CN105695545A - 一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法 - Google Patents

一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105695545A
CN105695545A CN201610115900.XA CN201610115900A CN105695545A CN 105695545 A CN105695545 A CN 105695545A CN 201610115900 A CN201610115900 A CN 201610115900A CN 105695545 A CN105695545 A CN 105695545A
Authority
CN
China
Prior art keywords
component
sea cucumber
stichopus japonicus
fucoidan
enzymolysis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610115900.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105695545B (zh
Inventor
陈发河
吴光斌
冯俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jimei University
Original Assignee
Jimei University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jimei University filed Critical Jimei University
Priority to CN201610115900.XA priority Critical patent/CN105695545B/zh
Publication of CN105695545A publication Critical patent/CN105695545A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105695545B publication Critical patent/CN105695545B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法，是以海地瓜为原料，主要通过温和的分步酶解处理方法，并利用超滤膜分离出粗多糖和糖蛋白混合物，再通过Q-Sepharose-F-F 离子交换柱和Sephadex G-150葡聚糖凝胶柱实现对海参岩藻聚糖硫酸酯和海参蛋白聚糖的分离纯化和制备，制备的海参岩藻聚糖硫酸酯产品为淡黄褐色、海参糖蛋白为淡黄色。本发明通过联产方法使海地瓜中多糖和糖蛋白等主要成分可以联合制备，减少提取过程废弃物的排放，降低生产成本。

Description

一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法，属于分离纯化技术领域。
背景技术
海参（seacucumber,holothurians）属棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothurioider)木盾手目(Aspidochirota)生物。全世界约有900多种海参，我国约有140多种，其中可供食用者约有40多种，常见的食用海参有：仿刺参、玉足海参、梅花参、茄参、图纹白尼参、黑乳参、花刺参、糙海参、方柱五角瓜参、海地瓜等。海参具有极高的营养价值，自古以来就作为传统滋补佳品而被广泛食用。
海参作为一种传统海产珍品，营养价值高，生理活性丰富。近年来随着大众对海参消费的快速增长，海参需求量逐年增加，推动了我国海参养殖及加工产业的发展。目前海参加工产业虽增长迅速，但水平仍处在较低水平。低值海参资源利用不充分，精深加工产品少的问题亟待解决。对低值海参生物活性物质的提取纯化及产品化工程技术，是充分利用低值海参资源，实现低值海参精深加工和高质化利用的技术瓶，这也是目前海参产业亟待解决的重要科技问题。
体壁是海参的主要食（药）用部位，国内外学者对海参的研究发现，海参体壁营养非常丰富，蛋白质含量很高，干品蛋白质含量可达到70%，富含人体所需氨基酸，同时，体壁还含有海参皂苷、多糖、糖蛋白、多种维生素及微量元素，不含胆固醇。国内外已有关于海参的多种活性物质抗癌、抗肿瘤、抗氧化、降血压、免疫调节等作用的报道。
海参多糖是海参体壁主要活性物质之一，主要包括海参硫酸软骨素（SC-CHS）和海参岩藻聚糖硫酸酯（SC-FUC）。岩藻聚糖硫酸酯（FUC）是一类主要由岩藻糖及硫酸酯基团组成的多糖类物质，广泛存在于褐藻及一些海洋无脊椎动物（如海参、海胆等）内。过去几十年间FUC得到较为广泛系统的研究，已证实其具有多种生理活性，包括抗凝血与抗血栓、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、抗炎、降血脂、抗氧化、胃保护作用等。1948年，Vasseur从海胆卵中提取得到FUC，此后，科研工作者从海参体壁中提取得到FUC并对其结构进行了分析，如Kariya等从日本刺参中分离出两种结构的海参岩藻聚糖硫酸酯，且这两种化合物均能显著抑制体外破骨类细胞的形成。FUC化合物的研究目前集中于海藻FUC，且研究表明海藻FUC活性丰富，相对安全，在功能性食品、药品的领域显示出良好的应用前景。SC-FUC作为海藻FUC的结构类似物，也应具有良好的活性及应用前景，值得开发利用。从现有的研究结果分析,海参岩藻聚糖硫酸酯的结构比同种海参硫酸软骨素的结构要简单,但具有抗破骨类细胞形成、免疫调节、抗氧化等活性较高。海参糖蛋白也是海参体壁主要活性物质之一，大量研究表明，海洋生物中提取的糖蛋白具有抗肿瘤和提高免疫等显著的生理活性，目前对海参中糖蛋白及其生理活性的研究国内外鲜有报道，关于海参岩藻聚糖硫酸酯的提取已有研究，但多数提取方法成本高，提取工艺复杂，且原材料耗费量大，利用同批原料同时分离纯化得到海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的方法却没有。
本研究小组从2011年开始，以低值海参“海地瓜”为原料，对海参岩藻聚糖硫酸酯和海参蛋白聚糖的制备方法及其生物活性进行了系统研究，在海参中含有许多有效成分，为了获得多种高纯度的有益成分，本发明通过联产方法使海地瓜中多糖和糖蛋白等主要成分可以联合制备，减少提取过程废弃物的排放，降低生产成本，有效的获得的目的成分。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法，它是以低值海参海地瓜为原料，主要通过温和的分步酶解处理方法，并利用超滤膜分离出粗多糖和糖蛋白混合物，再通过Q-Sepharose-F-F离子交换柱和SephadexG-150葡聚糖凝胶柱实现对海参岩藻聚糖硫酸酯和海参蛋白聚糖的分离纯化和制备，制备的海参岩藻聚糖硫酸酯产品为淡黄褐色、海参糖蛋白为淡黄色。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
具体方法包括如下：
（1）预处理。海地瓜干品用30-50℃清水泡发24-36小时，洗净体表与体内的泥沙、淤泥，切碎成块状，置于40~50℃烘箱中烘至恒重，粉碎至60~80目颗粒，制成海地瓜干粉，密封干燥保存备用。
（2）酶解。海地瓜干粉加入纯净水，料液比为1：30-1：70（W/W）,用碱调pH至6.8-8.5，加入复合蛋白酶Ⅰ，温度40-60℃，保温振荡水浴酶解1-4小时；用酸调整pH至4.0-7.0，加入复合蛋白酶Ⅱ，温度40-60℃，保温振荡水浴酶解2-5小时，酶解结束后加热灭酶，进行离心分离，取酶解上清液。
（3）酶解液中蛋白质脱除。向酶解上清液中加入蛋白质沉淀剂Ⅰ，匀速搅拌10-50min，然后加入蛋白质沉淀剂Ⅱ，混匀后4℃下静置过夜，离心后弃去滤渣，收集上清液。
（4）超滤膜分离。将步骤(3)中获得的海地瓜酶解液用超滤膜进行分离，被超滤膜截留住的酶解液为粗多糖和糖蛋白混合物浓缩液，经40-50℃条件下减压浓缩，再经冷冻干燥制得海地瓜粗多糖和糖蛋白混合物。
（5）海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白混合物的分离。取海地瓜粗多糖和糖蛋白混合物溶于初始缓冲液中，经超声波充分溶解后，使用Q-Sepharose-F-F离子交换柱对海地瓜粗多糖和糖蛋白混合液进行分离纯化，洗脱的条件是：以pH=8.0-9.0，10-50mmol/L的Tris-HCl缓冲液为溶剂，先后配制0.5-4mol/LNaCl的洗脱液，进行2倍以上柱体积的线性洗脱，先后得到两种组分，分别为组分A和组分B，分别收集组分A和组分B洗脱液，使用3000-5000道尔顿的超滤膜滤除盐，保留组分A和组分B浓缩液。海地瓜粗多糖和糖蛋白产品与初始缓冲液的比例为1.8-2.1：10（g/mL）。
（6）海参岩藻聚糖硫酸酯和海参蛋白聚糖的纯化。使用SephadexG-150葡聚糖凝胶柱层析对步骤（5）中获得的组分A和组分B浓缩液进一步纯化，以步骤（5）中的Tris-HCl缓冲液为溶剂，配制0.1-0.5mol/LNaCl的洗脱液，用2倍以上柱体积的洗脱液洗脱，收集组分A和组分B洗脱液，使用3000-5000道尔顿的超滤膜滤除盐，得到纯化的组分A和组分B浓缩液。
（7）干燥。对步骤（6）中纯化的组分A和组分B浓缩液进行常压干燥或冷冻干燥，分别得到组分A：海参糖蛋白和组分B：海参岩藻聚糖硫酸酯。
在步骤（2）中，所用的复合蛋白酶Ⅰ为：胰蛋白酶和碱性蛋白酶，两者的比例为2：1，复合蛋白酶Ⅰ的添加量为原料重量的0.05-3%。所用的复合蛋白酶Ⅱ为：木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶，三者的比例为3：1：1，复合蛋白酶Ⅱ的添加量为原料重量的0.1-4%。
在步骤（2）和(3)中，所述的离心条件：转速为3500-7000rpm，温度为室温。
在步骤（3）中，蛋白质沉淀剂Ⅰ为：氯仿和正丁醇混合液，两者的混合比例为5：1，蛋白质沉淀剂Ⅰ的添加量为酶解液体积的1/4-1/6。蛋白质沉淀剂Ⅱ为：10%的三氯醋酸（m/v），其添加量为蛋白质沉淀剂Ⅱ与酶解液体积比等于1：1。
在步骤（4）中，所述的超滤膜的规格为：截留分子量为3000-20000道尔顿。
在步骤（5）中，所述的初始缓冲液为：pH=8.0，20mmol/L的Tris-HCl缓冲液。
在步骤（5）中，所述的Q-Sepharose-F-F离子交换柱使用的填料是Q-Sepharose-F-F强碱阴离子交换树脂。
由于本发明根据低值海参海地瓜富含多糖、糖蛋白的特性，改变传统的高温水煮、加盐醇沉等提取技术，采用温和的分步酶解处理方法，并利用超滤膜分离出粗多糖和糖蛋白混合物，再通过Q-Sepharose-F-F离子交换柱和SephadexG-150葡聚糖凝胶柱实现对海参岩藻聚糖硫酸酯和海参蛋白聚糖的分离纯化和制备，制备的海参岩藻聚糖硫酸酯产品为淡黄褐色、海参糖蛋白为淡黄色，容易被消费者接受，扩大产品的应用范围。
本发明具有以下优点：
1、本发明利用低值海参海地瓜为原料，提高了原料利用价值。
2、本发明通过联产方法使海地瓜中多糖和糖蛋白等主要成分可以联合制备，减少提取过程废弃物的排放，降低生产成本。
3、本发明制备的海参岩藻聚糖硫酸酯产品为淡黄褐色、海参糖蛋白为淡黄色，易于利用，应用范围广。
附图说明
图1为本发明海地瓜糖蛋白和岩藻聚糖硫酸酯分离第一个实例的Q-Sepharose-F-F离子交换柱层析等梯度洗脱曲线图。
图2为本发明生产的海地瓜糖蛋白纯化第一个实例的SephadexG-150柱层析的洗脱曲线图。
图3为本发明生产的海地瓜岩藻聚糖硫酸酯纯化第一个实例的SephadexG-150柱层析的洗脱曲线图。
图4为本发明生产的海地瓜糖蛋白的红外光谱图。
图5为本发明生产的海地瓜岩藻聚糖硫酸酯的红外光谱图。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
（1）预处理。海地瓜干品用30℃清水泡发24小时，洗净体表与体内的泥沙、淤泥，切碎成块状，置于40℃烘箱中烘至恒重，粉碎至60目颗粒，制成海地瓜干粉，密封干燥保存备用。
（2）酶解。将100g海地瓜干粉加入纯净水，料液比为1：50（W/W）,用碱调pH至7.0，加入0.4g胰蛋白酶和0.2g碱性蛋白酶，在50℃，保温振荡水浴酶解3小时；用酸调整pH至6.8，加入0.3g木瓜蛋白酶、0.1g中性蛋白酶和0.1g风味蛋白酶在50℃，保温振荡水浴酶解3小时；酶解结束后加热灭酶（100℃,10min），进行离心分离(6000rpm,20℃)，取酶解上清液(460ml)。
（3）酶解液中蛋白质脱除。向460ml酶解上清液中加入115ml蛋白质沉淀剂Ⅰ（氯仿和正丁醇混合液，两者的混合比例为5：1），匀速搅拌50min，然后加入460ml蛋白质沉淀剂Ⅱ（10%的三氯醋酸），混匀后4℃下静置过夜，离心(6000rpm,20℃)后弃去滤渣，收集上清液。
（4）超滤膜分离。将步骤(3)中获得的的海地瓜酶解液用4000道尔顿的超滤膜进行分离，被超滤膜截留住的酶解液为粗多糖和糖蛋白浓缩液，将超滤膜截留获得的680ml浓缩液,经45℃条件下减压浓缩(0.1MPa)，浓缩至原体积的30%，再经冷冻干燥制得19.5g海地瓜粗多糖和糖蛋白混合物。
（5）海参岩藻聚糖硫酸酯和海参蛋白聚糖的分离。取19.5g海地瓜粗多糖和糖蛋白混合物溶于100ml初始缓冲液中，经超声波充分溶解后，加入Q-Sepharose-F-F离子交换柱对海地瓜粗多糖和糖蛋白混合液进行分离，洗脱的条件是：以pH=8.5，20mmol/L的Tris-HCl缓冲液为溶剂，配制0.5mol/LNaCl和2.5mol/LNaCl的Tris-HCl洗脱液先后对海地瓜粗多糖和糖蛋白混合液进行2倍以上柱体积的线性洗脱，先后得到两种组分，分别为组分A和组分B，分别收集组分A和组分B洗脱液，使用3000道尔顿的超滤膜滤除盐，保留组分A和组分B浓缩液（图1）。
（6）海参岩藻聚糖硫酸酯和海参蛋白聚糖的纯化。将上述分别收集组分A和组分B洗脱液分别加入SephadexG-150葡聚糖凝胶柱层析，洗脱的条件是：以pH=8.5，20mmol/L的Tris-HCl缓冲液为溶剂，配制0.3mol/LNaCl的Tris-HCl洗脱液，对海地瓜粗多糖和糖蛋白进行2倍以上柱体积的线性洗脱，收集组分A和组分B洗脱液，使用3000道尔顿的超滤膜滤除盐，得到纯化的组分A和组分B浓缩液（图3、图4）。
（7）干燥。分别对纯化的组分A和组分B浓缩液进行冷冻干燥，分别得到5.7g的淡黄色海参糖蛋白（（组分A，图4）和11.2g的淡黄褐色海参岩藻聚糖硫酸酯（（组分B，图5）。
实施例2
（1）预处理。海地瓜干品用50℃清水泡发36小时，洗净体表与体内的泥沙、淤泥，切碎成块状，置于50℃烘箱中烘至恒重，粉碎至80目颗粒，制成海地瓜干粉，密封干燥保存备用。
（2）酶解。将100g海地瓜干粉加入纯净水，料液比为1：60（W/W）,用碱调pH至7.5，加入1.0g胰蛋白酶和0.5g碱性蛋白酶，在55℃，保温振荡水浴酶解2小时；用酸调整pH至6.0，加入0.6g木瓜蛋白酶、0.2g中性蛋白酶和0.2g风味蛋白酶在55℃，保温振荡水浴酶解3小时；酶解结束后加热灭酶（100℃,10min），进行离心分离(6000rpm,20℃)，取酶解上清液(约560ml)。
（3）酶解液中蛋白质脱除。向560ml酶解上清液中加入112ml蛋白质沉淀剂Ⅰ（氯仿和正丁醇混合液，两者的混合比例为5：1），匀速搅拌30min，然后加入560ml蛋白质沉淀剂Ⅱ（10%的三氯醋酸），混匀后4℃下静置过夜，离心(6000rpm,20℃)后弃去滤渣，收集上清液。
（4）超滤膜分离。将步骤(3)中获得的的海地瓜酶解液用5000道尔顿的超滤膜进行分离，被超滤膜截留住的酶解液为粗多糖和糖蛋白浓缩液，将超滤膜截留获得的705ml浓缩液,经40℃条件下减压浓缩(0.1MPa)，浓缩至原体积的30%，再经冷冻干燥制得21.0g海地瓜粗多糖和糖蛋白混合物。
（5）海参岩藻聚糖硫酸酯和海参蛋白聚糖的分离。取21.0g海地瓜粗多糖和糖蛋白混合物溶于100ml初始缓冲液中，经超声波充分溶解后，加入Q-Sepharose-F-F离子交换柱对海地瓜粗多糖和糖蛋白混合液进行分离，洗脱的条件是：以pH=8.0，30mmol/L的Tris-HCl缓冲液为溶剂，配制0.5mol/LNaCl和2.5mol/LNaCl的Tris-HCl洗脱液先后对海地瓜粗多糖和糖蛋白混合液进行2倍以上柱体积的线性洗脱，先后得到两种组分，分别为组分A和组分B，分别收集组分A和组分B洗脱液，使用3500道尔顿的超滤膜滤除盐，保留组分A和组分B浓缩液。
（6）海参岩藻聚糖硫酸酯和海参蛋白聚糖的纯化。将上述分别收集组分A和组分B洗脱液分别加入SephadexG-150葡聚糖凝胶柱层析，洗脱的条件是：以pH=8.0，30mmol/L的Tris-HCl缓冲液为溶剂，配制0.5mol/LNaCl的Tris-HCl洗脱液，对海地瓜粗多糖和糖蛋白进行2倍以上柱体积的线性洗脱，收集组分A和组分B洗脱液，使用3500道尔顿的超滤膜滤除盐，得到纯化的组分A和组分B浓缩液。
（7）干燥。分别对纯化的组分A和组分B浓缩液进行冷冻干燥，分别得到6.9g的淡黄色海参糖蛋白（组分A）和11.6g的淡黄褐色海参岩藻聚糖硫酸酯（组分B）。
实施例3
（1）预处理。海地瓜干品用40℃清水泡发30小时，洗净体表与体内的泥沙、淤泥，切碎成块状，置于45℃烘箱中烘至恒重，粉碎至70目颗粒，制成海地瓜干粉，密封干燥保存备用。
（2）酶解。将100g海地瓜干粉加入纯净水，料液比为1：55（W/W）,用碱调pH至8.0，加入2.0g胰蛋白酶和1.0g碱性蛋白酶，在60℃，保温振荡水浴酶解3小时；用酸调整pH至5.5，加入0.9g木瓜蛋白酶、0.3g中性蛋白酶和0.3g风味蛋白酶在60℃，保温振荡水浴酶解3小时；酶解结束后加热灭酶（100℃,10min），进行离心分离(6000rpm,20℃)，取酶解上清液(约506ml)。
（3）酶解液中蛋白质脱除。向506ml酶解上清液中加入85ml蛋白质沉淀剂Ⅰ（氯仿和正丁醇混合液，两者的混合比例为5：1），匀速搅拌40min，然后加入506ml蛋白质沉淀剂Ⅱ（10%的三氯醋酸），混匀后4℃下静置过夜，离心(6000rpm,20℃)后弃去滤渣，收集上清液。
（4）超滤膜分离。将步骤(3)中获得的的海地瓜酶解液用8000道尔顿的超滤膜进行分离，被超滤膜截留住的酶解液为粗多糖和糖蛋白浓缩液，将超滤膜截留获得的670ml浓缩液,经50℃条件下减压浓缩(0.1MPa)，浓缩至原体积的30%，再经冷冻干燥制得18.6g海地瓜粗多糖和糖蛋白混合物。
（5）海参岩藻聚糖硫酸酯和海参蛋白聚糖的分离。取18.6g海地瓜粗多糖和糖蛋白溶于100ml初始缓冲液中，经超声波充分溶解后，加入Q-Sepharose-F-F离子交换柱对海地瓜粗多糖和糖蛋白混合物进行分离，洗脱的条件是：以pH=8.5，40mmol/L的Tris-HCl缓冲液为溶剂，配制0.5mol/LNaCl和2.5mol/LNaCl的Tris-HCl洗脱液先后对海地瓜粗多糖和糖蛋白混合物进行2倍以上柱体积的线性洗脱，先后得到两种组分，分别为组分A和组分B，分别收集组分A和组分B洗脱液，使用5000道尔顿的超滤膜滤除盐，保留组分A和组分B浓缩液。
（6）海参岩藻聚糖硫酸酯和海参蛋白聚糖的纯化。将上述分别收集组分A和组分B洗脱液分别加入SephadexG-150葡聚糖凝胶柱层析，洗脱的条件是：以pH=8.5，40mmol/L的Tris-HCl缓冲液为溶剂，配制0.5mol/LNaCl的Tris-HCl洗脱液，对海地瓜粗多糖和糖蛋白进行进行2倍以上柱体积的线性洗脱，收集组分A和组分B洗脱液，使用5000道尔顿的超滤膜滤除盐，得到纯化的组分A和组分B浓缩液。
（7）干燥。分别对纯化的组分A和组分B浓缩液进行冷冻干燥，分别得到7.0g的淡黄色海参糖蛋白（组分A）和9.9g的淡黄褐色海参岩藻聚糖硫酸酯（组分B）。
产品检测：
海地瓜糖蛋白和岩藻聚糖硫酸酯化学组成(g/100g)
以上所述仅为本发明的较佳实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法，其特征在于：所述方法是以海地瓜为原料，主要通过温和的分步酶解处理方法，并利用超滤膜分离出粗多糖和糖蛋白混合物，再通过Q-Sepharose-F-F离子交换柱和SephadexG-150葡聚糖凝胶柱实现对海参岩藻聚糖硫酸酯和海参蛋白聚糖的分离纯化和制备，制备的海参岩藻聚糖硫酸酯产品为淡黄褐色、海参糖蛋白为淡黄色。
2.根据权利要求1所述的一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法，其特征在于：所述方法具体包括如下：
（1）预处理：海地瓜干品用30-50℃清水泡发24-36小时，洗净体表与体内的泥沙、淤泥，切碎成块状，置于40~50℃烘箱中烘至恒重，粉碎至60~80目颗粒，制成海地瓜干粉，密封干燥保存备用；
（2）酶解：海地瓜干粉加入纯净水，料液质量比为1：30-1：70,用碱调pH至6.8-8.5，加入复合蛋白酶Ⅰ，温度40-60℃，保温振荡水浴酶解1-4小时；用酸调整pH至4.0-7.0，加入复合蛋白酶Ⅱ，温度40-60℃，保温振荡水浴酶解2-5小时，酶解结束后加热灭酶，进行离心分离，取酶解上清液；
（3）酶解液中蛋白质脱除：向酶解上清液中加入蛋白质沉淀剂Ⅰ，匀速搅拌10-50min，然后加入蛋白质沉淀剂Ⅱ，混匀后4℃下静置过夜，离心后弃去滤渣，收集上清液；
