CN104857031B - 一种刺头复叶耳蕨总黄酮提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种刺头复叶耳蕨总黄酮提取物的制备方法，该方法包括刺头复叶耳蕨粗提物提取方法和刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法，其中刺头复叶耳蕨粗提物提取方法为：取刺头复叶耳蕨加入乙醇，超声提取，提取液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物；其中刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物加水溶解，调pH值，上聚酰胺柱，先用水洗，水洗液弃去，再用浓度为50％‑70％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩，干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物。该方法是一个有机的整体的，该方法具有提取率高、工艺简单、适合工业化生产、提取物中刺头复叶耳蕨总黄酮含量高等优点。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种刺头复叶耳蕨总黄酮提取物的制备方法。
背景技术
刺头复叶耳蕨(Arachniodes exilis Ching)为鳞毛蕨科复叶耳蕨属植物，广泛分布于世界热带和亚热带湿润区域，以亚洲东部和东南部种类最为丰富，我国主要分布于长江流域以南地区及山东、河南等省，具有清热利湿、抗菌消炎、镇静作用，民间用于治疗急性黄疸型肝炎、关节炎、腰腿疼、痢疾、烫火伤等，其主要化学成份为黄酮类化合物。有研究表明鳞毛蕨类植物有包括抗病毒、抗肿瘤等药理作用，产生这些药理作用的成分是黄酮类化合物或总间苯三酚类化合物。目前植物总黄酮的提取工艺主要包括回流提取法、超声波法、微波法、超临界流体萃取法、酶解法等，但上述方法只能得到都是粗提物，其总黄酮的含量不超过10％，因此，建立一种得到高含量的刺头复叶耳蕨总黄酮提取物的制备方法，为进一步研究刺头复叶耳蕨中黄酮成分的药理活性提供基础。
发明内容
基于上述原因，申请人通过多次创造性的试验，得到一种新的高含量的刺头复叶总黄酮的制备方法，该方法将乙醇超声提取、调pH值后上聚酰胺柱纯化进行有机的结合，得到刺头复叶总黄酮提取物中总黄酮含量大于70％，该方法工艺简单可行、适合工业化生产。
本发明通过下述方案获得的。
一种刺头复叶耳蕨总黄酮提取物的制备方法，该制备方法包括刺头复叶耳蕨粗提物提取方法和刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法。
上述所述的一种刺头复叶耳蕨总黄酮提取物的制备方法，其中刺头复叶耳蕨粗提物提取方法为：取刺头复叶耳蕨加入乙醇，超声提取，提取液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
上述所述的一种刺头复叶耳蕨总黄酮提取物的制备方法，其中刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物加水溶解，调pH值，上聚酰胺柱，先用水洗，水洗液弃去，再用浓度为50％-70％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩，干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物。
上述所述的一种刺头复叶耳蕨总黄酮的制备方法，其中刺头复叶耳蕨粗提物的制备方法为：取刺头复叶耳蕨，加入浓度为50％-70％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的18-22倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取2-4次，每次25-35分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
上述所述的一种刺头复叶耳蕨总黄酮的制备方法，其中刺头复叶耳蕨粗提物的制备方法为：取刺头复叶耳蕨，加入浓度为60％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的20倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取3次，每次30分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
上述所述一种刺头复叶耳蕨总黄酮提取物的制备方法，其中刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.4-0.6倍，调pH值为4.5-5.5，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为50％-70％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物。
上述所述一种刺头复叶耳蕨总黄酮提取物的制备方法，其中刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.5倍，调pH值为5.0，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为60％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物。
制备方法研究试验：
一、提取试验研究
(一)工艺参数的研究
申请人经过多次研究，发现在超声提取中，乙醇浓度和超声功率对于提取率影响最大，因此申请人对于乙醇浓度、超声功率进行深入的研究：
1、乙醇浓度对总黄酮得率的影响
精确称取刺头复叶耳蕨60目干燥粉末1.0g，固定超声时间为20min，固液比为1∶20，提取次数为1次、超声功率为350W的条件下，不同乙醇浓度(20％、40％、60％、80％、100％)对总黄酮得率的影响。
2、超声功率对总黄酮得率的影响
精确称取刺头复叶耳蕨60目干燥粉末1.0g，固定乙醇浓度为60％，提取次数为1次，超声时间为20min，固液比为1∶20的条件下，不同超声功率(200、250、300、350、400W)对总黄酮得率的影响。
(二)试验结果
1、乙醇浓度对总黄酮得率的影响
乙醇浓度对刺头复叶耳蕨总黄酮得率的影响如表1所示，随着乙醇浓度的增加，提取率先增加后降低。但当乙醇浓度达到60％时，总黄酮提取率最大，所以选用浓度在60％的乙醇作为提取溶剂。
注：总黄酮含量测定：利用紫外-可见分光光度法，以芦丁为标准品，采用Al(NO3)3显色法，在486.4nm波长下测定标准曲线，得到线性回归方程为Y＝0.0121X-0.0322，R2＝0.9998，线性关系在17.20-68.80μg/mL范围内。根据标准曲线法测定各样品中总黄酮的含量。
