CN102503921A - 两种新化合物蕨菜高黄烷醇ⅰ和蕨菜高黄烷醇ⅱ及其分离鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了两种新化合物蕨菜高黄烷醇Ⅰ、蕨菜高黄烷醇Ⅱ的分离制备方法及结构鉴定方法。本发明蕨菜高黄烷醇Ⅰ、蕨菜高黄烷醇Ⅱ的结构式如下。

Description

两种新化合物蕨菜高黄烷醇Ⅰ和蕨菜高黄烷醇Ⅱ及其分离鉴定方法

技术领域

本发明涉及两种新的化合物——蕨菜高黄烷醇Ⅰ(C₁₆H₁₆O₆)、蕨菜高黄烷醇Ⅱ(C₂₂H₁₈O₇)及其分离鉴定方法。

技术背景

黄烷醇类化合物是指以2-苯基二氢色原酮为母核而C-3、C-4羟基化衍生的一类化合物，高黄烷醇是指B环通过一个亚甲基与C环的C-2位相连的一类黄烷醇类化合物。黄烷醇类化合物是多种药用植物的有效成分之一。由于其显著的生物、药理活性及独特的可塑性结构，近百年来引起化学工作者们浓厚的研究兴趣。据有关文献报道，许多黄烷酮类化合物具有抗菌、抗炎、抗HIV病毒、抗肿瘤、抗诱变、抗氧化等诸多活性，可用于生产药物、保健(功能)食品、功能性化妆品及食品抗氧化剂等广泛领域，是一类研究价值高、应用前景广的化合物。

蕨菜(Pteridium aquilinum)别名拳头菜、龙爪菜、如意菜等，其根茎或全草可入药，具有较高的药用价值。现代药理研究表明：蕨菜富含黄酮，其70％乙醇提取物(主要成分为黄酮)具有显著的体外抗氧化、降血脂、抗肿瘤等作用，但截止目前，蕨菜乙醇提取物体外抗氧化、降血脂、抗肿瘤药物等活性确切物质基础尚未见相关研究报道。为了探讨蕨菜药理活性的物质基础，从中寻找具有药用价值的生物活性成分，揭示蕨菜总黄酮抗氧化、降血脂等药理活性机制，我们对蕨菜对蕨菜中黄酮类化合物进行了系统分离研究，从其乙酸乙酯萃取部位通过硅胶柱层析、凝胶柱层析、制备薄层等分离技术获得两个新的黄烷醇类化合物——蕨菜高黄烷醇Ⅰ、蕨菜高黄烷醇Ⅱ。

发明内容

本发明的目的在于提供两种新化合物蕨菜高黄烷醇Ⅰ、蕨菜高黄烷醇Ⅱ，为生产药物、保健食品、功能性化妆品及食品抗氧化剂提供候选化合物；本发明的另一个目的是提供一种以蕨菜为原料，分离提取蕨菜高黄烷醇Ⅰ、蕨菜高黄烷醇Ⅱ的方法；本发明的第三个目的是提供蕨菜高黄烷醇Ⅰ、蕨菜高黄烷醇Ⅱ的结构鉴定方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的

一种新的化合物——蕨菜高黄烷醇Ⅰ，其结构式如下：

本发明化合物——蕨菜高黄烷醇Ⅰ还可以制备成含有上述结构式的化合物及其盐或衍生物，其中蕨菜高黄烷醇Ⅰ的盐或衍生物可以使用但不限于如下五种：

A.该化合物的3-OH与2′-OH可以发生分子内脱水生成醚衍生物，示例结构式为：

B.该化合物的3-OH、4-OH、6-OH、2′-OH与4′-OH可以分别、部分或同时甲基化，生成蕨菜高黄烷醇Ⅰ甲基化衍生物，示例结构式为：

C.该化合物的6-OH、2′-OH与4′-OH可分别或同时与Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等金属离子结合生成金属盐衍生物，示例衍生物结构式为：

D.该化合物的6-OH、2′-OH与4′-OH可分别或同时与酸、酸酐或酰卤生成酯类化合物物，如与甲酸、乙酸或醋酐、丙酸或丙酸酐、丁酸或丁酸酐、苯甲酸或苯甲酸酐等小分子有机酸、酸酐或酰卤生成有机酸酯，示例衍生物结构式为：

