CN101228949B - 蕨菜多糖的提取分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蕨菜多糖的提取分离纯化方法，旨在解决现有方法提取出的蕨菜多糖含色素多、水溶性差、提取率不高、纯度低的问题。为解决上述问题，本发明采用热水浸提法浸取，并用乙醇沉淀的方法分离，最后用阴离子交换柱和凝胶排阻层析纯化多糖。本发明方法适合于大规模生产，且能普遍应用于各种蕨类植物多糖、糖蛋白的分离纯化。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖的提取分离方法，更具体地，本发明涉及一种蕨菜多糖的提取分离方法。
背景技术：
蕨菜是可作食用的蕨类植物的统称。野生蕨菜自古以来就被用作菜蔬和度荒的食品，我国最早的诗经中《诗召南草虫》记载：“陡彼南山，言采其蕨”。北魏贾思勰的《齐民要术》及明代李时珍的《本草纲目》均有较多的记载。由于野生蕨菜具有特殊的清香口味，又极少受到污染，所以倍受人们青睐，已成为我国重要出口土特产品之一，在国外享有“山珍之王”的美称。蕨菜为传统野菜，营养极为丰富，含有大量的氨基酸以及无机元素，其中有8种人体必需氨基酸，其胡萝卜素和维生素C的含量均高于番茄、茄子和黄瓜。不仅蕨的嫩叶可供食用，其地下根状茎富含淀粉，可提取食用。我国野生蕨菜资源丰富，极具开发价值，但目前绝大多数尚未被利用。有关蕨菜化学成分的测定、药理作用的特点、营养保健的价值，近年有一些报道，但对于蕨菜多糖的提取方法和特别是分离纯化则尚未报道，有些方法提取出的蕨菜多糖含色素很多，灰色粉末状的蕨菜粗多糖水溶性差，提取率不高，纯度也很低。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述存在的问题，提供一种科学地提取蕨菜多糖，并能保持蕨菜多糖的生物活性，最大限度地提高蕨菜多糖提取率的方法。
本发明的多糖的提取分离方法是利用多糖、糖蛋白溶于水的特性，用热水浸提法，并用乙醇沉淀的方法分离，最后用阴离子交换层析和凝胶排阻层析纯化多糖。具体包括以下步骤：
1)取蕨菜粉碎过40～80目筛，用2～4倍90％乙醇在80～100℃回流浸提0.5～2小时；
2)去掉乙醇后加水在60～90℃水浴上提取2～3次，每次2～4小时；
3)将上述浸提液离心4800rpm，10min，弃沉淀，取上清液；
4)用Sevage方法脱去上清蛋白：在上清液中加等体积的氯仿-正丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4∶1，充分震荡后静置10分钟，4000～6000rpm离心10分钟，反复多次直至完全脱去蛋白。
5)乙醇沉淀的方法分离：将脱去蛋白的溶液在50℃～60℃减压蒸馏浓缩，加入2～3倍于该溶液体积的乙醇进行沉淀，离心收集沉淀，干燥，得粗多糖；
6)阴离子交换柱和凝胶排阻层析纯化多糖：取粗多糖溶于去离子水或pH值为7～8，浓度为10～50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，制成饱和溶液，4800rpm离心弃沉淀，将上清样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，以上述的Tris-HCl为洗脱液，再用浓度为0.2～0.8mol/L NaCl梯度洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测样品在490nm的吸收值，收集单一峰，透析去离子后上样于Sephacryl S-400HR或Sephadex G-100柱，以去离子水进行洗脱。用苯酚硫酸法跟踪检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确定蛋白的含量，收集单一峰，冷冻干燥得纯化的单一蕨菜多糖。
本发明中，若采用新鲜蕨菜，则新鲜蕨菜与蒸馏水以重量比1∶3的比例混合，若采用干蕨菜粉，则干蕨菜与蒸馏水以重量比1∶15～25的比例混合。
步骤6)中所述的用于蕨菜多糖的检测苯酚-硫酸法为：将0.2ml样品用蒸馏水稀释到2ml，加入6％的苯酚溶液1ml，再加入5ml浓硫酸，反应30分钟后再用紫外分光光度计在490nm处检测OD值。
优选地，本发明步骤2)中水的用量为20倍于样品的重量，温度在60～75℃提取2次，每次2.5～3.5小时；优选地，提取温度是62～68℃提取2次，每次2.5～3.5小时；更优选地，是65℃，提取2次，每次3小时。
本发明步骤5)中在-60℃真空冷冻干燥8～12小时
本发明步骤6)中采用流动水透析；Tris-HCl和去离子水洗脱的流速控制在2ml/min。
本发明方法以干蕨菜为原料，提取、纯化各种蕨菜多糖、糖蛋白，多糖的提取率高，经优化后的提取率为2.02％，经过纯化的多糖纯度在98％以上；除色素彻底、水溶性好，并且能保持多糖和糖蛋白的生物活性。本发明方法简单合理，适合于大规模生产，且能普遍应用于各种蕨类植物多糖和糖蛋白的分离纯化。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但本发明并不局限于此实施例。
实施例1：
1.蕨菜粗多糖的制备
取干蕨菜粉100g，粉碎过后过40目筛，加入100ml 90％乙醇在90℃回流浸提1小时。去掉乙醇后，加入2000ml水，在65℃水浴上提取2次，每次3小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4∶1，充分振荡，静置10分钟，4500rpm离心10分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在55℃减压蒸馏浓缩，取上清液，然后用2.5倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。最后沉淀在-60℃真空冷冻干燥10小时后得粗多糖。再用苯酚-硫酸法在490nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确定蛋白的含量。