表1乙醇浓度对提取率的影响
2、超声功率对总黄酮得率的影响
超声功率对刺头复叶耳蕨总黄酮得率的影响如表2所示，随着超声功率的增加，提取率增加。但当超声功率达到350W时，总黄酮得率最大，所以选用超声功率为350W。
表2超声功率对提取率的影响
二、纯化试验研究
申请人在研究中发现，样品直接上聚酰胺柱纯化，得到的提取物中总黄酮含量总是达不到50％，经过多次试验，意外发现，上样样品的pH值对于提取物中刺头复叶耳蕨总黄酮含量有着很大的影响，申请人对于pH值进行深入的研究：
试验方法：取一定量刺头复叶耳蕨根茎粉末以60％乙醇，固液比1∶20，超声提取3次，每次超声提取时间为30min的条件下得到提取液。将所得提取液经过滤后减压浓缩至一定浓度，冷冻干燥得复叶耳蕨总提物干燥粉末，测定该固体粉末中总黄酮含量为46.45％。取200mg复叶耳蕨总提物冻干份用蒸馏水定溶于100ml容量瓶，超声溶解，摇匀即得供试品溶液。聚酰胺的预处理：取60-90目的聚酰胺用95％乙醇浸泡24h，用乙醇冲洗至洗出液加蒸馏水无白色浑浊，再用大量的蒸馏水洗至无醇味。水清洗终点的判断：采用Molish反应。吸取1ml水清洗液于试管当中，加入5％α-萘酚乙醇溶液2滴，摇匀后沿试管壁缓缓加入0.5ml浓硫酸，如在两液层交界处形成紫色环，则表明清洗液中还有还原糖等的存在。直到Molish反应呈阴性，才为水清洗终点。洗脱终点的判断：采用盐酸-镁粉反应。取1ml洗脱液于试管中，加入少许镁粉，振摇，滴加3-5滴浓盐酸，若反应液在1～2min内显橙红-紫红色，则表明洗脱液中还有黄酮类成份存在。直到盐酸-镁粉反应呈阴性时，才为洗脱终点。
上样液pH值选择：取供试品溶液10ml各5份，分别滴加稀盐酸或稀氢氧化钠溶液调pH值为3、4、5、6、7。另分别取2.0g已预处理好的60-90目聚酰胺树脂5份，湿法装柱，取10ml供试品溶液上样，控制流速为2.0BV/h进行动态吸附，用蒸馏水洗至Molish反应呈阴性，再用70％乙醇进行洗脱至洗脱终点，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得到提取物，按已建立的紫外测定方法测定吸光度，计算提取物中刺头复叶耳蕨总黄酮含量。
试验结果：见表3。
表3不同pH值对刺头复叶耳蕨总黄酮含量影响
试验结论：通过上述试验表明，当上样液体pH值为5时，提取物中刺头复叶耳蕨总黄酮含量达到70％以上，具有重要科学意义。
制备实施例
实施例1
刺头复叶耳蕨粗提物的制备方法为：取刺头复叶耳蕨100g，加入浓度为60％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的20倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取3次，每次30分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.5倍，调pH值为5.0，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为60％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩后冷冻干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物0.794g，其中刺头复叶耳蕨总黄酮含量为71％。
实施例2
刺头复叶耳蕨粗提物的制备方法为：取刺头复叶耳蕨1000g，加入浓度为60％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的20倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取3次，每次30分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.5倍，调pH值为5.0，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为60％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物7.486g，其中刺头复叶耳蕨总黄酮含量为73％。
实施例3
刺头复叶耳蕨粗提物的制备方法为：取刺头复叶耳蕨500g，加入浓度为60％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的20倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取3次，每次30分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.5倍，调pH值为5.0，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为60％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物4.89g，其中刺头复叶耳蕨总黄酮含量为75％。
实施例4
刺头复叶耳蕨粗提物的制备方法为：取刺头复叶耳蕨10kg，加入浓度为60％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的20倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取3次，每次30分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.5倍，调pH值为5.0，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为60％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物70.96g，其中刺头复叶耳蕨总黄酮含量为72％。
实施例5
刺头复叶耳蕨粗提物的制备方法为：取刺头复叶耳蕨2kg，加入浓度为60％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的20倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取3次，每次30分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.5倍，调pH值为5.0，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为60％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物16.28g，其中刺头复叶耳蕨总黄酮含量为77％。
实施例6