E.该化合物7-OH与葡萄糖、鼠李唐、木糖、甘露糖等单糖或由上述单糖聚合形成的双糖、三糖等寡糖结合，生成苷类化合物，示例结构式为：

本发明另一种新的化合物——蕨菜高黄烷醇Ⅱ，其结构式如下：

本发明化合物——蕨菜高黄烷醇Ⅱ还可以制备成含有上述结构式的化合物及其盐或衍生物，其中蕨菜高黄烷醇Ⅱ的盐或衍生物可以使但不限于如下3种：

A.该化合物的C-4与C-5间的醚键及C3与C6′间的醚键可以发生水解开环形成多羟基衍生物，示例结构式为：

B.该化合物的以2″-OH、3″-OH分别或同时甲基化，生成蕨菜高黄烷醇Ⅱ甲基化衍生物，示例结构式为：

C.该化合物的2″-OH、3″-OH分别或同时与Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等金属离子结合生成金属盐衍生物，示例衍生物结构式为：

蕨菜高黄烷醇Ⅰ的理化性质为：黄色块状结晶，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，难溶于氯仿、石油醚、乙醚。365nm紫外下显黄棕色荧光，AlCl₃显黄色。

蕨菜高黄烷醇Ⅱ的理化性质为：黄色粉末，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，难溶于氯仿、石油醚、乙醚。365nm紫外下显黄棕色荧光，AlCl₃显黄色。

本发明中两种新化合物——蕨菜高黄烷醇Ⅰ、蕨菜高黄烷醇Ⅱ是通过如下方法和步骤分离得到的：

1.取干蕨菜粉碎，过40目筛，获得干蕨菜粉；

2.步骤1的干蕨菜粉，以乙醚为脱脂剂、采用索氏提取法45～50℃下脱脂至乙醚回流液无色，取出干蕨菜粉，挥尽干蕨菜粉中残留的乙醚，获脱脂蕨菜粉。

3.步骤2所获脱脂蕨菜粉将脱脂蕨菜粉按料液比1∶10(g∶mL)加入80％的乙醇，温度80℃冷凝回流提取3～5小时，提取3次，过滤，合并3次的滤液，即为脱脂蕨菜粉80％的乙醇提取液。

4.将步骤3所获脱脂蕨菜粉80％乙醇提取液，在旋转蒸发器中，在温度60～65℃条件下，减压回收乙醇至提取液无乙醇味，获得浓缩液；在浓缩液中加入蒸馏水稀释至密度1.1～1.3g/mL；再加入与浓缩液等体积的石油醚萃取，石油醚萃取操作中，上层为萃取液石油醚，下层为水溶液A；萃取6～10次，合并萃取液石油醚；回收萃取液石油醚中的石油醚，剩余的残渣为石油醚相；水溶液A经温度65～70℃水浴加热，浓缩并挥去水溶液A中残留的石油醚，调节水溶液A的密度为1.1～1.3g/mL，加入与水溶液A等体积的氯仿萃取，氯仿萃取操作中，下层为萃取液氯仿，上层为水溶液B，萃取6～10次，合并萃取液氯仿，回收萃取液氯仿，剩余的残渣为氯仿相；水溶液B经65～70℃水浴加热，浓缩并挥去残留的氯仿，调节水溶液B的密度为1.1～1.3g/mL，加入与水溶液B等体积的乙酸乙脂萃取，乙酸乙脂萃取操作中，上层为乙酸乙脂萃取液，下层为水溶液C，萃取6～10次，合并乙酸乙脂萃取液，回收乙酸乙脂萃取液中的乙酸乙脂，剩余的残渣为蕨菜粉80％乙醇提取液的乙酸乙脂相。

5.将步骤4所获80％乙醇提取液的乙酸乙脂相在温度60～70℃条件下烘干得烘干物，加按质量体积比50mg∶1mL，将烘干物溶解于甲醇中，按烘干物的质量加入200～300目硅胶搅拌均匀，挥去甲醇，得到上柱样品；取烘干物质量10倍的200～300目硅胶干法装柱，将上柱样品干法上样，乙酸乙酯为洗脱剂洗脱，回收乙酸乙酯，残渣为乙酸乙酯洗脱部分以硅胶柱乙酸乙酯系统洗脱粗分，获得乙酸乙酯洗脱部位。

6.将步骤5所获乙酸乙酯洗脱部位按质量体积比50mg∶1mL，加入90％的甲醇水溶液，使其溶解，用微孔滤膜过滤，滤液采用葡聚糖凝胶柱以90％的甲醇水溶液洗脱，每5～10mL为1馏分，对每个馏分采用薄层层析(TLC)检测，根据薄层层析(TLC)检测结果对成分相同的馏分进行合并，获得6个段，分别命名为乙1、乙2、乙3、乙4、乙5、乙6，其中乙3段以氯仿-甲醇＝1∶1系统经葡聚糖凝胶柱再次柱层析，获得粗单体P1和粗单体P2，粗单体P1的主成分为蕨菜高黄烷醇Ⅰ，其含量50～53％，粗单体P2的主成分为蕨菜高黄烷醇Ⅱ，其含量40～45％。

7.将步骤6所获得粗单体P1、粗单体P2将粗单体P1和粗单体P2分别以薄层硅胶制备硅胶板，进行制备分离，分别获得纯度为80％的蕨菜高黄烷醇Ⅰ和纯度为85％的蕨菜高黄烷醇Ⅱ；将纯度为80％的蕨菜高黄烷醇Ⅰ和纯度为85％的蕨菜高黄烷醇Ⅱ分别进行葡聚糖凝胶柱以甲醇洗脱，甲醇重结晶，分别获得纯度高达98.9％蕨菜高黄烷醇Ⅰ、纯度高达98.2％的蕨菜高黄烷醇Ⅱ。

本发明新化合物蕨菜高黄烷醇Ⅰ的结构鉴定方法为：

黄色块状结晶(甲醇)，AlCl₃、HCl-Mg粉反应均为阳性，说明该化合物为黄酮类化合物。ESI-MS给出分子离子峰m/z 305.1306[M+H]⁺，推断该化合物的分子式可能为C₁₆H₁₆O₆；在¹H-NMR谱上可见6个芳环质子信号δ_H7.48(1H，bd，J＝16.0Hz)、7.04(1H，d，J＝2.0Hz)、6.24(1H，bd，J＝16.0Hz)、7.01(1H，dd，J＝1.5，8.0Hz)、6.76(1H，d，J＝8.0Hz)、6.68(1H，s)(附图1、表1)，三个黄酮类化合物的特征苯环羟基氢信号δ_H12.4，δ_H9.6，δ_H9.1(附图1)，说明该黄酮类化合物的苯环存在3羟基取代；在该化合物的¹³C-NMR谱DEPT谱显示16个碳信号(附图2、表1)，其中3个为与氧相连叔碳(CH)原子信号δc69.8，δc67.7，δc65.4，1个为仲碳(CH₂)原子(附图3、表1)；综合分析HSQC与¹H，¹H-COSY测定结果可知，在该化合物中的3个与氧相连叔碳原子δc69.8，δc67.7，δc65.4与仲碳原子δc27.6相连(附图4、6)，命名为片段a：-δc27.6-δc69.8-δc67.7-δc65.4-(附图7)，考虑到该化合物¹H-NMR谱上只有2个烷烃碳相连羟基质子信号δ_H5.0，δ_H5.0，因此，δc69.8、δc67.7、δc65.4是该黄酮类化合物的C环中的3个碳原子，且δc69.8、δc67.7、δc65.4分别是该黄酮类化合物C环上的C-2、C-3与C-4，综合上述结果分析，推测该化合物是黄烷醇类化合物。

进一步分析¹H，¹H-COSY(附图6)测定结果发现：在该黄酮类化合物上除了存在片段a外还有片段b：-δc121.3-δc115.7-，片段c：-δc145.3-δc114.0-(附图7)。HMBC谱(附图5)显示，δc121.3的氢与δc138.5、δc145.5、δc167.4相关，δc115.7的氢与δc125.5相关(附图7)，说明片段b与δc138.5、δc145.5、δc167.4、δc125.5为同一苯环上的碳原子；片段c上的δc145.3的氢与δc114.9、δc127.9、δc166.0、δc127.9相关，说明片段c与δc114.9、δc127.9、δc166.0、δc127.9为同一苯环上的碳原子；HMBC谱上叔碳δc27.6的氢δ_H2.67与δ_H2.19与季碳δc127.9、δc166.0相关，表明片段c所在的苯环环为该黄酮类化合物的B环，B环通过通过亚甲基δc27.6与C环上的C-2相连，因此，推断该化合物(蕨菜高黄烷醇Ⅰ)的结构式为：

本发明新化合物蕨菜高黄烷醇Ⅱ的结构鉴定方法为：

黄色粉末(甲醇)，AlCl₃、HCl-Mg粉反应均为阳性，说明该化合物为黄酮类化合物。ESI-MS给出分子离子峰m/z 409.1201[M+H]⁺，推断该化合物的分子式可能为C₂₂H₁₈O₇；在¹H-NMR谱上可见6个芳环质子信号δ_H7.46、δ_H6.42、δ_H6.28、δ_H7.04、δ_H6.95、δ_H6.73、δ_H6.68(附图8，表2)，提示该化合物可能是黄酮类化合物。此外，在¹H-NMR谱上未见芳环羟基质子信号，提示在该黄酮的苯环上无游离羟基；在该化合物的¹³C-NMR谱DEPT谱显示22个碳信号(附图9、附图10、表2)，其中6个为与氧相连叔碳(CH)原子信号δc70.6、δc70.2、δc69.9、δc69.4、δc67.1、δc66.0，1个为仲碳(CH₂)原子(附图10，表2)，进一步综合分析HSQC与¹H，¹H-COSY测定结果可知，在该化合物中的6个与氧相连叔碳原子与仲碳原子(附图11、附图13)连成2个片段(命名为a和b)，片段a为：-δc30.4-δc70.6-δc69.9-δc67.1-，片段b：-δc130.9-δc66.0-δc69.4-δc70.2-δc125.9-(附图14)，因为δc130.9与δc125.9均为叔碳(附图10，表2)，因此，片段a上的δc70.6、δc69.9、δc67.1分别是该黄酮的C环上的2、3、4位上的3个碳原子，δc30.4为该黄酮C环的C-2(δc70.6)与B环相连的亚甲基(C-11)，所以该化合物也是高黄烷醇类化合物。

对¹H，¹H-COSY谱的进一步分析显示，在该黄酮类化合物上除了存在片段a、b外还有片段c：-δc115.1-δc121.3-δc116.2-，片段d：-δc113.7-δc145.2-113.7-(附图14)。HMBC谱显示(附图13)，片段c上的碳δc115.1相连的氢与δc146.3、δc149.8相关，δc121.3与δc166.3相关(附图14)，说明片段c与δc146.3、δc149.8、δc166.3为同一苯环上的碳；片段d上的碳δc113.7相连的氢与δc134.9相关，δc145.2相连的氢δc124.8、δc166.5相关(附图14)，说明片段d与δc134.9、δc124.8、δc166.5为同一苯环上的碳；HMBC谱上还显示叔碳δc30.4的氢δ_H2.74与δ_H2.11与δc134.9相关(附图14)，表明片段d所在的苯环为该黄酮类化合物的B环，B环通过通过亚甲基δc30.4与C环上的C-2相连。

与蕨菜高黄烷醇Ⅰ对比，在该化合物¹H-NMR谱上未见C环2个烷烃碳相连羟基质子信号δ_H5.0，δ_H5.0以及芳环质子信号，因此，在该高黄烷醇中，存在δc69.9(C-3)与季碳δc166.47(C-6′)、δc67.1(C-4)与季碳δc149.84(C-5)间通过C-O键相连。

在该化合物的NOESY谱上(附图15)，片段b(-δc130.9-66.0-69.4-70.2-125.9-)上的碳δc130.9相连的氢δ_H6.42与该黄酮C环上δc70.6的氢(H-2)、δc69.9的氢(H-3)、δc30.4的氢(H-11)相关，δc66.02相连的氢δ_H4.17与该黄酮C环上δc70.6的氢(H-2)、δc69.9的氢(H-3)、δc30.4的氢(H-11)相关，δc125.9的氢δ_H6.28与B环上氢δ_H7.46相关，考虑到HMBC谱上δc30.4的氢(H-11)与羰基碳δc170.71相关，在化合物中片段b通过酯间与B环的C-2相连。

