CN101066960A - 蕨类植物提取异黄酮生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蕨类植物提取黄酮生产工艺,其特征是:取新鲜蕨根烘干后用索氏提取法脱脂及除脂溶性色素,将蕨菜干粉放在烧瓶中加入体积分数乙醇提取蕨菜总黄酮。合并所有浸提液并适当浓缩加入石油醚,将脱脂后的粗黄酮液粉碎加水上聚酰胺柱,用蒸馏水洗后用乙醇洗脱,再烘2小时,得精制黄酮粉。本发明的有益效果在于:蕨根中总黄酮含量比银杏叶等要高,为蕨根干重的7.28%。用70%乙醇浸提可得到约为蕨根干重1/4的粗黄酮粉,其黄酮含量27.03%,蕨根是获取黄酮类化合物的良好来源。蕨根黄酮类化合物表现出较强的消除自由能力,具有显著的阻断亚油酸、猪油过氧化作用,表现出很强的抗氧化能力,而且还能去除油脂中已有的过氧化物,降低油脂的过氧化值。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种蕨类植物提取异黄酮生产工艺。
背景技术
黄酮是指黄酮类化合物,黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。
黄酮是一大类天然产物,广泛存在于植物界,是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇,其它包括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。近年来,由于自由基生命科学的进展,使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。类黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。它们对健康的好处有:抗炎症、抗过敏、抑制细菌、抑制寄生虫、抑制病毒、防治肝病、防治血管疾病、防治血管栓塞、防治心与脑血管疾病、抗肿瘤、抗化学毒物等。天然来源的生物黄酮分子量小,能被人体迅速吸收,能通过血脑屏障,能时入脂肪组织,进而体现出如下功能:消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。
近年来国内外对茶多酚、银杏类黄酮等的药理和营养性的广泛深入的研究和临床试验,证实类黄酮既是药理因子,又是重要的营养因子为一种新发现的营养素,对人体具有重要的生理保健功效。目前,很多著名的抗氧化剂和自由基清除剂都是类黄酮。随着对生物总黄酮与人类营养关系研究的深入,不远的将来可能证明黄酮类化合物是人类必需的微营养素或者是必需的食物因子。
现阶段人们常见的天然类黄酮有大豆异黄酮,甘草黄酮,银杏黄酮等,而对于蕨类植物中提取黄酮的方法,则未见有报道。蕨根司属中的蕨(Pteridiumaquil-inumL.)的幼嫩叶,因其生长在山林野地,少受污染,加之富含对人体有益的多种营养成分,近年来已成为深受人们喜爱的山野菜。蕨根还具有清扫化痰、利尿安神等功效,经常食用蕨根会有一定的保健作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能有效地从蕨根中提取黄酮的方法以弥补现有技术之不足。
本发明采用的技术方案是:蕨类植物提取黄酮生产工艺,其特征是:取新鲜蕨根70℃烘至8成干,然后剪成2-3mm碎段,再在103℃烘干后研成粉末状。准确称取一定质量蕨根干粉用索氏提取法(乙醚为抽提剂,45℃水浴)脱脂及除脂溶性色素,当乙醚抽提液无色时挥尽蕨根粉中乙醚,将蕨菜干粉放在烧瓶中加入体积分数70%乙醇(下同)回流提取蕨菜总黄酮。等1次浸提蕨根干粉质量∶70%乙醇体积=1∶5(g∶mL),以后每次浸提的比例为:1∶3(g∶mL),每次浸提时间约2小时,浸提温度为90℃,到乙醇浸提液基本无色,共浸提10次。合并所有浸提液并适当浓缩,定容至一定体积,按体积比1∶1加入石油醚,再次脱脂,弃上层石油醚,将下层乙醇浸提液定容至蕨根干粉质量与乙醇体积比为1∶20(g∶mL),此为蕨根总黄酮提取液,简称为粗黄酮液。