刺头复叶耳蕨粗提物的制备方法为：取刺头复叶耳蕨3kg，加入浓度为60％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的20倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取3次，每次30分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.5倍，调pH值为5.0，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为60％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物4.89g，其中刺头复叶耳蕨总黄酮含量为72％。
实施例7
刺头复叶耳蕨粗提物的制备方法为：取刺头复叶耳蕨5kg，加入浓度为60％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的20倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取3次，每次30分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.5倍，调pH值为5.0，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为60％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物45.78g，其中刺头复叶耳蕨总黄酮含量为77％。
实施例8
刺头复叶耳蕨粗提物的制备方法为：取刺头复叶耳蕨8kg，加入浓度为60％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的20倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取3次，每次30分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.5倍，调pH值为5.0，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为60％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物66.78g，其中刺头复叶耳蕨总黄酮含量为75％。
实施例9
刺头复叶耳蕨粗提物的制备方法为：取刺头复叶耳蕨9kg，加入浓度为60％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的20倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取3次，每次30分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.5倍，调pH值为5.0，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为60％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物75.98g，其中刺头复叶耳蕨总黄酮含量为73％。
实施例10
刺头复叶耳蕨粗提物的制备方法为：取刺头复叶耳蕨12kg，加入浓度为60％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的20倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取3次，每次30分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.5倍，调pH值为5.0，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为60％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物105.32g，其中刺头复叶耳蕨总黄酮含量为72％。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。
Claims (3)
1.一种刺头复叶耳蕨总黄酮提取物的制备方法，其特征在于：该制备方法包括刺头复叶耳蕨粗提物提取方法和刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法；
其中刺头复叶耳蕨粗提物的提取方法为：取刺头复叶耳蕨，加入浓度为50％-70％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的18-22倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取2-4次，每次25-35分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物；
其中刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.4-0.6倍，调pH值为4.5-5.5，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为50％-70％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物。
2.根据权利要求1所述的一种刺头复叶耳蕨总黄酮的制备方法，其中刺头复叶耳蕨粗提物的提取方法为：取刺头复叶耳蕨，加入浓度为60％乙醇，加入乙醇重量是刺头复叶耳蕨的重量的20倍，采用超声提取，提取功率为350W，提取3次，每次30分钟，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨粗提物。
3.根据权利要求1所述一种刺头复叶耳蕨总黄酮提取物的制备方法，其中刺头复叶耳蕨总黄酮提取物纯化方法为：取刺头复叶耳蕨粗提物，加水溶解完全，加水的重量是刺头复叶耳蕨粗提物重量的0.5倍，调pH值为5.0，上聚酰胺柱，先用水洗，Molish反应阴性，停止收集水洗液，水洗液弃去；再用浓度为60％乙醇洗脱，盐酸-镁粉反应阴性，停止收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇至尽，浓缩干燥，得到刺头复叶耳蕨总黄酮提取物。
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| 大孔吸附树脂法纯化蕨菜黄酮的初步研究;陈乃富等;《食品工业科技》;20071231(第08期);82-85 * |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |