CN106083953A - 一种从蕨菜中提取原蕨苷以及制备高纯度原蕨苷的方法 - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products

Abstract

本发明公开了一种从蕨菜中提取纯化制备高纯度原蕨苷的方法，该方法先从蕨菜中得到蕨菜水提液，再采用聚酰胺6树脂、XAD2柱、Chem Elut 1020硅藻土固相萃取柱三重净化制备得到原蕨苷粗品，再将该粗品进一步通过制备HPLC纯化，有效地将目标化合物原蕨苷与蕨菜中的多种杂质相分离，最终得到了纯度98％以上的高纯度原蕨苷，可作为原蕨苷的标准品使用，具有广阔的市场前景。同时，本发明方法简便，并且在较优的工艺参数下，原蕨苷的收率可达25％，生产成本较低，具有良好的潜在经济价值。

Description

一种从蕨菜中提取原蕨苷以及制备高纯度原蕨苷的方法
技术领域
本发明涉及从蕨菜中提取纯化制备高纯度原蕨苷的方法。
背景技术
蕨菜，又叫拳头菜、猫爪、龙头菜、鹿蕨菜、蕨儿菜、猫爪子、拳头菜、蕨苔、锅莲，是蕨的嫩芽。英文名：Pteridium aquilinum，属于凤尾蕨科。喜生于浅山区向阳地块，多分布于稀疏针阔混交林。在我国西北、华北、东北、西南及华中各省区都有广泛的分布。其食用记载最早始于《诗经》：“陟坡南山，言采其蕨”，据《本草纲目》记载：蕨味甘寒,具清热、滑肠、降气、驱风、化痰等功效，主治食膈、气膈、肠风热毒等病症。
然而，目前研究发现，蕨菜中存在一种被称为原蕨苷(ptaquiloside，PTA，CAS：87625-62-5)的化合物，它是蕨菜中的主要致癌物质，其结构如下所示：
在体内和体外的研究都表明，原蕨苷具有细胞和基因毒性与尿道和胃肠道中的肿瘤发生直接相关。同时流行病学研究也证明人群在蕨类生长密集的地区居住时间与患胃癌死亡的风险正相关，而在童年时暴露于原蕨苷的人群在成年后发生恶性肿瘤的几率是未暴露人群的两倍以上(OR＝2.34)。此外研究还发现除了直接食用蕨菜外，通过被原蕨苷污染的牛奶、畜禽肉、甚至地下水均可受到原蕨苷影响。目前，原蕨苷被世界癌症组织评级为2B类致癌物，而原蕨苷在蕨类植物的嫩芽中含量最高。
目前，蕨菜产业已有一定的规模，为了食品的安全，有必要对蕨菜中的原蕨苷含量进行监控和控制。然而，目前国内尚没有高纯度原蕨苷标准品的销售，这对蕨菜产品的质量控制造成了困难。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种从蕨菜中提取原蕨苷的方法，它包括以下步骤：
(1)取蕨菜干粉，水提取，离心，取上清液，得蕨菜粗提液；(2)将粗提液过聚酰胺树脂柱纯化，得洗脱液；
(3)将洗脱液过大孔吸附树脂柱，再依次用水、甲醇洗脱，取甲醇洗脱液，回收溶剂，将残留物用水溶解，得溶解液；
(4)将溶解液依次过大孔吸附树脂柱，固相萃取柱，乙酸乙酯洗脱，取乙酸乙酯洗脱液，回收溶剂，得原蕨苷粗品。
在本发明一种具体的实施方式中，本蕨菜干粉是将新鲜蕨菜经经40℃干燥72h，并粉碎成分经200目过筛后得到的。
进一步地，步骤(1)中，所述蕨菜干粉和水的质量体积比为1g:10mL～1g:100mL。
进一步地，步骤(1)中，所述提取的温度为4℃。
进一步地，步骤(1)中，所述提取是震荡提取。
进一步地，步骤(1)中，所述提取的时间是30-150min，优选60min。
进一步地，步骤(2)中，所述聚酰胺树脂柱是聚酰胺-6树脂。
进一步地，步骤(3)中，所述大孔吸附树脂柱为XAD2柱。
进一步地，步骤(4)中，所述大孔吸附树脂柱为XAD2柱。
进一步地，步骤(4)中，所述固相萃取柱为硅藻土固相萃取柱。
本发明还提供了一种从蕨菜中制备高纯度原蕨苷的方法，它包括以下步骤：
所述的方法，制备得到原蕨苷粗品，再以50％甲醇：水为流动相，制备型色谱柱分离纯化原蕨苷粗品，收集主峰的流出组分，即得高纯度的原蕨苷；所述制备色谱柱优选C18色谱柱。
本发明的方法，先从蕨菜中得到蕨菜水提液，再采用聚酰胺6树脂、XAD2柱、ChemElut 1020硅藻土固相萃取柱三重净化制备得到原蕨苷粗品，再将该粗品进一步通过制备HPLC纯化，有效地将目标化合物原蕨苷与蕨菜中的多种杂质相分离，最终得到了纯度98％以上的高纯度原蕨苷，可作为原蕨苷的标准品使用，具有广阔的市场前景。同时，本发明方法简便，并且在较优的工艺参数下，原蕨苷的收率可达25％，生产成本较低，具有良好的潜在经济价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为原蕨苷经制备HPLC纯化的色谱图。
图2为纯品原蕨苷的色谱图。
图3纯品原蕨苷的光谱图。
图4为本发明高纯度原蕨苷产品的质谱图。
具体实施方式
实施例1原蕨苷的提取和纯化方法
1、原蕨苷(PTA)的提取
原料采用新鲜的蕨菜。经40℃干燥72h，并粉碎成分经200目过筛后，按照料液比1:10(40g蕨菜，400mL蒸馏水)(1:10至1:100均可，本实施例具体为1:10)，4℃震荡提取60min。提取物于4℃，5000rpm离心10min，取上清液进一步纯化。
2、提取物中干扰物质的去除
水提取物中除含原蕨苷外，还存在大量的复合物(一些多糖、蛋白质、厥素B等水溶性物质)，会干扰后期原蕨苷的检测，故将这些干扰物质去除。特别是厥素B，在一定的条件下，原蕨苷会转化为厥素B。需要进一步净化除去干扰物质。具体为：
(1)取200mL粗提液以重力法过柱(1.0×20cm玻璃小柱，5.00g聚酰胺6树脂(购自sigma)，干法装柱)，前100mL洗脱液直接用于进一步净化，后100mL洗脱液需二次过柱。合并洗脱液(200mL)进一步纯化。
(2)洗脱液再以XAD2柱纯化，即以2滴/s的速度使样品过吸附柱(2.5×20cm玻璃小柱，20mLAmberlite XAD2resin(购自sigma)，湿法装柱)，弃去流出液。吸附柱再用蒸馏水洗脱三次，每次15mL，丢弃蒸馏水洗脱液。最后以甲醇洗脱吸附柱三次，每次15mL，合并甲醇洗脱液。置于旋转蒸发仪，低压，45℃，浓缩至近干。残留物溶于10mL蒸馏水中移出，再以5mL蒸馏水洗涤两次，合并溶解液。
(3)合并的溶解液再过柱净化(1.0×10cm玻璃小柱，1.00g聚酰胺6树脂，干法装柱)。最初的2mL洗脱液弃去，其余的洗脱液再经Chem Elut 1020硅藻土固相萃取柱(购自瓦里安)进一步进化。用色谱纯乙酸乙酯洗脱固相萃取柱，洗脱液收集在圆底烧瓶中，低压，45℃，浓缩近干。得到0.20g微黄色胶状物即为PTA粗品。可充氮-20℃保存待用。
3、PTA的制备HPLC纯化
由于PTA粗品纯度在20％，可用50％甲醇溶液溶解后以制备型HPLC进行分离纯化。分离条件：流动相为50％甲醇：水，制备型色谱柱(C-18，10uM，25×250mm,购自安捷伦)，流速：3mL/min,柱温25℃，检测波长254nm。结果如图2所示收集主峰的流出组分。流出组分经减压浓缩后冻干后得到0.04g PTA纯品于-20℃保存待用。按原料中PTA含量为4000ug/g(干重)计算，因此收率为25％。
该方法所得PTA纯品经HPLC检测纯度大于98％，检测结果见图3。
实施例2原蕨苷的提取和纯化方法
按照实施例1的工艺，改变步骤1的料液比，最终结果如下表1所示：
表1步骤1的料液比
步骤1的料液比 收率(％) 纯度(％)
1:10 25 >98
1:20 25 >98
1:40 26 >98
1:80 26 >98
1:100 27 >98
结合表1和实施例1的结果可以看出，在1:10～1:100的料液比范围内，本发明方法均可以从蕨菜中有效得到高纯度原蕨苷。
实施例3原蕨苷的提取和纯化方法
按照实施例1的工艺，保持料液比为1:10，改变步骤1的提取时间，最终结果如下表2所示：
表2步骤1的提取时间
步骤1的提取时间 收率 纯度
30min 22 >98
60min 25 >98
90min 20 >98
120min 18 >98
150min 17 >98
结合表1和实施例1的结果可以看出，10-150min的提取时间范围内，本发明方法均可以有效得到高纯度原蕨苷，其中当提取时间为60min时，收率较高，效果较佳。
综上所述，本发明的方法，先从蕨菜中得到蕨菜水提液，再采用聚酰胺6树脂、XAD2柱、Chem Elut 1020硅藻土固相萃取柱三重净化制备得到原蕨苷粗品，再将该粗品进一步通过制备HPLC纯化，有效地将目标化合物原蕨苷与蕨菜中的多种杂质相分离，最终得到了纯度98％以上的高纯度原蕨苷，可作为原蕨苷的标准品使用，具有广阔的市场前景。同时，本发明方法简便，并且在较优的工艺参数下，原蕨苷的收率可达25％，生产成本较低，具有良好的潜在经济价值。