2.蕨菜多糖的精制
将上述500mg粗多糖溶解于20ml pH值为7.5，浓度为40mmol/L的Tris-HCl中，4800rpm离心10分钟弃沉淀。将上清上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为7.5的Tris-HCl作洗脱液，以浓度为0.5mol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集的产物用本发明所述的苯酚-硫酸法在490nm处检测光吸收值，得到三个吸收峰。分别收集三个吸收峰(组分I、II、III)，并在去离子水中透析脱盐。将透析后溶液浓缩，再分别上样于Sephacryl S-400HR柱，以去离子水作洗脱液，流速控制在2ml/min，同样用苯酚硫酸法跟踪检测多糖，在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果表明，组分I、II、III过Sephacryl S-400HR后是一个对称峰，说明此组分为单一组分，将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易溶于水。
实施例2
1.蕨菜粗多糖的制备
取干蕨菜粉100g，粉碎过后过80目筛，加入100ml 90％乙醇在100℃回流浸提2小时。去掉乙醇后，加入2500ml水，在90℃水浴上提取3次，每次4小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4∶1，充分振荡，静置10分钟，4500rpm离心10分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在50℃减压蒸馏浓缩，取上清液，然后用2倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。最后沉淀在-60℃真空冷冻干燥12小时后得粗多糖。再用苯酚-硫酸法在490nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确定蛋白的含量。
2.蕨菜多糖的精制
将上述500mg粗多糖溶解于20ml pH值为8.0，浓度为50mmol/L的Tris-HCl中，4800rpm离心10分钟弃沉淀。将上清上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为8.0的Tris-HCl作洗脱液，以浓度为0.8mol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集的产物用本发明所述的苯酚-硫酸法在490nm处检测光吸收值，得到三个吸收峰。分别收集三个吸收峰(组分I、II、III)，并在去离子水中透析脱盐。将透析后溶液浓缩，再分别上样于Sephacryl S-400HR柱，以去离子水作洗脱液，流速控制在2ml/min，同样用苯酚硫酸法跟踪检测多糖，在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果表明，组分I、II、III过Sephacryl S-400HR后是一个对称峰，说明此组分为单一组分，将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易溶于水。
实施例3
1.蕨菜粗多糖的制备
取干蕨菜粉100g，粉碎过后过60目筛，加入100ml 90％乙醇在80℃回流浸提0.5小时。去掉乙醇后，加入1500ml水，在75℃水浴上提取2次，每次3.5小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4∶1，充分振荡，静置10分钟，4500rpm离心10分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在60℃减压蒸馏浓缩，取上清液，然后用3倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。最后沉淀在-60℃真空冷冻干燥8小时后得粗多糖。再用苯酚-硫酸法在490nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确定蛋白的含量。
2.蕨菜多糖的精制
将上述500mg粗多糖溶解于20ml pH值为7.0，浓度为20mmol/L的Tris-HCl中，4800rpm离心10分钟弃沉淀。将上清上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为7.0的Tris-HCl作洗脱液，以浓度为0.6mol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集的产物用本发明所述的苯酚-硫酸法在490nm处检测光吸收值，得到三个吸收峰。分别收集三个吸收峰(组分I、II、III)，并在去离子水中透析脱盐。将透析后溶液浓缩，再分别上样于Sephacryl S-400HR柱，以去离子水作洗脱液，流速控制在2ml/min，同样用苯酚硫酸法跟踪检测多糖，在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果表明，组分I、II、III过Sephacryl S-400HR后是一个对称峰，说明此组分为单一组分，将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易溶于水。
实施例4
1.蕨菜粗多糖的制备
取干蕨菜粉100g，粉碎过后过60目筛，加入100ml 90％乙醇在80℃回流浸提2小时。去掉乙醇后，加入1800ml水，在68℃水浴上提取2次，每次3小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4∶1，充分振荡，静置10分钟，4500rpm离心10分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在58℃减压蒸馏浓缩，取上清液，然后用2倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。最后沉淀在-60℃真空冷冻干燥9小时后得粗多糖。再用苯酚-硫酸法在490nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确定蛋白的含量。
2.蕨菜多糖的精制
将上述500mg粗多糖溶解于20ml去离子水中，4800rpm离心10分钟弃沉淀。将上清上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为7.6，浓度为20mmol/L的Tris-HCl作洗脱液，以浓度为0.4mol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集的产物用本发明所述的苯酚-硫酸法在490nm处检测光吸收值，得到三个吸收峰。分别收集三个吸收峰(组分I、II、III)，并在去离子水中透析脱盐。将透析后溶液浓缩，再分别上样于Sephacryl S-400HR柱，以去离子水作洗脱液，流速控制在2ml/min，同样用苯酚硫酸法跟踪检测多糖，在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果表明，组分I、II、III过Sephacryl S-400HR后是一个对称峰，说明此组分为单一组分，将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易溶于水。
实施例5
1.蕨菜粗多糖的制备
取干蕨菜粉100g，粉碎过后过60目筛，加入100ml 90％乙醇在80℃回流浸提2小时。去掉乙醇后，加入2200ml水，在62℃水浴上提取2次，每次3.5小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4∶1，充分振荡，静置10分钟，4500rpm离心10分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在53℃减压蒸馏浓缩，取上清液，然后用3倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。最后沉淀在-60℃真空冷冻干燥11小时后得粗多糖。再用苯酚-硫酸法在490nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确定蛋白的含量。
2.蕨菜多糖的精制
将上述500mg粗多糖溶解于20ml pH值为7.8，浓度为20mmol/L的Tris-HCl中，4800rpm离心10分钟弃沉淀。将上清上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为7.8的Tris-HCl作洗脱液，以浓度为0.1mol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集的产物用本发明所述的苯酚-硫酸法在490nm处检测光吸收值，得到三个吸收峰。分别收集三个吸收峰(组分I、II、III)，并在去离子水中透析脱盐。将透析后溶液浓缩，再分别上样于Sephacryl S-400HR柱，以去离子水作洗脱液，流速控制在2ml/min，同样用苯酚硫酸法跟踪检测多糖，在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果表明，组分I、II、III过Sephacryl S-400HR后是一个对称峰，说明此组分为单一组分，将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易溶于水。
实施例6
1.蕨菜粗多糖的制备
取干蕨菜粉100g，粉碎过后过60目筛，加入100ml 90％乙醇在80℃回流浸提2小时。去掉乙醇后，加入1600ml水，在62℃水浴上提取2次，每次2.5小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4∶1，充分振荡，静置10分钟，4500rpm离心10分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在52℃减压蒸馏浓缩，取上清液，然后用3倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。最后沉淀在-60℃真空冷冻干燥10小时后得粗多糖。再用苯酚-硫酸法在490nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确定蛋白的含量。
2.蕨菜多糖的精制
将上述500mg粗多糖溶解于20ml去离子水中，4800rpm离心10分钟弃沉淀。将上清上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为7.8，浓度为30mmol/L的Tris-HCl作洗脱液，以浓度为0.2mol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集的产物用本发明所述的苯酚-硫酸法在490nm处检测光吸收值，得到三个吸收峰。分别收集三个吸收峰(组分I、II、III)，并在去离子水中透析脱盐。将透析后溶液浓缩，再分别上样于Sephacryl S-400HR柱，以去离子水作洗脱液，流速控制在2ml/min，同样用苯酚硫酸法跟踪检测多糖，在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果表明，组分I、II、III过Sephacryl S-400HR后是一个对称峰，说明此组分为单一组分，将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易溶于水。
实施例7
1.蕨菜粗多糖的制备
取新鲜蕨菜粉100g，粉碎过后过60目筛，加入100ml 90％乙醇在80℃回流浸提2小时。去掉乙醇后，加入300ml水，在65℃水浴上提取2次，每次3小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4∶1，充分振荡，静置10分钟，4500rpm离心10分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在55℃减压蒸馏浓缩，取上清液，然后用2.5倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。
最后沉淀在-60℃真空冷冻干燥10小时后得粗多糖。再用苯酚-硫酸法在490nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确定蛋白的含量。
2.蕨菜多糖的精制
将上述500mg粗多糖溶解于20ml pH值为7.5，浓度为30mmol/L的Tris-HCl中，4800rpm离心10分钟弃沉淀。将上清上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为7.5的Tris-HCl作洗脱液，以浓度为0.4mol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集的产物用本发明所述的苯酚-硫酸法在490nm处检测光吸收值，得到三个吸收峰。分别收集三个吸收峰(组分I、II、III)，并在去离子水中透析脱盐。将透析后溶液浓缩，再分别上样于Sephacryl S-400HR柱，以去离子水作洗脱液，流速控制在2ml/min，同样用苯酚硫酸法跟踪检测多糖，在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果表明，组分I、II、III过Sephacryl S-400HR后是一个对称峰，说明此组分为单一组分，将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易溶于水。
Claims (9)
1.一种蕨菜多糖的提取分离方法，包括以下步骤：
1)取蕨菜粉碎过筛，用2～4倍90％乙醇在80～100℃回流浸提0.5～2小时；
2)去掉乙醇加水，在60～90℃水浴上提取2～3次，每次2～4小时；
3)将上述浸提液离心、弃沉淀，取上清液；
4)用Sevage方法脱去上清蛋白；
5)乙醇沉淀的方法分离：在脱去蛋白的溶液中加入2～3倍于该溶液体积的乙醇进行沉淀，离心收集沉淀，干燥，得粗多糖；
6)阴离子交换柱和凝胶排阻层析纯化多糖：取粗多糖溶于去离子水或Tris-HCl缓冲液，制成饱和溶液，离心弃沉淀，将上清样于阴离子交换柱DEAE-Sepharose Fast Flow，以上述的Tris-HCl为洗脱液，再用NaCl梯度洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测，收集单一峰，透析去离子后上样于凝胶排阻层析柱，以去离子水进行洗脱；用苯酚硫酸法跟踪检测，收集单一峰，冷冻干燥得纯化的单一蕨菜多糖；
步骤1)中所述的蕨菜是干蕨菜或新鲜蕨菜；步骤2)中水的用量是干蕨菜样品重量的15～25倍或新鲜蕨菜样品重量的3倍。
2.根据权利要求1所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在于，步骤2)中水的用量是干蕨菜样品重量的20倍，在60～75℃提取2.5～3.5小时。
3.根据权利要求2所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在于，步骤2)中的提取温度在62～68℃。
4.根据权利要求2所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在于，步骤2)中的提取温度是65℃，提取2次，每次3小时。
5.根据权利要求1所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在于，步骤5)中在-60℃真空冷冻干燥8～12小时。
6.根据权利要求1所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在于，步骤6)中的阴离子交换柱是DEAE-Sepharose Fast Flow柱；Tris-HCl缓冲液pH值为7～8，浓度为10～50mmol/L；NaCl梯度洗脱液浓度为0.2～0.8mol/L。
7.根据权利要求1所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在于，凝胶排阻层析柱是Sephacryl S-400HR或Sephadex G-100柱。
8.根据权利要求1所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在于，步骤6)中采用流动水透析；Tris-HCl和去离子水洗脱的流速控制在2ml/min。
9.根据权利要求1所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在于，步骤4)中的Sevage方法是：在上清液中加等体积的氯仿-正丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4∶1，充分震荡后静置10分钟，4000～6000rpm离心10分钟，反复多次直至完全脱去蛋白；步骤6)中所述的苯酚-硫酸法为：将0.2ml样品用蒸馏水稀释到2ml，加入6％的苯酚溶液1ml，再加入5ml浓硫酸，反应30分钟后再用紫外分光光度计在490nm出检测OD值。
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