CN103113489A - 一种新疆骏枣多糖提纯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新疆骏枣多糖提纯的方法。本发明以去核粉碎的新疆骏枣为原料，将枣粉加水后加入1%（W/V）生物复合酶，在58-63℃，pH值6的条件下酶解56-66min，经离心、浓缩、静置和动态洗涤后，将所得粗多糖加水溶解上聚酰胺柱，聚酰胺用量为枣粗多糖的4倍，用1倍柱体积的去离子水以1.5mL/min的流速进行洗脱，然后再次浓缩、洗涤、干燥后得脱色的精多糖。该方法广泛应用于新疆骏枣多糖的提纯领域，具有广泛的应用价值。

Description

一种新疆骏枣多糖提纯的方法

技术领域

本发明涉及提纯枣中多糖技术领域，具体的说，本发明涉及一种新疆骏枣多糖提纯的技术领域。

背景技术

大枣(Zizyphus Jujuba Mill)又名中华火枣、华枣，为鼠李科植物枣的成熟果实。枣树原产我国，栽培历史悠久，距今已有3000年的历史，与桃、李、栗、杏并称为我同古代五果。《史记·货殖传》记载“安邑干树枣，燕秦千树桑，蜀汉江陵千树桔，其人与千户候。”，《战国策》中记有“北有枣粟之实，民虽不由田作，枣、粟之实，足食于民矣。”等。此外，《齐民要术》、《本草纲目》等古书中均有关于红枣的记载。元代柳贯的《打枣谱》是我国第一部关于红枣的专著，记载了73个红枣品种的形状和产地。大枣的药用始载于《神农本草经》，列为卜品，为中医临床常用补益药，昧甘、性温，归脾、胃经，具有补中益气，养血安神之功，是同家公布的药食同源之品，古今均将其作为健脾专药，益气养血佳品。《神农本草经》、《证类本草》、《本草纲同》等古代代表本草中多有阐述。

我国是世界上唯一拥有大面积栽培的优良枣树品种的国家。据中国农业年鉴统计资料，目前全国枣树栽种面积约67万公顷(1000万亩)，红枣年总产量约10亿公斤，占世界总产量的90％以上。枣树在我国分布极广，北起内蒙，南至两广，西至新疆，东到沿海各省。

新疆骏枣：产自世界水果优生区新疆，亘古代无污染沙化土壤，日照长，辐射强，积温高，温差大，每天15小时的充足日照，昼夜20多度的温差.全年长达220天的无霜期，昆山终年冰川雪水的灌溉，得天独厚的自然条件适合大枣等果树的生长。也造就了骏枣的卓越品质，相对于同类产品，其果形大、皮薄、肉厚、口感甘甜醇厚、其维生素C、蛋白质、矿物质含量均高于同类产品、被誉为“中华第一枣”它初夏开花，九月果熟，树上宛如挂红玛瑙，流芳溢香，光彩夺目。一个个红艳艳，光亮亮，大者如核桃，群众称它为“红宝石”。据清代文献记载“枣大疑仙种”。古语有"一日吃三枣,终生不显老"的说法,好处实在多多.心动不如行动哟！由于日照时间比较长，昼夜温差大，所以产出的大枣个头大、味甘甜。《本草纲目》载：“大枣味甘平无毒，主治心腹邪气，安中，养脾气，平胃气，通九窍，助十二经，补少气，和百药，久服轻身延年。”枣能调补中焦健脾益气、养血安神、缓和药性，李时珍引《日华子本草》曰“补五脏，治虚损”。《随居园饮食谱》中载红枣“鲜者甘凉。刮肠胃，助湿热。干者甘温补脾养胃，滋营充液，润肺，食之耐饥。以北产大而坚实肉厚者，补力最胜。

多糖亦称为多聚糖(polysaccharide)，是由十个以上的单糖通过糖苷键连接而成，通常由上百乃至几千个单糖基组成的高分子化合物，其性质与单糖有较大差别。多糖作为药物始于1943年，自上世纪六十年代以来，多糖作为广谱免疫促进剂引起了人们的极大兴趣，有关研究日益增多。随着研究的深入，科学家们惊奇地发现多糖及其缀合物对多种危害人类健康的疾病，如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝炎、血栓等有显著的疗效，其中最引人注目的是它们的免疫修饰和抗肿瘤活性。目前，灵芝、茯苓和香菇多糖注射液被广泛用十临床，以治疗各种肿痛、提高免疫功能。然而，多精的抗肿瘤机理孥今尚未弄清楚。冈此，多糖的研究与开发口益引人注目。