综合上述分析推断该化合物(蕨菜高黄烷醇Ⅱ)的结构式为：

附图说明：

图1.蕨菜高黄烷醇Ⅰ的核磁共振氢谱(¹H-NMR谱)图，

图2.蕨菜高黄烷醇Ⅰ的核磁共振碳谱(¹³C-NMR谱)图，

图3.蕨菜高黄烷醇Ⅰ的无畸变极化转移增强谱(DEPT谱)图，

图4.蕨菜高黄烷醇Ⅰ的异核多量子相关谱(HSQC谱)图，

图5.蕨菜高黄烷醇Ⅰ的异核多键相关谱(HMBC谱)图，

图6.蕨菜高黄烷醇Ⅰ的H、H相关谱(¹H，¹H cosy谱)图，

图7.蕨菜高黄烷醇Ⅰ的HMBC及¹H-¹H cosy测定结果分析图，

图8.蕨菜高黄烷醇Ⅱ的核磁共振氢谱(¹H-NMR谱)图，

图9.蕨菜高黄烷醇Ⅱ的核磁共振碳谱(¹³C-NMR谱)图，

图10.蕨菜高黄烷醇Ⅱ的无畸变极化转移增强谱(DEPT谱)图，

图11.蕨菜高黄烷醇Ⅱ的异核多量子相关谱(HSQC谱)图，

图12.蕨菜高黄烷醇Ⅱ的异核多键相关谱(HMBC谱)图，

图13.蕨菜高黄烷醇Ⅱ的H、H相关谱(¹H，¹H cosy谱)图，

图14.蕨菜高黄烷醇Ⅱ的HMBC及¹H-¹H cosy测定结果分析图，

图15.蕨菜高黄烷醇Ⅱ的NOESY谱图。

下述实验例和实施例用于进一步但不限于本发明

实验例1 蕨菜高黄烷醇Ⅰ结构鉴定实验

蕨菜高黄烷醇Ⅰ的¹HNMR(500MHz，in DMSO-d6)、¹³C-NMR(500MHz，inDMSO-d6)及二维波谱数据：

表1.蕨菜高黄烷醇Ⅰ的NMR测定结果

实验例2 蕨菜高黄烷醇Ⅱ结构鉴定实验

蕨菜高黄烷醇Ⅱ的¹HNMR(500MHz，in DMSO-d6)、¹³C-NMR(500MHz，in DMSO-d6)及二维波谱数据：

表2.蕨菜高黄烷醇Ⅱ的NMR测定结果

具体实施方式

实施例1

化合物蕨菜高黄烷醇Ⅰ，其结构如下：

化合物蕨菜高黄烷醇Ⅱ，其结构如下：

其分离方法为：

取干蕨菜5000g，粉碎，过40目筛，获得蕨菜干粉。将蕨菜干粉以乙醚为脱脂剂、采用索氏提取法45～50℃下脱脂至乙醚回流液无色，取出蕨菜干粉，挥尽蕨菜干粉中残留的乙醚，获脱脂蕨菜粉，加入50升80％的乙醇，温度80℃冷凝回流提取5小时，提取5次，过滤，合并5次的滤液，即为脱脂蕨菜粉80％的乙醇提取液。脱脂蕨菜粉80％的乙醇提取液在旋转蒸发器中在温度60℃条件下，减压回收乙醇至提取液无乙醇味，获得浓缩液；在浓缩液中加入蒸馏水稀释至密度1.1g/mL；再加入与浓缩液等体积的石油醚萃取，石油醚萃取操作中，上层为萃取液石油醚，下层为水溶液A；萃取10次，合并萃取液石油醚；回收萃取液石油醚中的石油醚，剩余的残渣为石油醚相；水溶液A经温度65℃水浴加热，浓缩并挥去水溶液A中残留的石油醚，调节水溶液A的密度为1.1g/mL，加入与水溶液A等体积的氯仿萃取，氯仿萃取操作中，下层为萃取液氯仿，上层为水溶液B，萃取10次，合并萃取液氯仿，回收萃取液氯仿，剩余的残渣为氯仿相；水溶液B经65℃水浴加热，浓缩并挥去残留的氯仿，调节水溶液B的密度为1.1～g/mL，加入与水溶液B等体积的乙酸乙脂萃取，乙酸乙脂萃取操作中，上层为乙酸乙脂萃取液，下层为水溶液C，萃取10次，合并乙酸乙脂萃取液，回收乙酸乙脂萃取液中的乙酸乙脂，剩余的残渣为蕨菜粉80％乙醇提取液的乙酸乙脂相；将蕨菜粉80％乙醇提取液的乙酸乙脂相在温度60℃条件下烘干得烘干物54g，将烘干物溶解于200mL甲醇中，加入200～300目硅胶54g搅拌均匀，挥去甲醇，得到上柱样品；取540g的200～300目硅胶干法装柱、墩实，将上柱样品干法上样，用洗耳球轻轻敲击玻璃层析柱使样品的上表面平整，在样品层上面加入50g 200～300目硅胶作为保护硅胶，乙酸乙酯为洗脱剂等度洗脱，共洗脱100L，回收乙酸乙酯，获残渣4.25g，为乙酸乙酯洗脱部分；在乙酸乙酯洗脱部分加入5mL 90％的甲醇水溶液，使其溶解，用微孔滤膜过滤，滤液采用葡聚糖凝胶LH20柱以90％的甲醇水溶液洗脱，每5为1馏分，共洗脱68个流份，对每个馏分采用薄层层析(TLC)365nm紫外下检测，结果显示1～3流份、4～9流份，10～31流份、32～45流份、46～59流份、60～68流份具有相近的成分，对成分相近的流份分别进行合并，获得6个段，依次命名为乙1(1～3流份)、乙2(4～9流份)、乙3(10～31流份)、乙4(32～45流份)、乙5(46～59流份)、乙6(60～68流份)，其中乙3段以氯仿-甲醇＝1∶1系统经葡聚糖凝胶柱再次柱层析，获得粗单体P1和粗单体P2，粗单体P1的主成分为蕨菜高黄烷醇Ⅰ，其含量53％，粗单体P2的主成分为蕨菜高黄烷醇Ⅱ，其含量45％；将粗单体P1和粗单体P2分别以薄层硅胶制备硅胶板，进行制备分离，分别获得纯度为80％的蕨菜高黄烷醇Ⅰ和纯度为85％的蕨菜高黄烷醇Ⅱ；将纯度为80％的蕨菜高黄烷醇Ⅰ和纯度为85％的蕨菜高黄烷醇Ⅱ分别再次进行葡聚糖凝胶LH柱层析以甲醇为洗脱剂洗脱，甲醇重结晶，分别获得纯度高达98.9％蕨菜高黄烷醇Ⅰ0.004g、纯度高达98.2％的蕨菜高黄烷醇Ⅱ0.08g。

实施例2

化合物蕨菜高黄烷醇Ⅰ，其结构如下：

化合物蕨菜高黄烷醇Ⅱ，其结构如下：

其分离方法为：

取干蕨菜20000g，粉碎，过40目筛，获得蕨菜干粉。将蕨菜干粉以乙醚为脱脂剂、采用索氏提取法50℃下脱脂至乙醚回流液无色，取出蕨菜干粉，挥尽蕨菜干粉中残留的乙醚，获脱脂蕨菜粉，加入100升80％的乙醇，温度80℃冷凝回流提取3小时，提取3次，过滤，合并3次的滤液，即为脱脂蕨菜粉80％的乙醇提取液。脱脂蕨菜粉80％的乙醇提取液在旋转蒸发器中在温度60℃条件下，减压回收乙醇至提取液无乙醇味，获得浓缩液；在浓缩液中加入蒸馏水稀释至密度1.3g/mL；再加入与浓缩液等体积的石油醚萃取，石油醚萃取操作中，上层为萃取液石油醚，下层为水溶液A；萃取6次，合并萃取液石油醚；回收萃取液石油醚中的石油醚，剩余的残渣为石油醚相；水溶液A经温度65℃水浴加热，浓缩并挥去水溶液A中残留的石油醚，调节水溶液A的密度为1.3g/mL，加入与水溶液A等体积的氯仿萃取，氯仿萃取操作中，下层为萃取液氯仿，上层为水溶液B，萃取6次，合并萃取液氯仿，回收萃取液氯仿，剩余的残渣为氯仿相；水溶液B经65℃水浴加热，浓缩并挥去残留的氯仿，调节水溶液B的密度为1.3g/mL，加入与水溶液B等体积的乙酸乙脂萃取，乙酸乙脂萃取操作中，上层为乙酸乙脂萃取液，下层为水溶液C，萃取6次，合并乙酸乙脂萃取液，回收乙酸乙脂萃取液中的乙酸乙脂，剩余的残渣为蕨菜粉80％乙醇提取液的乙酸乙脂相；将蕨菜粉80％乙醇提取液的乙酸乙脂相在温度60℃条件下烘干得烘干物196g，将196g烘干物溶解于500mL甲醇中，加入200～300目硅胶200g搅拌均匀，挥去甲醇，得到上柱样品；取1000g的200～300目硅胶干法装柱、墩实，将上柱样品干法上样，用洗耳球轻轻敲击玻璃层析柱使样品的上表面平整，在样品层上面加入100g 200～300目硅胶作为保护硅胶，乙酸乙酯为洗脱剂等度洗脱，共洗脱500L，回收乙酸乙酯，获残渣14.13g，为乙酸乙酯洗脱部分；在乙酸乙酯洗脱部分加入14mL 90％的甲醇水溶液，使其溶解，用微孔滤膜过滤，滤液采用葡聚糖凝胶LH20柱以90％的甲醇水溶液洗脱，每10ml为流份，共洗脱132个流份，对每个馏分采用薄层层析(TLC)365nm紫外下检测，结果显示1～15流份、16～29流份，30～81流份、82～105流份、106～119流份、120～132流份具有相近的成分，对成分相近的流份分别进行合并，获得6个段，依次命名为乙1(1～15流份)、乙2(16～29流份)、乙3(30～81流份)、乙4(82～105流份)、乙5(106～119流份)、乙6(120～132流份)。其中乙3段蒸干后获残渣1.31g，溶于1.5ml氯仿-甲醇溶液(氯仿∶甲醇＝1∶1)，微孔滤膜过滤，经葡聚糖凝胶LH20柱再次柱层析，以氯仿-甲醇＝1∶1系统等度洗脱，每3ml为1流分，共洗脱42个流份，365nm紫外下GF254硅胶板薄层层析检测显示，21～39流份具有相近的成分，将之合并，获得粗单体P1(230mg)，6～18流份具有相近的成分，将之合并，获得粗单体P2(810mg)，粗单体P1的主成分为蕨菜高黄烷醇Ⅰ，其含量50％，粗单体P2的主成分为蕨菜高黄烷醇Ⅱ，其含量40％；将粗单体P1和粗单体P2分别以薄层硅胶制备硅胶板，进行制备分离，分别获得纯度为80％的蕨菜高黄烷醇Ⅰ和纯度为85％的蕨菜高黄烷醇Ⅱ；将纯度为80％的蕨菜高黄烷醇Ⅰ和纯度为85％的蕨菜高黄烷醇Ⅱ分别再次进行葡聚糖凝胶LH柱层析以甲醇为洗脱剂洗脱，甲醇重结晶，分别获得纯度98.0％蕨菜高黄烷醇Ⅰ0.013g、纯度97.6％的蕨菜高黄烷醇Ⅱ0.22g。

实施例3

蕨菜高黄烷醇Ⅰ可以3-OH与2′-OH可以发生分子内脱水生成醚衍生物：

实施例4

蕨菜高黄烷醇Ⅰ的3-OH、4-OH、6-OH、2′-OH与4′-OH可以分别、部分或同时甲基化，生成蕨菜高黄烷醇Ⅰ甲基化衍生物：

实施例5

蕨菜高黄烷醇Ⅰ的6-OH、2′-OH与4′-OH可分别或同时与Na⁺、K⁺等金属离子结合生成金属盐衍生物：

实施例6

蕨菜高黄烷醇Ⅰ的6-OH、2′-OH与4′-OH可分别或同时与酸、酸酐或酰卤生成酯类化合物物，如与甲酸苯甲酸酐等小分子有机酸、酸酐生成有机酸酯：

实施例7

蕨菜高黄烷醇Ⅰ的7-OH与葡萄糖、甘露糖等单糖或由上述单糖聚合生成苷类化合物：

实施例8

蕨菜高黄烷醇Ⅱ的C-4与C-5间的醚键及C3与C6′间的醚键可以发生水解开环形成多羟基衍生物：

实施例9

蕨菜高黄烷醇Ⅱ的2″-OH、3″-OH分别或同时甲基化，生成蕨菜高黄烷醇Ⅰ甲基化衍生物：

实施例10

蕨菜高黄烷醇Ⅱ的2″-OH、3″-OH分别或同时与Na⁺、K⁺等金属离子结合生成金属盐衍生物：

Claims (8)

1.一种新的化合物蕨菜高黄烷醇Ⅰ，其特征在于该化合物的化学结构式为：

            。

2. 一种新的化合物蕨菜高黄烷醇Ⅱ，其特征在于该化合物的化学结构式为：

                         。

3.一种药物，其特征在于该药物含有如下结构式的化合物及其盐或衍生物：

                。

4.一种药物，其特征在于该药物含有如下结构式的化合物及其盐或衍生物：

                               。

5.如权利要求1、权利要求2所述的蕨菜高黄烷醇Ⅰ、蕨菜高黄烷醇Ⅱ的提取分离方法，其特征在于操作步骤如下：

5.1、取干蕨菜粉碎，过40目筛，获得蕨菜干粉；

5.2、将蕨菜干粉以乙醚为脱脂剂、采用索氏提取法45～50℃下脱脂至乙醚回流液无色，取出蕨菜干粉，挥尽蕨菜干粉中残留的乙醚，获脱脂蕨菜粉；

5.3、将脱脂蕨菜粉按料液比1:10（g: mL）加入80%的乙醇，温度80℃冷凝回流提取3～5小时，提取3次，过滤，合并3次的滤液，即为脱脂蕨菜粉80%的乙醇提取液；