取一定体积粗黄酮液在水浴中进行减压浓缩成浆状并于103℃烘干,粉碎得到粗黄酮粉。
取粗黄酮粉1.30g,加水约100ml,经水浴加热溶解后上聚酰胺柱(聚酰胺事先乙105℃活化1小时,装柱30cm高,柱内径为2.5cm)。上柱充分吸附后,先用蒸馏水洗至无色,然后用体积分数95%乙醇洗脱,洗脱速度约为1.5ml/min,洗脱至无色时为止,收集洗脱液在90℃水浴上蒸干后于103℃烘2小时,得粉末状精制黄酮粉。
本发明的有益效果在于:蕨根中总黄酮含量比银杏叶等要高,为蕨根干重的7.28%。用70%乙醇浸提可得到约为蕨根干重1/4的粗黄酮粉,其黄酮含量27.03%,经聚酰胺纯化后的黄酮含量有所提高,但会有大量的黄酮类物质损失。蕨根是获取黄酮类化合物的良好来源。蕨根黄酮类化合物表现出较强的消除自由能力,具有显著的阻断亚油酸、猪油过氧化作用,表现出很强的抗氧化能力,而且还能去除油脂中已有的过氧化物,降低油脂的过氧化值。抗氧化作用测定结果均表明,一定浓度范围内,蕨根黄酮类化合物用量越大,其抗氧化性越强。蕨根黄酮化合物是一具有很大开发价值的天然抗氧化剂。
下面通过实施例,对本发明作进一步说明:
具体实施方式
实施例1:
材料与方法
试验材料
采摘蕨根长出地面15-20cm高的幼嫩叶(嫩叶拳卷期)为试验材料,采摘地点为宜宾市郊区的丘陵林地。
仪器与剂
YU-1201紫外可见兴分光光度计(北京普析通用仪器设备有限公司),101AS-2型不锈钢数显电热鼓风干燥箱(上海浦东跃欣科学仪器厂),HH-4数量恒测水浴锅(国华电器有限公司),硫代巴上妥酸(TBA,Merck),亚油酸(上海化学试剂公司),氨蓝四唑(NBT,Sigma),芦丁(上海化学试剂公司)。
蕨根黄酮的提取与纯化
蕨根总黄酮的提取
取新鲜蕨根70℃烘至8成干,然后剪成2-3mm碎段,再在103℃烘干后研成粉末状。准确称取一定质量蕨根干粉用索氏提取法(乙醚为抽提剂,45℃水浴)脱脂及除脂溶性色素,当乙醚抽提液无色时挥尽蕨根粉中乙醚,将蕨菜干粉放在烧瓶中加入体积分数70%乙醇(下同)回流提取蕨菜总黄酮。等1次浸提蕨根干粉质量∶70%乙醇体积=1∶5(g∶mL),以后每次浸提的比例为:1∶3(g∶mL),每次浸提约2h,浸提温度为90℃,址以乙醇浸提液基本无色,共浸提10次。合并所有浸提液并适当浓缩,定容至一定体积,按体积比1∶1加入石油醚,再次脱脂,弃上层石油醚,将下层乙醇浸提液定容至蕨根干粉质量与乙醇体积比为1∶20(g∶mL),此为蕨根总黄酮提取液,简称为粗黄酮液。
取一定体积粗黄酮液在水浴中进行减压浓缩成浆状并于103℃烘干,粉碎得到粗黄酮粉,计算粗黄酮粉得率。
蕨根黄酮的初步纯化
称取粗黄酮粉1.30g,加水约100ml,经水浴加热溶解后上聚酰胺柱(聚酰胺事先乙105℃活化1h,装柱30cm高,柱内径为2.5cm)。上柱充分吸附后,先用蒸馏水洗至无色,然后用体积分数95%乙醇洗脱,洗脱速度约为1.5ml/min,洗脱至无色时为止,收集洗脱液在90℃水浴上蒸干后于103℃烘2h,得粉末状精制黄酮粉,可计算期得率。
黄酮含量测定
按照徐雅琴等方面进行,采用分光光度法测定总黄酮含量,即利用黄酮类化合物与铝盐生成红色络合物,以芦丁为标准品(本文芦丁以70%乙醇配制)在510nm处测定及光度。标准曲线的回归方程:C=0.487A+0.0097(C为芦丁浓度mg/ml,A为吸光度),相关系数r=0.9998。
蕨根黄酮类化合物的抗氧化性测定
蕨根黄酮化合物及芦及的消除O2自由基能测定
采用NBT(氮蓝四唑)光还原法来测定黄酮类物质清除O2自由基能力。NBT反应液按衣海青等方法配制,各取3mlNBT反应液,分别加入1mL70%乙醇配制的蕨根黄酮液及芦丁液,然后将NBT反应液(该液中加1mL70%乙醇)、含黄酮的NBT反应液同时在40w日光灯下15cm处光照15min,于610nm处测定吸光度。从而计算出黄酮类化合物对NBT光还原50%定义为一个“尖似SOD活性单位”,并以此来衡量黄酮类化合物的清除自由基能力。
蕨根黄酮类化合物在市售油中的抗氧化作用
猪油由市售板油在烧杯中用文火熬炼而成。称取粗黄酮粉0.01、0.05、0.20g和精制黄酮粉0.01g,各用4ml无水乙醇溶解后分别加到50.00g温热猪油中,搅匀,以不加蕨根黄酮粉,仅在50.00g猪油中加入4ml无水乙醇为对照样,在(70±1)℃烘箱中强化保存,定时搅拌,于不同时间取样测定猪油中的过氧化值(POV值),并以此来表示猪油的氧化速度,进而衡量蕨根黄酮类化合物的抗氧化活性。过氧化值的测定按GB5009.37-1985方法进行。样品的过氧化值(POV)计算:
式中:POV为样品的过氧化值,mmol/kg;
V1为试样消耗硫代硫酸钠标准溶液体积,ml;
V2为空白试验消耗硫代酸钠标准溶液体积,ml;
M为硫代硫酸钠标准溶液的摩尔浓度,mol/kg;
m为质量,g。
蕨根黄酮类化合物控制亚油酸过氧化作用的测定
用无水乙醇配制0.5%的亚油酸乙醇液。称取粗黄酮粉0.01、0.05g,精制黄酮粉0.01g,各有4ml无水乙醇溶解,然后分别加到50ml0.5%亚油酸乙醇液中混匀,以不加黄酮粉而仅在50ml0.5%亚油酸乙醇液中加入4ml无水乙醇的为对照样,在(40±1)℃条件下保存,定期取样按黄雪松等方法中的TBA法(硫代巴比妥酸法)测定其吸光定。
结果与讨论
黄酮含量及黄酮得率
蕨根干粉中的总黄酮含量
取一定体积的蕨根总黄酮提取液(粗黄酮液)测定其中黄酮含量,进而计算出蕨根干粉的总黄酮含量为7.28%,这比柚皮粉、银杏干叶、黑刺菝葜干粉、穗醋粟叶片干粉中的总黄酮含量高的多,至少都高出2倍以上。
粗黄酮粉、精制黄酮粉得率及其黄酮含量
由蕨根干粉得到粗黄酮的得率为25.92%,经测定粗黄酮粉中的黄酮含量为27.03%;由粗黄酮经聚酰胺初步纯化后的精制黄酮粉相对于蕨菜干粉的得率为5.10%,相对于粗黄酮粉的得率为19.67%,精制黄酮粉中的黄酮含量为41.52%。
由上述结果看出,菜中黄酮类物质含量很高,提取的精黄酮粉得率已达蕨根干重的1/4以上,虽未经纯化但其黄酮粉得率也达27%以上。经过初步化纯化的精制黄酮粉得率也达蕨菜干重的5%以上。这些都说明,蕨菜是获取黄酮类物质的很好来源。
初步纯化的效果
经聚酰胺纯化后,黄酮粉中的黄酮含量由纯化前的27.03%提高到了纯化后的41.52%,这说明纯化有一定效果,但比文献中报告的蒲公英黄酮类化合物纯化后黄酮含量达67.4%要低,这说明聚酰胺对不同的黄酮提取物质的纯化效果有差异。结合黄酮粉得率及黄酮含量计算纯化后的黄酮回率为30.22%,约70%的黄酮类物质在纯化过程中损失掉了,如何进一步提高蕨根黄酮粉中的黄酮含量,提高纯化过程中的黄酮回收率,尚需进一步研究。
蕨根黄酮类化合物的抗氧化活性
消除O2自由基的能力
用NBT光还源法测定蕨根黄酮化合物与芦丁消除自由基能力的结果显示,当NBT光还原的抑制率在20%-60%范围内时,芦丁的含量与抑制率间呈高度相关,芦丁的抑制曲线为y=37.09x+0.0775,相关系数r=0.9924,y为抑制百分率,x为反应体系中芦丁毫克数。经测定,1mg芦丁消除自由基能力相当于87.82个类似SOD活性单位;1mg蕨根粗黄酮粉相当于24.71个类似SOD活性单位;1mg精制黄酮粉相当于48.06个类似SOD活性单位。
NBTI光还原反应是个自由其反应,NBT光还原是测定SOD酶活性的常用方法之一,SOD可以消除O2自由基而抑制NBT光还原。黄酮类化合物是具有酚羟基的一类还原性化合物,是人们一直关注的天然自由基消除剂,酚羟基可作为供氢体,使自由基还原从而抑制NBT光还原。从测定结果看,消除自由基能力较强的为芦丁,精制黄酮粉次之,粗黄酮粉较之精制黄酮粉又弱一些。可以初步看出,蕨根黄酮粉中的黄酮含量越高,消除自由基的能力越强。