从已有的研究文献来看，大枣的药理作用与其含量较高的多糖类成分密不可分，多数药理探究报道本身就是大枣多糖的作用。归纳提取分离人枣多糖的过程一般分为两步：首先从粉碎后的大枣中提取含多糖粗品；其次从粗提取物中分离纯化多糖。

从人枣中提取多糖的工艺步骤包括：破碎、浸提、沉淀、干燥等。其中浸提是影响产品得率的主要环节。目前采用的浸提方法主要有：中性热水长时间浸提法；酸碱浸提法；酶法浸提：微波辅助浸提法；超声波辅助浸提法；空气压力浸提法。采用辅助浸提法均是破坏植物细胞结构，从而保持有效成分的吲有结构和活性，提高多糖提取率。沉淀多糖的方法主要是有机溶剂法，最常用的溶剂是乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮等。其中，乙醇、异丙醇是FDA认可的适合食品级多糖提取的最佳沉淀剂。原理是根据多糖是多羟基的醛或酮，乙醇的加入破坏多糖水溶液中的氢键，从而降低多糖的溶解度，使多糖从提取液中沉淀出来。

大枣多糖是大枣中重要的生物活性物质，可作为免疫促进剂，能控制细胞的分裂和分化，调节细胞的生长和衰老，具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用，对提高机体免疫力具有重要作用。大枣多糖易溶于水，不溶于高浓度的有机溶剂，高温易失去活性，过酸或偏碱都会使多糖发生部分降解。杨世平等人研究发现，大枣多糖提取最佳工艺条件为温度90℃、料水比l：15。吴娜等人研究表明，大枣多糖提取最佳工艺条件为时间6 h、料水比l：24、温度90℃。有关大枣多糖提取工艺的研究较多，但大多以大枣为原料直接提取，而以大枣为原料进行综合提取的研究较少。

目前，多糖提取的研究主要集中在传统热水提取，近年来出现了超声、微波新型辅助提取技术的研究，未见报道有生物复合酶解技术提取骏枣多糖；多糖纯化的研究主要集中在柱层析技术的研究，包括离子交换柱层析和凝胶柱层析法，采用聚酰胺柱层析技术纯化枣多糖未见报道。这种高效提纯骏枣多糖的方法具有得率和纯度高等多种优越性，开发一种效率高、成本低的新提取方法具有重要意义。

发明内容

针对目前国内外针对骏枣未见采用生物复合酶解技术和采用聚酰胺柱层析技术提取纯化功能性多糖的现状。本发明旨在提供一种新疆骏枣多糖提纯的方法，通过采用生物复合酶解技术提取，并采用聚酰胺柱层析技术纯化骏枣多糖的方法，不仅解决了目前提取方法提取率低、产品生物活性低等问题，还为枣加工企业提升技术水平提供了切实可行的方法。

本发明通过以下技术方案实现：

通过将骏枣去核粉碎，加水后加入1%（W/V）生物复合酶，在58-63℃，pH为6的条件下酶解56-66 min，离心，浓缩，静置和动态洗涤，得粗多糖，随后上聚酰胺柱，聚酰胺用量为枣粗多糖的4倍，用1倍柱体积的去离子水以1.5 mL/min的流速进行洗脱，然后再次浓缩、洗涤、冷冻干燥，得到脱色的精多糖。

本发明提供一种新疆骏枣多糖提纯的方法，制备方法如下：

（1）把去核粉碎的骏枣加水后加入生物复合酶进行酶解；

（2）酶解结束后离心，将上清液真空浓缩，工业酒精调至含醇量为80%，静置过夜，离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤，得粗多糖；

（3）取粗多糖加水溶解上聚酰胺柱，用水洗脱，收集流出液；

（4）经洗涤沉淀，冷冻干燥后得脱色的精多糖。

进一步，本发明详细提供了新疆骏枣多糖提纯的方法，具体制备方法步骤如下：

（1）前处理：将骏枣去核、粉碎，制得枣粉。

（2）酶解：将枣粉加水后添加1%（W/V）生物复合酶，在58-63℃，pH值6的条件下酶解56-66 min，其中，按重量比计，生物复合酶按照干果专用酶:蛋白酶为 1:1。

（3）浓缩：酶解结束后离心，合并上清液，之后将上清液进行真空浓缩。

（4）洗涤：将上述步骤（3）获得浓缩产物用工业酒精调至含醇量为80%，静置过夜，离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤各洗三次。

（5）洗脱：取上述步骤（4）获得提取的粗多糖加5倍体积的水溶解，上聚酰胺柱，按体积比计，采用的聚酰胺用量为酶解后提取的粗多糖的4倍，用1倍柱体积的去离子水以1.5 mL/min的流速进行洗脱。

（6）干燥：将上述步骤（5）获得提取的粗多糖经洗脱沉淀进行冷冻干燥。

同时，本发明提供经过上述制备方法制备获得的骏枣多糖粉。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：

通过本发明提供的方法，利用生物复合酶解提取技术提纯的枣多糖得率为9.3%，纯度为38.65%，较传统水浴浸提技术的得率6.52%，纯度29.49%有明显的提高。

附图说明

图1显示为标准单糖乙酰化的气相色谱图。

图2显示为传统水浴提取多糖乙酰化的气相色谱图。

图3显示为生物复合酶解提取多糖乙酰化的气相色谱图。

图4显示为采用生物复合酶解提取的粗多糖DEAE-SepharoseCL-6B柱层析洗脱曲线图，图中粗多糖DEAE-SepharoseCL-6B按4.5 cm×35 cm。   

图5显示为传统水浴浸提法提取的粗多糖DEAE-SepharoseCL-6B柱层析洗脱曲线图，图中粗多糖DEAE-SepharoseCL-6B按4.5 cm×35 cm。

图6显示为红外光谱对比图，图中，a生物复合酶解提取法b传统水浴浸提法。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指质量百分比，即按m/m计。

仪器设备：循环水式真空泵（SHB-Ⅲ）,郑州长城科工贸公司;粉碎机(Jfsd-70),上海市嘉定粮油检验仪器厂;旋转蒸发仪(RE－52AA),上海亚荣生化仪器公司;79－2型磁力加热搅拌器，金坛市金城国胜实验仪器厂;强力电动搅拌机（JB90-D型）,上海标本模型厂制造;真空干燥箱（DZF-6050）,上海一恒科技有限公司;电子分析天平（AL104）,METTLER TOLEDO;酶反应器,无锡玻璃仪器厂;冷冻干燥仪(FD-1c-50),北京博医康实验仪器有限公司;离心机(TDL-5-A),上海安亭科学仪器厂;水浴锅(HH-S),巩义市英峪予华仪器厂;旋转蒸发仪(RE－52AA),上海亚荣生化仪器厂;紫外-可见分光光度计(Spectrumlab53),上海棱光技术有限公司。

试剂采用：骏枣、干果专用酶（诺维信公司提供）、蛋白酶（酶活力为72635U/g，无锡酶制剂厂），骏枣原料和干果专用酶、蛋白酶都为常用，本领域熟知通过市场购买获得。

本发明中选用的所有试剂、仪器、原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：新疆骏枣多糖提纯的方法

新疆骏枣多糖提纯的方法，具体制备方法步骤如下。

（1）前处理：将骏枣去核、粉碎，制得枣粉。

（2）酶解：将枣粉加水后添加1%（W/V）生物复合酶，在58-63℃，pH值6的条件下酶解56-66 min，其中，按重量比计，生物复合酶按照干果专用酶:蛋白酶为 1:1。

（3）浓缩：酶解结束后离心，合并上清液，之后将上清液进行真空浓缩。

（4）洗涤：将上述步骤（3）获得浓缩产物用工业酒精调至含醇量为80%，静置过夜，离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤各洗三次。

（5）洗脱：取上述步骤（4）获得提取的粗多糖加5倍体积的水溶解，上聚酰胺柱，按体积比计，采用的聚酰胺用量为酶解后提取的粗多糖的4倍，用1倍柱体积的去离子水以1.5 mL/min的流速进行洗脱。

（6）干燥：将上述步骤（5）获得提取的粗多糖经洗脱沉淀进行冷冻干燥。

通过上述工艺利用生物复合酶解提取技术提纯的枣多糖得率为9.3%，纯度为38.65%，较传统水浴浸提技术的得率6.52%，纯度29.49%有明显的提高。

实施例二：骏枣多糖提取中采用生物复合酶解工艺的确定与优化

选择酶解温度、酶解时间、pH值和加酶量作为自变量，以多糖得率、纯度作为试验指标进行分析。采用SAS分析软件进行数据的处理、回归方程的推导以及三维曲面的生成，从中揭示各影响因素与得率、纯度之间的内在规律性，并找出各因素的最优区域。具体实验过程获得参数分析见以下表1、2、3、4、5、6、7和表8.

