取上层清夜，反复进行3次萃取；
（4）透析除杂：将脱蛋白后的多糖溶液装进透析袋里面并放进盛有蒸馏水的大容器内，放于搅拌器上透析2～3天；
（5）二次乙醇沉淀：将步骤（4）中的透析后的多糖溶液与乙醇以体积比1:4混合进行沉淀，静置2 h，待沉淀析出，离心分离，将沉淀物烘干，得西山焦枣多糖。
2.如权利要求1所述的一种西山焦枣多糖提取工艺，其特征在于，所述步骤（1）中的浸提用水为30重量份，水温80℃，超声波功率在80W。
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