5.4、在旋转蒸发器中，脱脂蕨菜粉80%的乙醇提取液在温度60～65℃条件下，减压回收乙醇至提取液无乙醇味，获得浓缩液；在浓缩液中加入蒸馏水稀释至密度1.1～1.3g/mL；再加入与浓缩液等体积的石油醚萃取，石油醚萃取操作中，上层为萃取液石油醚，下层为水溶液A；萃取6～10次，合并萃取液石油醚；回收萃取液石油醚中的石油醚，剩余的残渣为石油醚相；水溶液A经温度65～70℃水浴加热，浓缩并挥去水溶液A中残留的石油醚，调节水溶液A的密度为1.1～1.3g/mL，加入与水溶液A等体积的氯仿萃取，氯仿萃取操作中，下层为萃取液氯仿，上层为水溶液B，萃取6～10次，合并萃取液氯仿，回收萃取液氯仿，剩余的残渣为氯仿相；水溶液B经65～70℃水浴加热，浓缩并挥去残留的氯仿，调节水溶液B的密度为1.1～1.3g/mL，加入与水溶液B等体积的乙酸乙脂萃取，乙酸乙脂萃取操作中，上层为乙酸乙脂萃取液，下层为水溶液C，萃取6～10次，合并乙酸乙脂萃取液，回收乙酸乙脂萃取液中的乙酸乙脂，剩余的残渣为蕨菜粉80%乙醇提取液的乙酸乙脂相； 

5.5、将蕨菜粉80%乙醇提取液的乙酸乙脂相在温度60～70℃条件下烘干得烘干物，加按质量体积比50mg:1mL，将烘干物溶解于甲醇中，按烘干物的质量加入200～300目硅胶搅拌均匀，挥去甲醇，得到上柱样品；取烘干物质量10倍的200～300目硅胶干法装柱，将上柱样品干法上样，乙酸乙酯为洗脱剂洗脱，回收乙酸乙酯，残渣为乙酸乙酯洗脱部分；

5.6、加按质量体积比50mg:1mL，在乙酸乙酯洗脱部分加入90%的甲醇水溶液，使其溶解，用微孔滤膜过滤，滤液采用葡聚糖凝胶柱以90%的甲醇水溶液洗脱，每5～10mL为1馏分，对每个馏分采用薄层层析（TLC）检测，根据薄层层析（TLC）检测结果对成分相同的馏分进行合并，获得6个段，分别命名为乙1、乙2、乙3、乙4、乙5、乙6，其中乙3段以氯仿-甲醇=1:1系统经葡聚糖凝胶柱再次柱层析，获得粗单体P1和粗单体P2 ，粗单体P1的主成分为蕨菜高黄烷醇Ⅰ，其含量50～53%，粗单体P2的主成分为蕨菜高黄烷醇Ⅱ，其含量40～45%；

5.7、将粗单体P1和粗单体P2分别以薄层硅胶制备硅胶板，进行制备分离，分别获得纯度为80%的蕨菜高黄烷醇Ⅰ和纯度为85%的蕨菜高黄烷醇Ⅱ；将纯度为80%的蕨菜高黄烷醇Ⅰ和纯度为85%的蕨菜高黄烷醇Ⅱ分别进行葡聚糖凝胶柱以甲醇洗脱，甲醇重结晶，分别获得纯度高达98.9%蕨菜高黄烷醇Ⅰ、纯度高达98.2%的蕨菜高黄烷醇Ⅱ。

6.根据权利要求5所述的蕨菜高黄烷醇的提取分离方法，其特征在于：所述微孔滤膜过滤的滤膜孔径为0.45μm。

7.根据权利要求5所述的蕨菜高黄烷醇的提取分离方法，其特征在于：所述TLC检测的检测条件为：硅胶GF254薄层板，乙酸乙酯：甲醇：水=20:1:0.5为展开剂，365nm紫外下检测。

8.根据权利要求5所述的蕨菜高黄烷醇的提取分离方法，其特征在于：所述葡聚糖凝胶柱型号为Sephadex LH20。

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