Claims (10)

1.一种从蕨菜中提取原蕨苷的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)取蕨菜干粉，水提取，离心，取上清液，得蕨菜粗提液；
(2)将粗提液过聚酰胺树脂柱纯化，得洗脱液；
(3)将洗脱液过大孔吸附树脂柱，再依次用水、甲醇洗脱，取甲醇洗脱液，回收溶剂，将残留物用水溶解，得溶解液；
(4)将溶解液依次过大孔吸附树脂柱，固相萃取柱，乙酸乙酯洗脱，取乙酸乙酯洗脱液，回收溶剂，得原蕨苷粗品。
2.根据权利看要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述蕨菜干粉和水的质量体积比为1g:10mL～1g:100mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述提取的温度为4℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述提取是震荡提取。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述提取的时间是30-150min，优选60min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述聚酰胺树脂柱是聚酰胺-6树脂。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述大孔吸附树脂柱为XAD2柱。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述大孔吸附树脂柱为XAD2柱。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述固相萃取柱为硅藻土固相萃取柱。
10.一种从蕨菜中制备高纯度原蕨苷的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
按照权利要求1-9任一项所述的方法，制备得到原蕨苷粗品，再以50％甲醇：水为流动相，制备型色谱柱分离纯化原蕨苷粗品，收集主峰的流出组分，即得高纯度的原蕨苷；所述制备色谱柱优选C18色谱柱。
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