表1：生物复合酶解提取枣多糖工艺条件各因素的零水平及变化

表2：生物复合酶解提取枣多糖工艺条件的因素编码值

表3：各影响因素对枣粗多糖得率、纯度影响的响应面分析验结果

Number a	X1	X2	X3	X4	Yield	Purity
							1	-1	-1	-1	-1	7.12	16.72
2	-1	-1	-1	1	7.98	19.74
							3	-1	-1	1	-1	6.68	15.83
4	-1	-1	1	1	7.76	24.75
							5	-1	1	-1	-1	10.33	38.42
6	-1	1	-1	1	10.57	30.64
							7	-1	1	1	-1	10.92	28.59
8	-1	1	1	1	10.75	23.72
							9	1	-1	-1	-1	9.87	19.73
10	1	-1	-1	1	9.92	20.85
							11	1	-1	1	-1	10.34	16.54
12	1	-1	1	1	10.56	17.93
							13	1	1	-1	-1	8.23	32.42
14	1	1	-1	1	8.51	28.43
							15	1	1	1	-1	7.87	26.55
16	1	1	1	1	8.97	21.82
							17	-2	0	0	0	8.02	26.73
18	2	0	0	0	9.35	12.56
							19	0	-2	0	0	8.13	18.31
20	0	2	0	0	9.52	21.44
							21	0	0	-2	0	8.44	27.01
22	0	0	2	0	9.86	19.12
							23	0	0	0	-2	8.79	22.34
24	0	0	0	2	9.05	30.07
							25	0	0	0	0	9.62	38.52
26	0	0	0	0	9.15	38.34
							27	0	0	0	0	9.24	38.96
28	0	0	0	0	8.87	39.45
							29	0	0	0	0	8.95	39.00
30	0	0	0	0	9.44	38.33
							31	0	0	0	0	9.86	37.95

表4：回归系数取值

系数	Y1 (得率)	Y2 (纯度)
			b0	9.304286	38.65
b1	0.200833	- 1.77
			b2	0.3625	3.531667
b3	0.173333	- 1.958333
			b4	0.174167	0.355833
b11	- 0.11253	- 4.464583
			b22	- 0.07753	-4.407083
b33	0.00372	-3.609583
			b44	- 0.05378	-2.824583
b12	- 1.25875	-0.635
			b13	0.06875	-0.3725
b14	- 0.0225	-0.34375
			b23	0.02625	-1.7025
b24	- 0.0475	-2.23875
			b34	0.05	0.52125

表5：枣多糖得率的方差分析结果

变异来源	自由度	平方和	均方	F	Pr>F
						模型	14	31.63469	2.259621	12.13737	0.0001
误差项	16	2.97873	0.186171
						总和	30	34.61342

表6：枣多糖纯度的方差分析结果

变异来源	自由度	平方和	均方	F	Pr>F
						模型	14	1938.12	138.4371	10.72663	0.0001
误差项	16	206.4948	12.90593
						总和	30	2144.615

表7：枣多糖得率模型中参数的t检验结果

参数	估计值	标准误差	t	Pr > |t|
					X1	0.2008333	0.088074	2.280268	0.036638
X2	0.3625	0.088074	4.115836	0.000809
					X3	0.1733333	0.088074	1.968032	0.066644
X4	0.1741667	0.088074	1.977494	0.065476
					X1*X1	-0.11253	0.080687	-1.39464	0.182187
X1*X2	-1.25875	0.107869	-11.6693	0.0001
					X1*X3	0.06875	0.107869	0.637349	0.532913
X1*X4	-0.0225	0.107869	-0.20859	0.837403
					X2*X2	-0.07753	0.080687	-0.96087	0.350916
X2*X3	0.02625	0.107869	0.243351	0.810826
					X2*X4	-0.0475	0.107869	-0.44035	0.665575
X3*X3	0.0037202	0.080687	0.046107	0.963796
					X3*X4	0.05	0.107869	0.463526	0.64923
X4*X4	-0.05378	0.080687	-0.66652	0.514575

表8：枣多糖纯度模型中参数的t检验结果

参数	估计值	标准误差	t	Pr > |t|
					X1	-1.77	0.733312	-2.41371	0.028141
X2	3.5316667	0.733312	4.816047	0.00019
					X3	-1.958333	0.733312	-2.67053	0.016752
X4	0.3558333	0.733312	0.485241	0.634082
					X1*X1	-4.464583	0.671806	-6.64564	0.0001
X1*X2	-0.635	0.89812	-0.70703	0.489717
					X1*X3	-0.3725	0.89812	-0.41476	0.683829
X1*X4	-0.34375	0.89812	-0.38274	0.706947
					X2*X2	-4.407083	0.671806	-6.56005	0.0001
X2*X3	-1.7025	0.89812	-1.89563	0.076221
					X2*X4	-2.23875	0.89812	-2.49271	0.024024
X3*X3	-3.609583	0.671806	-5.37295	0.0001
					X3*X4	0.52125	0.89812	0.580379	0.569744
X4*X4	-2.824583	0.671806	-4.20446	0.000672

通过上述实验得知，参见上述表1至8可知：枣多糖最佳的工艺条件为，酶解温度58-63℃，酶解时间56-66 min，pH值6，加酶量1%。

实施例三：骏枣多糖提取中采用聚酰胺柱层析技术的确定与优化

枣粗多糖液分别用聚酰胺、粉末活性炭、颗粒活性炭、吸附树脂进行处理，通过实验分析如下：

表9：不同脱色剂对枣粗多糖脱色效果的影响

脱色剂	L值	a值	b值	糖的回收率（％）
					粉末活性炭	15.05±0.38c	48.39±0.64b	37.21±048b	38.06±0.85
颗粒活性炭	9.31±0.41d	58.62±0.94a	51.83±0.67a	66.54±0.72
					吸附树脂	21.46±0.55b	39.41±0.73c	28.24±0.31c	72.03±0.64
聚酰胺	22.11±0.48b	37.01±0.71d	25.91±0.32d	89.35±1.22

注：该表内数据为平均值±标准偏差（n=3），表中同一列内不同的字母表示具有显著性差异（p<0.05）

通过试验可知，参见表9：粉末活性炭和粗多糖溶液易形成粘稠胶状物质，不容易进行分离；颗粒活性炭对多糖溶液脱色作用不明显；且活性碳大量吸附多糖，造成多糖损失。虽然吸附树脂脱色效果较好，但多糖的回收率较低。聚酰胺脱色效果较好，多糖的回收率也较高，同时可去除粗多糖中的蛋白质和杂质；故本试验确定聚酰胺为枣粗多糖理想的脱色剂。

表10：聚酰胺用量对枣粗多糖脱色效果的影响

聚酰胺（g）	L值	a值	b值	糖的回收率（％）
					40	24.52±0.55a	36.49±0.68a	25.37±0.44a	92.05±1.01a
60	32.37±0.82b	30.89±0.47b	21.59±0.62b	87.55±0.78b
					80	39.98±0.37c	26.05±0.61c	18.36±0.51c	83.82±0.83c
100	40.81±0.72c	24.91±0.32c	17.54±0.47cd	78.54±0.62d
					120	41.03±0.46c	23.11±0.41d	16.94±0.33d	76.65±0.63e

注：该表内数据为平均值±标准偏差（n=3），表中同一列内不同的字母表示具有显著性差异（p<0.05）

通过试验可知，参见表10：随着聚酰胺用量的增加，其L值增大，a、b值减小；糖的回收率逐渐下降。Duncan新复极差统计分析表明：当聚酰胺用量超过80g，对L、b值并没有显著性的影响（P＞0.05），但糖的回收率却有显著性的差异(P＜0.05)。为了尽可能多地保留多糖，节约处理费用，确定聚酰胺用量为80g（粗多糖的4倍）。

表11：洗脱体积对枣粗多糖脱色效果的影响

洗脱体积/柱体积	L值	a值	b值	糖的回收率（％）
					0.5	40.65±0.71a	24.22±0.67a	17.95±0.42a	77.32±0.67a
1.0	39.98±0.37a	26.05±0.61b	18.36±0.51a	83.82±0.83b
					1.5	33.09±0.51b	29.55±0.83c	20.32±0.94b	85.31±0.36c
2.0	28.36±0.43c	32.14±045d	22.51±0.39c	89.21±0.51d
					2.5	25.91±0.65d	35.69±0.73e	24.97±0.66d	90.33±0.59e

注：该表内数据为平均值±标准偏差（n=3），表中同一列内不同的字母表示具有显著性差异（p<0.05）

通过试验可知，参见表11：随着洗脱体积的增加，其L值减小，a、b值增大；糖的回收率逐渐增加。Duncan新复极差统计分析表明：当洗脱体积小于1倍柱体积时，对L、b值并没有显著性的影响（P＞0.05），但糖的回收率却有显著性的差异（P＜0.05）。故选择1倍柱体积的去离子水进行洗脱。枣粗多糖中所含的色素一般为酚类、羟基蒽醌衍生物等，可以被聚酰胺色谱柱吸附，多糖虽然是一种具有多羟基结构的化合物，但由于多糖易于形成分子内氢键从而减弱了它与聚酰胺形成氢键的能力，枣粗多糖中所含的色素与聚酰胺结合的能力较其与多糖结合的能力大，因此色素被聚酰胺吸附，从而与多糖分离。同时，当用去离子水进行洗脱时，聚酰胺作为非极性固定相，极性较大的多糖先被洗脱下来，而极性相对多糖较弱的酚类、羟基蒽醌衍生物后被洗脱下来，从而达到脱除色素的目的。但洗脱体积大于1倍柱体积时，极性较强的部分色素也被洗脱下来，故其L值减小，a、b值增大。

表12：洗脱速度对枣粗多糖脱色效果的影响

洗脱速度(mL/min)	L值	a值	b值	糖的回收率（％）
					0.5	39.15±0.31a	26.54±0.37a	18.01±0.45a	85.04±0.78a
1.0	39.98±0.37a	26.05±0.61a	18.36±0.51a	83.82±0.83ab
					1.5	40.21±0.51ab	25.23±0.31a	18.22±0.37a	82.65±0.64b
2.0	40.93±0.45bc	24.89±0.31a	17.98±0.41a	76.51±0.73c
					2.5	41.54±0.47c	24.03±0.56a	17.88±0.32a	71.89±0.81d

注：该表内数据为平均值±标准偏差（n=3），表中同一列内不同的字母表示具有显著性差异（p<0.05）

通过试验可知，参见表12：洗脱速度对其L、a、b值的影响较小；但多糖的回收率随洗脱速度的增大而逐渐减小。Duncan新复极差统计分析表明：当洗脱速度小于1.5mL/min时，多糖的回收率没有显著性的差异(P>0.05)。洗脱速度越小，耗时越长，故选择洗脱速度1.5mL/min进行洗脱。

实施例四：新疆骏枣多糖提纯工艺参数的筛选和验证

本发明选用水浴浸提法、超声提取法、微波提取法和生物复合酶解法进行对新疆骏枣多糖进行提纯，具体工艺参数的筛选和验证如下：

表13：红枣多糖四种提取方法的比较

提取方法	得率/%	纯度/%
			水浴浸提法	6.52	29.49
超声提取法	8.11	35.41
			微波提取法	5.76	26.72
生物复合酶解	9.3	38.65

通过试验可知，参见表13：通过选择四种方法的最佳工艺参数进行红枣多糖的提取，证明利用生物复合酶解法的提取率最高，纯度也最高，所以选择生物复合酶解法进行红枣多糖的提取。

粗多糖中单糖组成分析：

采用糖腈乙酸酯衍生物气相色谱法测定生物复合酶解提取法和传统水浴浸提法所得粗多糖样品的单糖组成，标准单糖和粗多糖样品结果参见附图1、图2和图3得知，枣粗多糖的单糖组成主要有阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)，生物复合酶解提取法和传统水浴浸提法所得粗多糖的单糖组成基本是一致的。 

粗多糖基团性质分析：

为了验证生物复合酶解提取法是否会影响所得枣多糖所带的基团性质，比较了这两种方法所提取的枣多糖DEAE－Sephadex A－50柱洗脱曲线，结果参见附图4和图5可知，生物复合酶解提取法和传统水浴浸提法所得粗多糖都被DEAE－Sephadex A－50柱分成四个部分，且四个部分出峰所需的离子强度相同。这说明生物复合酶解提取不会改变粗多糖中酸性多糖所带的基团性质。

多糖红外光谱的比较

为了进一步证明生物复合酶解提取法是否会影响所得枣多糖的基本结构，对生物复合酶解提取法和传统水浴浸提法所得粗多糖进行了红外光谱分析，参见附图6可知，采用两种方法所得的枣多糖的峰形位置基本相同，从而可知生物复合酶解提取法与传统浸提法所得粗枣多糖基本构成相同。

粗多糖对小鼠体外脾淋巴细胞的增殖作用：

生物复合酶解提取与传统水浴浸提的枣多糖对体外小鼠脾淋巴细胞的增殖作用见表14。由表14可以得出，生物复合酶解提取与传统水浴浸提的枣多糖对体外小鼠脾淋巴细胞都具有一定的促进增殖功效，且促进作用与浓度相关。与对照组相比，试验的所有枣多糖剂量均显著性地促进鼠脾淋巴细胞的增殖（P<0.05）；当枣多糖浓度为200 g/mL，其脾淋巴细胞增殖率达到最高。但两种粗多糖的浓度高于200g/ml后，促进作用逐渐降低。从而可知生物复合酶解提取法与传统浸提法所得的枣多糖免疫功效基本相同。

表14：生物复合酶解提取与传统水浴浸提的枣多糖对体外脾淋巴细胞

的增殖作用

浓度(μg /ml)	ODS570nm (x±sd)	ODT570nm (x±sd)
			0	0.098±0.015a	0.098±0.015a
30	0.119±0.019a	0.111±0.024a
			50	0.135±0.009a	0.150±0.017b
80	0.153±0.032a	0.151±0.046a
			100	0.165±0.021a	0.163±0.027a
200	0.213±0.031a	0.230±0.022a
			500	0.157±0.025a	0.155±0.018a

注：OD_S570nm表示生物复合酶解提取的枣多糖经MTT比色法测定的OD值；OD_S570nm表示传统水浴浸提的枣多糖经MTT比色法测定的OD值

该表内数据为平均值±标准偏差（n=8），表中同一列内不同的字母表示具有显著性差异（p<0.05）

实施例五：

通过上述实验，为了进一步说明本发明，称取10 g已去核粉碎的枣粉，按照本发明的步骤及工艺条件进行酶解、浓缩、洗涤、洗脱干燥等程序后，获得脱色后的精多糖，其得率为9.3%、纯度达到38.65%。

按照本发明利用生物复合酶解技术和聚酰胺柱层析技术提纯骏枣多糖的方法，将其枣粗多糖的组成、结构及活性与传统水浴浸提技术相比较可知，两种技术所得粗多糖的构成和免疫功效基本相同，生物复合酶解技术不会改变粗多糖中酸性多糖所带基团性质。聚酰胺脱色较粉末活性炭、颗粒活性炭、吸附树脂等其他脱色剂效果较好，多糖的回收率也较高，同时可去除粗多糖中的蛋白质和杂质。

以上阐述本发明中的实施例，并不是对本发明作其它形式上了的限制，本专业的人员可以对上述阐述的技术内容进行变更等效实施例。但是只要是没有脱离本发明技术方案内容，根据本发明的技术实质，只是对以上实例进行简单修改、等同变化与改型，仍然属于本发明技术的保护范围。

Claims (2)

1.一种新疆骏枣多糖提纯的方法，其特征在于，所述的提纯方法具体步骤如下：

（1）前处理：将骏枣去核、粉碎，制得枣粉;

（2）酶解：将枣粉加水后添加1%（W/V）生物复合酶，在58-63℃，pH值6的条件下酶解56-66 min，其中，按重量比计，生物复合酶按照干果专用酶:蛋白酶为 1:1;

（3）浓缩：酶解结束后离心，合并上清液，之后将上清液进行真空浓缩;

（4）洗涤：将上述步骤（3）获得浓缩产物用工业酒精调至含醇量为80%，静置过夜，离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤各洗三次;

（5）洗脱：取上述步骤（4）获得提取的粗多糖加5倍体积的水溶解，上聚酰胺柱，按体积比计，采用的聚酰胺用量为酶解后提取的粗多糖的4倍，用1倍柱体积的去离子水以1.5 mL/min的流速进行洗脱;

（6）干燥：将上述步骤（5）获得提取的粗多糖经洗脱沉淀进行冷冻干燥。

2.如权利要求1提供的新疆骏枣多糖提纯的方法制备获得的骏枣多糖。

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