蕨根黄酮类化合物在猪油中的抗氧化性分析
各样品的POV值随时间变化的情况如图1所示。由图1看出,相对于对照样,在猪油中添加不同的质量的黄酮粉,均可显著抑制猪油的自动氧化,表现出较强的抗氧化性,即使是最小的添加量(0.01g)。总体看,添加量越大抗氧化效果越好。更值得注意的是,添加黄酮粉后在开始阶段,相对对照样而言,各样品的POV值皆下降,表现出明显的降低猪油中过氧化值的作用,这与文献中用氧化亚锡来降低POV值效果相似,即蕨根黄酮粉添加到猪油后,不仅抑制猪油的自动氧化,而且能很好地去除猪油中已有的过氧化物,从而降低POV值。
蕨根黄酮类化合物抑制亚油酸的过氧作用
硫代巴比妥权法(TBA法)是基于不饱和脂肪酸过自由基反应,产生过氧化自由基,进而氧化生成环氧化物,后者生成丙二醛,丙二醛与TBA作用生成TBA染料,最大吸收波长为532nm。因此,TBA染料生成的多少就反映在532nm处的吸光度值大小上,是衡量自由基链反应进程的标志。抗氧化剂会抑制自由基链反应的进行,最终表现出TBA染料生成得少,吸光度值小。2次测定的吸光值结果如表1所示。
表1不同蕨根黄酮粉添加量与抗氧化性关系
50ml亚油酸中添加量 | 0.01g粗黄酮粉 | 0.05g粗黄酮粉 | 0.01精制黄酮粉 | 不加黄酮粉的对照样 |
A1(育温78h测) | 0.029 | 0.032 | 0.030 | 0.059 |
A2(育湿142h测) | 0.053 | 0.040 | 0.051 | 0.059 |
由表1看出,添加蕨根黄酮粉的较不添加的对照样吸光度值低,尤其是育温78h测定值能很好说明蕨根黄酮粉化合物能显著抑制亚油酸的过氧化,由育温142h吸光度值看出,黄酮粉添加量大的抑制亚油酸的自动氧化时间要更长些。
结论
蕨根中总黄酮含量比银杏叶等要高,为蕨根干重的7.28%。用70%乙醇浸提可得到约为蕨根干重1/4的粗黄酮粉,其黄酮含量27.03%,经聚酰胺纯化后的黄酮含量有所提高,但会有大量的黄酮类物质损失。蕨根是获取黄酮类化合物的良好来源。
蕨根黄酮类化合物表现出较强的消除自由能力,具有显著的阻断亚油酸、猪油过氧化作用,表现出很强的抗氧化能力,而且还能去除油脂中已有的过氧化物,降低油脂的过氧化值。抗氧化作用测定结果均表明,一定浓度范围内,蕨根黄酮类化合物用量越大,其抗氧化性越强。
蕨根黄酮化合物是一具有很大开发价值的天然抗氧化剂。
Claims (1)
1、蕨类植物提取黄酮生产工艺,其特征是:取新鲜蕨根68℃-72℃烘至8成干,然后剪成2-3mm碎段,再在101℃-105℃烘干后研成粉末状。准确称取一定质量蕨根干粉用索氏提取法(乙醚为抽提剂,45℃水浴)脱脂及除脂溶性色素,当乙醚抽提液无色时挥尽蕨根粉中乙醚,将蕨菜干粉放在烧瓶中加入体积分数70%乙醇(下同)回流提取蕨菜总黄酮。等1次浸提蕨根干粉质量∶70%乙醇体积=1∶5(g∶mL),以后每次浸提的比例为:1∶3(g∶mL),每次浸提时间约2小时,浸提温度为90℃,到乙醇浸提液基本无色,共浸提10次。合并所有浸提液并适当浓缩,定容至一定体积,按体积比1∶1加入石油醚,再次脱脂,弃上层石油醚,将下层乙醇浸提液定容至蕨根干粉质量与乙醇体积比为1∶20(g∶mL),此为蕨根总黄酮提取液,简称为粗黄酮液。
取一定体积粗黄酮液在水浴中进行减压浓缩成浆状并于1101℃-105℃烘干,粉碎得到粗黄酮粉。
取粗黄酮粉1.30g,加水约100ml,经水浴加热溶解后上聚酰胺柱(聚酰胺事先乙105℃活化1小时,装柱30cm高,柱内径为2.5cm)。上柱充分吸附后,先用蒸馏水洗至无色,然后用体积分数95%乙醇洗脱,洗脱速度约为1.5ml/min,洗脱至无色时为止,收集洗脱液在90℃水浴上蒸干后于101℃-105℃烘2小时,得粉末状精制黄酮粉。
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