（4）超滤膜分离：将步骤(3)中获得的海地瓜酶解液用超滤膜进行分离，被超滤膜截留住的酶解液为粗多糖和糖蛋白浓缩液，经40-50℃条件下减压浓缩，再经冷冻干燥制得海地瓜粗多糖和糖蛋白产品；
（5）海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的分离：取海地瓜粗多糖和糖蛋白产品溶于初始缓冲液中，经超声波充分溶解后，使用Q-Sepharose-F-F离子交换柱对海地瓜粗多糖和糖蛋白混合液进行分离纯化，洗脱的条件是：以pH=8.0-9.0、10-50mmol/L的Tris-HCl缓冲液为溶剂，先后配制0.5-4mol/LNaCl的洗脱液，进行2倍以上柱体积的线性洗脱，先后得到两种组分，分别为组分A和组分B，分别收集组分A和组分B洗脱液，使用3000-5000道尔顿的超滤膜滤除盐，保留组分A和组分B浓缩液；
（6）海参岩藻聚糖硫酸酯和海参蛋白聚糖的纯化：使用SephadexG-150葡聚糖凝胶柱层析分别对步骤（5）中获得的组分A和组分B浓缩液进一步纯化，以步骤（5）中的Tris-HCl缓冲液为溶剂，配制0.1-0.5mol/LNaCl的洗脱液，用2倍以上柱体积的洗脱液洗脱，收集组分A和组分B洗脱液，使用3000-5000道尔顿的超滤膜滤除盐，得到纯化的组分A和组分B浓缩液；
（7）干燥：对步骤（6）中纯化的组分A和组分B浓缩液进行常压干燥或冷冻干燥，分别得到组分A：海参糖蛋白和组分B：海参岩藻聚糖硫酸酯。
3.根据权利要求2所述的一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所用的复合蛋白酶Ⅰ为：胰蛋白酶和碱性蛋白酶，两者重量比为2：1，复合蛋白酶Ⅰ的添加量为原料重量的0.05-3%；所用的复合蛋白酶Ⅱ为：木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶，三者的重量比例为3：1：1，复合蛋白酶Ⅱ的添加量为原料重量的0.1-4%。
4.根据权利要求2所述的一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤（2）和(3)中，所述的离心条件：转速为3500-7000rpm，温度为室温。
5.根据权利要求2所述的一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤（3）中，蛋白质沉淀剂Ⅰ为：氯仿和正丁醇混合液，两者的体积比为5：1，蛋白质沉淀剂Ⅰ的添加量为酶解液体积的1/4-1/6；蛋白质沉淀剂Ⅱ为：10%m/v的三氯醋酸，其添加量为蛋白质沉淀剂Ⅱ与酶解液体积比等于1：1。
6.根据权利要求2所述的一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤（4）中，所述的超滤膜的规格为：截留分子量为3000-20000道尔顿。
7.根据权利要求2所述的一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤（5）中，所述的初始缓冲液为：pH=8.0，20mmol/L的Tris-HCl缓冲液；所述的Q-Sepharose-F-F离子交换柱使用的填料是Q-Sepharose-F-F强碱阴离子交换树脂。
CN201610115900.XA 2016-03-02 2016-03-02 一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法 Expired - Fee Related CN105695545B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610115900.XA CN105695545B (zh) 2016-03-02 2016-03-02 一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610115900.XA CN105695545B (zh) 2016-03-02 2016-03-02 一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105695545A true CN105695545A (zh) 2016-06-22
CN105695545B CN105695545B (zh) 2019-05-31

Family

ID=56222647

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610115900.XA Expired - Fee Related CN105695545B (zh) 2016-03-02 2016-03-02 一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105695545B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106262898A (zh) * 2016-08-17 2017-01-04 孙元盛 预防铜缺乏症的多肽胶囊及其制备方法
CN108218973A (zh) * 2017-12-12 2018-06-29 浙江海洋大学 一种东海乌参糖蛋白的提取方法
CN108341889A (zh) * 2018-03-29 2018-07-31 浙江海洋大学 一种乌参岩藻多糖的制备方法
CN108841905A (zh) * 2018-06-21 2018-11-20 国肽生物工程（常德）有限公司 一种具有ace抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽及其制备方法
CN110272887A (zh) * 2019-07-05 2019-09-24 集美大学 一种低黏度岩藻聚糖及其高温高压-酶联耦合制备方法
CN110437288A (zh) * 2019-09-02 2019-11-12 中国海洋大学 一种新型海参岩藻多糖及其制备方法和应用
CN110916198A (zh) * 2019-12-24 2020-03-27 集美大学 一种利用黄秋葵发酵酒酒渣同时制备果胶多糖和黏性糖蛋白的方法
CN111449195A (zh) * 2020-05-26 2020-07-28 江苏科技大学 一种利用低血糖指数糯米粉制备年糕的方法
CN115433749A (zh) * 2022-08-30 2022-12-06 威海海洋生物医药产业技术研究院有限公司 一种新型多岩藻糖支链fcs、制备方法及其缓解高糖损伤的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101191139A (zh) * 2007-04-28 2008-06-04 付学军 海参多肽、多糖的综合提取工艺
CN102382198A (zh) * 2010-09-03 2012-03-21 威海中盛海洋生物科技有限公司 从海参加工液中提取海参粘多糖及制备速溶冻干粉的工艺
CN104946713A (zh) * 2015-06-29 2015-09-30 姜乃义 一种基于海参蛋白的降糖降脂肽制备方法及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101191139A (zh) * 2007-04-28 2008-06-04 付学军 海参多肽、多糖的综合提取工艺
CN102382198A (zh) * 2010-09-03 2012-03-21 威海中盛海洋生物科技有限公司 从海参加工液中提取海参粘多糖及制备速溶冻干粉的工艺
CN104946713A (zh) * 2015-06-29 2015-09-30 姜乃义 一种基于海参蛋白的降糖降脂肽制备方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
姚秋萍: "《油菜花粉超微粉有效成分溶出 代谢特征及指纹图谱研究》", 31 October 2014, 西南交通大学出版社 *
王共明: "仿刺海参多肽、多糖的制备及多肽活性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106262898A (zh) * 2016-08-17 2017-01-04 孙元盛 预防铜缺乏症的多肽胶囊及其制备方法
CN108218973A (zh) * 2017-12-12 2018-06-29 浙江海洋大学 一种东海乌参糖蛋白的提取方法
CN108341889A (zh) * 2018-03-29 2018-07-31 浙江海洋大学 一种乌参岩藻多糖的制备方法
CN108841905A (zh) * 2018-06-21 2018-11-20 国肽生物工程（常德）有限公司 一种具有ace抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽及其制备方法
CN110272887A (zh) * 2019-07-05 2019-09-24 集美大学 一种低黏度岩藻聚糖及其高温高压-酶联耦合制备方法
CN110272887B (zh) * 2019-07-05 2020-12-04 集美大学 一种低黏度岩藻聚糖及其高温高压-酶联耦合制备方法
CN110437288A (zh) * 2019-09-02 2019-11-12 中国海洋大学 一种新型海参岩藻多糖及其制备方法和应用
CN110437288B (zh) * 2019-09-02 2021-06-08 中国海洋大学 一种海参岩藻多糖及其制备方法和应用
CN110916198A (zh) * 2019-12-24 2020-03-27 集美大学 一种利用黄秋葵发酵酒酒渣同时制备果胶多糖和黏性糖蛋白的方法
CN111449195A (zh) * 2020-05-26 2020-07-28 江苏科技大学 一种利用低血糖指数糯米粉制备年糕的方法
CN115433749A (zh) * 2022-08-30 2022-12-06 威海海洋生物医药产业技术研究院有限公司 一种新型多岩藻糖支链fcs、制备方法及其缓解高糖损伤的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105695545B (zh) 2019-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105695545A (zh) 一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法
CN103265642B (zh) 一种从海参加工废弃物中提取活性物质的方法
CN101229199B (zh) 北冬虫夏草菌丝体中多种有效成分的综合提取方法
CN101358219B (zh) 发酵法同时分级提取枣黄酮和枣多糖
CN102399297A (zh) 一种具有免疫活性的浒苔多糖及其制备方法
CN104140471B (zh) 一种从山药食品加工下脚料中制备山药高纯度多糖的方法
CN104926937A (zh) 一种从水蛭唾液中提取水蛭素的方法
CN100447250C (zh) 一种米糠多糖的分离纯化方法
CN101961371A (zh) 从甜味绞股蓝中提取分离人参皂苷、黄酮、多糖的方法
CN102742906A (zh) 一种具有低血糖指数和抗疲劳作用的罗汉果饮料
CN111187366A (zh) 一种黄精多糖的双水相萃取方法
CN102526127B (zh) 蛹虫草中有效成分的闪式提取方法
CN106490608A (zh) 一种石斛增强免疫力口服液、冲剂、胶囊、片剂
WO2022067774A1 (zh) 一种海参多糖的制备方法与应用
CN103923201A (zh) 一种海马活性糖蛋白的制备方法
CN105175573A (zh) 一种高效的黄芪多糖提取方法
CN110916198A (zh) 一种利用黄秋葵发酵酒酒渣同时制备果胶多糖和黏性糖蛋白的方法
CN107011458A (zh) 硒化莲藕多糖及其制备方法和应用
CN106967186B (zh) 一种从鱼鳔中提取类肝素化合物的方法
CN102001974A (zh) 一种从紫菜中提取和制备牛磺酸的工艺
KR19990081593A (ko) 신규한 면역증강활성 다당류물질 및 그 제조방법
CN102050882B (zh) 一种龙眼蛋白多糖及其制备方法和应用
CN106086134B (zh) 一种桑蛋白活性肽的制备方法
CN106496346A (zh) 一种白簕多糖的分离纯化方法
CN101228949B (zh) 蕨菜多糖的提取分离方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190531

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee