CN112903844A - 一种蕨菜中原蕨苷含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蕨菜中原蕨苷含量的快速检测方法，属于食品安全与质量控制技术领域。检测步骤如下：(1)将蕨菜冷冻干燥或真空干燥至恒重，粉碎；加入正丁醇超声提取，离心，减压浓缩除去正丁醇；经C₁₈SPE柱纯化富集，梯度洗脱，冻干，加入适量甲醇溶液制成供试品溶液；(2)高效液相色谱法检测；(3)构建原蕨苷标准曲线方程；(4)将步骤(1)的供试品溶液，采用步骤(2)的检测方法，计算出峰面积，代入步骤(3)构建的曲线方程，计算出供试品中原蕨苷的含量。本发明的测定方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，可为蕨、蕨菜及产品的食用安全性评价和产品的质量控制提供参考方法和依据。

Description

一种蕨菜中原蕨苷含量的检测方法

技术领域

本发明属于食品安全与质量控制技术领域，具体涉及一种蕨菜中原蕨苷含量的检测方法。

背景技术

蕨(学名:Pteridium aquilinum(L.)Kuhn var.latiusculum(Desv.)Underw.exHeller)是蕨科蕨属欧洲蕨的一个变种，分布于中国各地，但主要产于长江流域及以北地区，亚热带地区也有分布；也广布于世界其他热带及温带地区。生长于海拔200-830米的山地阳坡及森林边缘阳光充足的地方。

蕨菜来源于蕨(Pteridium aquilinum(L.)Kuhn)的幼苗、嫩芽，别名拳头菜、如意菜、龙爪菜等，据《本草纲目》记载：蕨味甘寒，具有清热，滑肠，降气，驱风，化痰等功效。蕨菜因其生长在林间、山野、松林内，少受污染，加之富含多种对人体有益的营养成分，为深受人们喜爱的山珍野菜，长期被人们食用，有“山菜之王”之美誉。

新采集的蕨菜除了直接做成菜肴，还被加工成各种产品，如干蕨菜、蕨菜茶、蕨菜泡菜等。

19世纪时，人们注意到过量食用蕨菜能造成牛的中毒甚至死亡，1960年，Rosenberger和Heeschen等人通过对牛的蕨菜中毒症状研究中发现蕨菜可能存在致癌作用，1965年，Evans和Mason通过对小鼠喂养蕨菜的实验中，发现小鼠出现了多种肠道癌变现象，表明蕨菜中可能含有某种致癌成分。1983年-1984年，日本科学家Niwa和荷兰科学家Hoeven从蕨菜中分离出来了一种可使实验动物致癌的物质——原蕨苷(Ptaquiloside，简称PTA，CAS：87625-62-5，见图1)。

药理活性追踪研究显示，原蕨苷可诱发实验动物的尿道和胃肠道病变出现肿瘤，据此，原蕨苷被世界癌症组织评级为3类致癌物，然而相关文献报道表明，分布在不同地区蕨菜中原蕨苷含量差异显著，在蕨及蕨菜干品中，原蕨苷的含量在0.0μg/g-12945μg/g，大量摄入原蕨苷对人体危害极大。

原蕨苷在水溶液中不稳定，在热水、酸性及碱性溶剂中极不稳定，极易发生脱糖和芳香化，生成蕨素B(Pterosin B，CAS:34175-96-7，见图2)，增加了原蕨苷含量测定的难度。1991年，Agnew M.P.采用酸水解法，将蕨中原蕨苷转化成蕨素B，然后采用HPLC-UV法测定蕨素B含量从而推算原蕨苷含量，由于蕨素B非常稳定易于测定，Agnew等构建的方法成为原蕨苷测定最常用方法。然而，Agnew等方法存在如下局限：(1)如图2所示，原蕨苷在酸性条件下先水解脱糖成次倍半萜苷元Ptaquilosin，然后Ptaquilosin进一步芳香化成蕨素B(Pterosin B)，因此，该方法通过测定蕨素B含量反推原蕨苷含量，面临着原蕨苷转化不彻底、Ptaquilosin芳环化不彻底的局限；(2)如图3所示，蕨、蕨菜除了含有原蕨苷，还含有一定量的原蕨苷结构类似物如蕨素G和Ptesculentoside等，在酸性条件下也会转化成蕨素B，因此，通过测定蕨素B含量反推原蕨苷含量不能反映原蕨苷的真实含量；2008年，JensenP.H.等人构建基于LC-MS/MS技术的原蕨苷含量测定方法，但存在回收率低的缺陷；2011年，Francesco B.等采用NaBr柱前衍生化将原蕨苷转化成Br-PTA后采用GC/MS进行检测，该方法同样存在回收率低的缺陷，研究蕨、蕨菜及其产品中原蕨苷含量测定方法，得到相关产品中原蕨苷的准确含量，对蕨菜及其产品的安全性评价和质量控制具有重要意义。亟需构建一个准确、稳定的蕨菜及其产品中原蕨苷的含量检测方法，为蕨菜及其产品质量安全控制提供技术支撑。

发明内容

针对现有原蕨苷含量测定存在的不足，本发明目的在于，提供一种蕨菜中原蕨苷含量的检测方法。

一种蕨菜中原蕨苷含量的检测操作步骤如下：

(1)制备供试品溶液

取供试材料，冷冻干燥或真空干燥至恒重，粉碎，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入正丁醇，超声提取，离心分离，残渣继续重复提取2次，合并上清液；减压浓缩除去正丁醇，得到浸膏，将浸膏加入浓度10％的甲醇溶液中溶解，经C₁₈ SPE柱纯化富集，甲醇-水系统梯度洗脱，收集浓度45％的甲醇溶液洗脱部分，冻干，加入甲醇制成供试品溶液。

所述供试材料为新鲜蕨菜或干蕨菜。

(2)高效液相色谱法检测

将供试品溶液采用高效液相色谱法进行检测，测得供试品溶液中原蕨苷的峰面积值。(3)构建原蕨苷标准曲线方程

精密称取标准品原蕨苷，置于容量瓶中，加甲醇配成5-300μg·mL^-1的五个以上浓度不同的对照品溶液，采取步骤(2)的高效液相色谱法检测条件，测定五个以上的对照品溶液中原蕨苷峰面积，构建原蕨苷标准曲线方程。

(4)测定原蕨苷含量

将测得的供试品溶液中原蕨苷的峰面积值代入步骤(3)构建的原蕨苷标准曲线方程，计算出供试品溶液中原蕨苷的浓度，进而计算出供试品中原蕨苷的含量。

进一步限定的技术方案如下：

步骤(1)中，所述冷冻干燥法的干燥温度为-50℃以下。

步骤(1)中，所述真空干燥法干燥的干燥温度为40-60℃。

步骤(1)中，提取剂正丁醇与蕨菜冻干粉的料液比为1g:10～30mL。

步骤(1)中，超声波提取条件：提取功率200w～300w、频率为3.0kHz～5.0kHz、超声提取20～40min。

步骤(1)中，所述C₁₈ SPE柱纯化富集为将原蕨苷正丁醇提取物溶于体积浓度10％的甲醇溶液，上样，采用体积浓度10％的甲醇溶液、体积浓度20％的甲醇溶液和体积浓度45％的甲醇溶液依次梯度洗脱。收集体积浓度45％的甲醇溶液的洗脱部分制成供试品溶液。

步骤(2)中，HPLC检测条件：C₁₈反向色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：流动相A为水，流动相B为甲醇，检测波长214nm；柱温30℃；流速：1.0mL·min^-1；进样量10μL；梯度洗脱；0-5min,20-40％B；5-10min,40-45％B；10-20min,45-50％B；20-25min,50-57％B；25-27min,57-100％B；27-35min,100％B。

本发明的有益技术效果体现在以下方面：

1.本发明构建的原蕨苷含量的直接测定方法，相对于将蕨菜中原蕨苷酸解成蕨素B、然后通过测定蕨素B含量来间接测定原蕨苷含量的方法，可以克服原蕨苷酸解、芳香化成蕨素B不彻底，以及其它物质酸性条件下转化成蕨素B的影响；

2.本发明对供试品采用-50℃冷冻干燥或40-60度真空干燥脱水、正丁醇超声提取、采用10％的甲醇溶解正丁醇提取物浸膏后固相萃、收集45％洗脱部分-105℃冻干，有效降低了制样过程中原蕨苷的分解，测定结果准确；

3本发明采用固相萃取对供试品中原蕨苷进行富集，原蕨苷含量从正丁醇提取物(图4C)的1.04％提高到固相萃取45％洗脱部分(图4B)的56.52％，采用本发明所述固相萃取方法，可将供试品中原蕨苷的检出限降低54.35倍。

发明人进行了大量的实验，以下是部分实验研究情况说明。

实验例1：含量测定方法考察

1仪器和试药

1.1仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)，四元泵(G1311B)，自动进样器(G7129A)，DAD检测器(G4212B)；美国Waters Atlantis C18反相色谱柱(250×4.6mm，5μm)；CPA225D型电子天平(德国Sartoius公司)；KQ-500VDV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BenchTop Pro冷冻干燥机(美国SP科技公司)；CNWBOND LC-C18SPE固相萃取柱(上海安谱科技股份有限公司)；SZ-93A自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)等。

1.2试剂甲醇(美国天地有限公司，色谱纯)正丁醇(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；二次双蒸馏水；原蕨苷标准品(日本京都大学，98.00％)。

1.3实验材料

供试样品新鲜的蕨由发明人采于安徽金寨，经皖西学院陈乃富教授准确鉴定为蕨(Pteridium aquilinum(L.)Kuhn)。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Waters Atlantis C18反相色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：流动相A为水，流动相B为甲醇，检测波长214nm；柱温30℃；流速：1.0mL·min^-1；进样量10μL；梯度洗脱：0-5min,20-40％B；5-10min,40-45％B；10-20min,45-50％B；20-25min,50-57％B；25-27min,57-100％B；27-35min,100％B。

2.2溶液的制备

(1)对照品溶液的制备

精密称取标准品原蕨苷，置于容量瓶中，加甲醇配成5-300μg·mL^-1的对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备

供试品溶液的制备：新采集的新鲜蕨菜，自来水清洗除去表面浮尘，切成约0.5cm的小段，-20℃冰箱预冻24h后转移至-50℃冷冻干燥机中冷冻干燥48h，粉碎，过40目筛，获蕨菜冻干粉，精密称定2.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入正丁醇溶液40mL，称定重量，室温下超声提取30min，超声功率240W，频率4.2kHz，取出，放冷，加入正丁醇溶液补足减少的重量，摇匀，5000转/min离心5分钟，收集上清液，沉淀在相同条件下继续重复提取2次，合并上清液，70℃减压浓缩除去正丁醇，浸膏加10％甲醇5.0mL超声溶解(超声功率240W，频率4.2kHz)，0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上安谱C₁₈ SPE柱，10％甲醇洗脱50mL后20％甲醇溶液洗脱液100mL，再以45％甲醇洗脱100mL，收集45％甲醇洗脱部分，-105℃冻干后加入加入2mL甲醇溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

2.3专属性考察

精密吸取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各10μL，按拟定的色谱条件，依法测定。图4A为标准品原蕨苷的HPLC-DAD检测结果，图4B、图4C分别为供试品正丁醇提取物固相萃取45％甲醇洗脱部分、供试品正丁醇提取物的-HPLC-DAD检测结果，可见，供试品溶液色谱中疑似原蕨苷色谱峰保留时间(RT＝21.6min)与对照品溶液中原蕨苷色谱峰保留时间一致。图5为HPLC-DAD测定的供试品溶液中疑似原蕨苷(RT＝21.6min)的UV光谱图，图6为HPLC-DAD测定的对照品溶液中原蕨苷UV光谱图，二者基本相同，综合图4-图6的对比分析结果，证明供试品溶液中保留时间RT＝21.6min的色谱峰是供试品中原蕨苷色谱峰。

在本发明所述高效液相条件下，供试品正丁醇提取物的原蕨苷HPLC色谱峰、供试品正丁醇提取物固相萃取45％甲醇洗脱部分的原蕨苷HPLC色谱峰与其相邻的色谱峰分离度大于1.5且达到基线分离，峰纯度在98％以上，说明所建立的方法具有较强的专属性。

采用本发明所述固相萃取对供试品中原蕨苷进行富集，富集效果显著，富集后原蕨苷峰面积(图4B)明显高于富集前的正丁醇提取物中原蕨苷峰面积(图4C)。进一步数据分析发现(表1)，原蕨苷含量从正丁醇提取物的1.04％提高到固相萃取45％洗脱部分的56.52％，采用本发明所述固相萃取方法，可将供试品中原蕨苷的检出限降低54.35倍，可显著提高蕨菜中原蕨苷检出的下限。

表1蕨菜正丁醇提取物、固相萃取45％洗脱部分得率及富集前后原蕨苷含量变化

2.4线性范围考察

分别精密吸取浓度为300μg·mL^-1的原蕨苷对照品溶液0.25mL，0.5mL，1mL，2mL，3mL，4mL，5.0mL置于5mL的容量瓶中，用甲醇溶液稀释定容至刻度，摇匀，配制成系列浓度对照品溶液，分别精密吸取上述溶液10μL，按拟定的色谱条件注入高效液相色谱仪。以对照品进样量为横坐标，峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝4.44x-1.86，该标准曲线方程中，Y表示进样质量，x表示当进样质量为Y时按所述高效液相条件进样测得的原蕨苷峰面积。相关性分析显示，见表2，该标准曲线的相关系数R²＝0.999，说明原蕨苷进样质量在50ng～3000ng范围内时，原蕨苷进样质量与峰面积值呈良好的线性关系。

2.5精密度试验

精密吸取原蕨苷对照品溶液(μg·mL^-1)，按拟定的色谱条件，连续进样6次，每次10μL，测定原蕨苷色谱峰的峰面积值，结果如表2所示，6次进样所测定原蕨苷峰面积的RSD值为0.79％，符合质量标准分析方法验证技术要求RSD在2.0％以内的标准，表明仪器精密度良好。

2.6重复性试验

取同一批号的待测蕨菜样品，按照拟定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液6份，按拟定的色谱条件分别进样测定，每次10μL，结果如表2所示，6次进样所测定原蕨苷含量的RSD值为1.45％，符合质量标准分析方法验证技术要求RSD在3.0％以内的要求，表明本发明所述原蕨苷含量测定方法的重复性良好。

2.7稳定性试验

取与重复性试验同一批号的蕨菜样品，按拟定的方法制备供试品溶液1份，以拟定的色谱条件，于0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h分别进样10μL，测定原蕨苷色谱峰的峰面积值。结果如表2所示，七个时间段进样所测得的原蕨苷峰面积的RSD值为0.89％，表明供试品溶液在48h内稳定。

2.8加样回收率试验

取与重复性试验同一批号的待测样品9份，每份1.0g，精密称定，分别按4：3，1：1，4：5比例加入原蕨苷对照品，分别按拟定的供试品溶液制备方法进行供试品溶液制备。按拟定的色谱条件，分别进样测定，计算原蕨苷的平均回收率，结果如表2所示，可见，采用本发明方法，原蕨苷加样回收率平均值达91％，RSD值为1.78％，符合质量标准分析方法验证技术要求回收率限度在90～108％的要求，表明表明本发明所述原蕨苷含量测定方法准确度高。

表2原蕨苷标准曲线与方法学考察结果

2.9样品的测定

采自安徽金寨的新鲜蕨全株，-50℃冷冻干燥至恒重，粉碎，精密称定2.0g，按拟定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，按拟定的色谱条件，进样测定，图7中图Y1为本实施例中的供试品溶液HPLC色谱图，可见明显的原蕨苷色谱峰。计算原蕨苷色谱峰的峰面积值，代入原蕨苷的标准曲线方程，计算出供试品溶液中原蕨苷浓度，进而计算供试品中原蕨苷的含量。测定结果如表3所示，采于安徽金寨的新鲜蕨全株，原蕨苷平均含量为30.0±23.1mg·kg^-1。

3结论

3.1色谱条件选择

本实验DAD检测器测得的原蕨苷紫外吸收光谱如图5与图6所示，原蕨苷在214nm处有最大吸收，故将214nm作为原蕨苷HPLC-DAD含量测定的检测波长。对四种不同色谱柱Welchrom C18反向色谱柱(300×4.6mm，5μm)、Waters Atlantis C18反向色谱柱(250×4.6mm，5μm)、Agilent Zorbax SB-C18反向色谱柱(150×4.6mm，5μm)、大连依利特HypersiODS2 C18反向色谱柱(200×4.6mm，5μm)供试品HPLC分离效果进行比较，结果表明，使用Waters Atlantis C18反向色谱柱(250×4.6mm，5μm)检测时，原蕨苷色谱峰检测灵敏度高，且峰形、分离度均较好。使用Waters Atlantis C₁₈反向色谱柱(250×4.6mm，5μm)检测时，分别设定25℃、30℃、35℃、40℃的检测柱温，结果表明柱温30℃时原蕨苷色谱峰保留时间适中、峰形和分离度均较好。设置进样量为2.5μL、5.0μL、10μL、15μL、20μL，结果表明进样量为10μL峰形、分离度均较好。

3.2提取条件考察

分别采用30％、50％、75％、90％甲醇溶液以及水、正丁醇作为提取溶剂，结果表明正丁醇提取率最高；进一步比较了超声提取法和回流提取法，结果显示超声提取法提取率较高，故选择超声提取法；分别设置超声提取时间为10min、20min、30min，40min，结果表明超声提取30min时，原蕨苷提取率较高；分别设置提取次数为1次、2次、3次，4次，结果表明，随着提取次数增加原蕨苷的提取率增加，当提取次数超过2次时，随着提取次数增加原蕨苷的提取率增加不明显，故超声提取次数定为2次；分别设定料液比1g：10mL、1g：20mL、1g：30mL，1g:40mL，结果表明，料液比为1g：20mL时，原蕨苷的提取率相对较高，故选择料液比为1：20。

3.3富集条件考察

蕨菜干粉正丁醇提取物，减压浓缩除去正丁醇，浸膏加水溶解，经安谱C₁₈ SPE柱纯化，甲醇-水体系梯度洗脱，考察了10％甲醇溶液、20％甲醇溶液、45％甲醇溶液、75％甲醇溶液的洗脱效果，结果表明：先用20％甲醇溶液洗脱100mL，然后再用45％甲醇溶液洗脱100mL，收集45％甲醇洗脱部分冻干后加入适量甲醇溶液制成供试品溶液效果最好，同时能极大的提高检测限。

附图说明

图1是原蕨苷结构式图；

图2是原蕨苷分解途径图；

图3是蕨菜中蕨素B形成的路径图；

图4是反向C18固相萃取对原蕨苷的富集作用(其中A：对照品溶液；B：供试品溶液；C：SPE柱富集前的样品溶液)；

图5是原蕨苷对照品的紫外吸收光谱图；

图6是供试品中原蕨苷紫外吸收光谱图；

图7是不同产地蕨菜及其产品HPLC检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

一种蕨菜中原蕨苷含量的检测操作步骤如下：

(1)制备供试品溶液

从安徽霍山新采集的新鲜蕨菜的全株，自来水清洗除去表面浮尘，切成约0.5cm的小段，-20℃冰箱预冻24h后转移至-50℃冷冻干燥机中冷冻干燥48h，粉碎，过40目筛，获蕨菜冻干粉，精密称定2.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入正丁醇溶液40mL，称定重量，室温下超声提取30min，超声功率240W，频率4.2kHz，取出，放冷，加入正丁醇溶液补足减少的重量，摇匀，5000转/min离心5分钟，收集上清液，沉淀相同条件下继续重复提取2次，合并上清液，70℃减压浓缩除去正丁醇，浸膏加10％甲醇5.0mL超声溶解(超声功率240W，频率4.2kHz)，0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上安谱C₁₈ SPE柱，10％甲醇洗脱50mL后20％甲醇溶液洗脱液100mL，再以45％甲醇洗脱100mL，收集45％甲醇洗脱部分，-105℃冻干后加入加入2mL甲醇溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

(2)高效液相色谱法检测

将供试品溶液采用高效液相色谱法进行检测，测得供试品溶液中原蕨苷的峰面积值。

高效液相色谱条件：色谱柱：Waters Atlantis C₁₈反向色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：流动相A为水，流动相B为甲醇，检测波长214nm；柱温30℃；流速：1.0mL·min^-1；进样量10μL；梯度洗脱：0-5min,20-40％B；5-10min,40-45％B；10-20min,45-50％B；20-25min,50-57％B；25-27min,57-100％B；27-35min,100％B。

(3)构建原蕨苷标准曲线方程

精密称取标准品原蕨苷，置于容量瓶中，加甲醇溶液配成5、10、25、50、100、200、300μg·mL^-1的七个对照品溶液，按照步骤(2)所述高效液相条件，分别进样、检测。根据每个对照品的进样质量及按照步骤(2)所述高效液相条件测得的峰面积，回归分析获得原蕨苷标准曲线方程：Y＝4.44x-1.86，该标准曲线方程中，Y表示进样质量，x表示当进样质量为Y时按所述高效液相条件进样测得的原蕨苷的峰面积。

(4)测定原蕨苷含量

图7的Y2是本实施例1中从安徽霍山采集的新鲜蕨全株制备的供试品溶液HPLC色谱图，可见明显的原蕨苷色谱峰。从该HPLC色谱图测定供试品溶液中原蕨苷的峰面积值x，代入步骤(3)所构建的标准曲线方程，计算出10μL供试品溶液中原蕨苷的质量Y，并进一步计算出供试品中原蕨苷的含量。由表3可见，采于安徽霍山的新鲜蕨全株，原蕨苷平均含量达21.5±0.465mg kg-1；

实施例2

一种蕨菜中原蕨苷含量的检测操作步骤如下：

(1)制备供试品溶液

从安徽岳西新采集的新鲜蕨菜(蕨的幼苗、嫩芽)，自来水清洗除去表面浮尘，切成约0.5cm的小段，-20℃冰箱预冻24h后转移至-50℃冷冻干燥机中冷冻干燥48h，粉碎，过40目筛，获蕨菜冻干粉，精密称定2.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入正丁醇溶液40mL，称定重量，室温下超声提取30min，超声功率240W，频率4.2kHz，取出，放冷，加入正丁醇溶液补足减少的重量，摇匀，5000转/min离心5分钟，收集上清液，沉淀相同条件下继续重复提取2次，合并上清液，70℃减压浓缩除去正丁醇，浸膏加10％甲醇5.0mL超声溶解(超声功率240W，频率4.2kHz)，0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上安谱C₁₈ SPE柱，10％甲醇洗脱50mL后20％甲醇溶液洗脱液100mL，再以45％甲醇洗脱100mL，收集45％甲醇洗脱部分，-105℃冻干后加入加入2mL甲醇溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

(2)高效液相色谱法检测

将供试品溶液采用高效液相色谱法进行检测，测得供试品溶液中原蕨苷的峰面积值。高效液相色谱条件：色谱柱：Waters Atlantis C₁₈反向色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：流动相A为水，流动相B为甲醇，检测波长214nm；柱温30℃；流速：1.0mL·min^-1；进样量10μL；梯度洗脱：0-5min,20-40％B；5-10min,40-45％B；10-20min,45-50％B；20-25min,50-57％B；25-27min,57-100％B；27-35min,100％B。

(3)构建原蕨苷标准曲线方程

精密称取标准品原蕨苷，置于容量瓶中，加甲醇配成5、10、25、50、100、200、300μg·mL^-1的七个对照品溶液，按照步骤(2)所述高效液相条件，分别进样、检测。根据每个对照品的进样质量及按照步骤(2)所述高效液相条件测得的峰面积，回归分析获得原蕨苷标准曲线方程：Y＝4.44x-1.86，该标准曲线方程中，Y表示进样质量，x表示当进样质量为Y时按所述高效液相条件进样测得的原蕨苷峰面积。

(4)测定原蕨苷含量

图7的Y3是本实施例2中从安徽霍山采集的新鲜蕨菜(蕨的幼苗、嫩芽)制备的供试品溶液HPLC色谱图，可见明显的原蕨苷色谱峰。从该HPLC色谱图中测定供试品溶液中原蕨苷的峰面积值x，代入步骤(3)所构建的标准曲线方程，计算出10μL供试品中原蕨苷的质量Y，并进一步计算出供试品中原蕨苷的含量。由表3可见，采于安徽岳西的新鲜蕨菜，原蕨苷平均含量达1300.0±10.6mg kg-1；

实施例3

一种蕨菜中原蕨苷含量的检测操作步骤如下：

(1)制备供试品溶液

从不同省市和地区采购的干蕨菜(表3，Y4-Y18)，50℃真空干燥至恒重，粉碎，过40目筛，获蕨菜干粉，精密称定2.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入正丁醇溶液40mL，称定重量，室温下超声提取30min，超声功率240W，频率4.2kHz，取出，放冷，加入正丁醇溶液补足减少的重量，摇匀，5000转/min离心5分钟，收集上清液，沉淀相同条件下继续重复提取2次，合并上清液，70℃减压浓缩除去正丁醇，浸膏加10％甲醇5.0mL超声溶解(超声功率240W，频率4.2kHz)，0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上安谱C₁₈ SPE柱，10％甲醇洗脱50mL后20％甲醇溶液洗脱液100mL，再以45％甲醇洗脱100mL，收集45％甲醇洗脱部分，-105℃冻干后加入加入2mL甲醇溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

(2)高效液相色谱法检测

将供试品溶液采用高效液相色谱法进行检测，测得供试品溶液中原蕨苷的峰面积值。高效液相色谱条件：色谱柱：Waters Atlantis C₁₈反向色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：流动相A为水，流动相B为甲醇，检测波长214nm；柱温30℃；流速：1.0mL·min^-1；进样量10μL；梯度洗脱：0-5min,20-40％B；5-10min,40-45％B；10-20min,45-50％B；20-25min,50-57％B；25-27min,57-100％B；27-35min,100％B。

(3)构建原蕨苷标准曲线方程

精密称取标准品原蕨苷，置于容量瓶中，加甲醇溶液配成5、10、25、50、100、200、300μg·mL^-1的七个对照品溶液，按照步骤(2)所述高效液相色谱条件，分别进样、检测。根据每个对照品的进样质量及按照步骤(2)所述高效液相条件测得的峰面积，回归分析获得原蕨苷标准曲线方程：Y＝4.44x-1.86，该标准曲线方程中，Y表示进样质量，x表示当进样质量为Y时按所述高效液相条件进样测得的原蕨苷的峰面积。

(4)测定原蕨苷含量

表3不同产地的鲜蕨菜、干蕨菜中原蕨苷含量测定结果(n＝10，含量以干品计)

图7的Y4-Y18是本实施例中从不同省市和地区采购的干蕨菜制备的供试品溶液HPLC色谱图，各样品均可见明显的原蕨苷色谱峰。从各供试品溶液HPLC色谱图中测定各供试品溶液的原蕨苷峰面积值x，代入步骤(3)所构建的标准曲线方程，计算出10μL供试品中原蕨苷的质量Y，并进一步计算样品中原蕨苷的含量。由表3可见，采于不同省市和地区采购的干蕨菜，原蕨苷平均含量差异显著。

Claims (7)

1.一种蕨菜中原蕨苷含量的检测方法，其特征在于检测操作步骤如下：

(1)制备供试品溶液

取供试材料，冷冻干燥或真空干燥至恒重，粉碎，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入正丁醇，超声提取，离心分离，残渣继续重复提取2次，合并上清液；减压浓缩除去正丁醇，得到浸膏，将浸膏加入浓度10％的甲醇溶液中溶解，经C₁₈ SPE柱纯化富集，甲醇-水系统梯度洗脱，收集浓度45％的甲醇溶液洗脱部分，冻干，加入适量甲醇溶液制成供试品溶液；

所述供试材料为新鲜蕨菜或干蕨菜；

(2)高效液相色谱法检测

将供试品溶液采用高效液相色谱法进行检测，测得供试品溶液中原蕨苷的峰面积值；

(3)构建原蕨苷标准曲线方程

精密称取标准品原蕨苷，置于容量瓶中，加甲醇溶液配成5-300μg·mL^-1的五个以上的对照品溶液，采取步骤(2)的高效液相色谱法检测条件，测定五个以上的对照品溶液的峰面积，获得原蕨苷标准曲线方程；

(4)测定原蕨苷含量

将测得的供试品溶液的峰面积值，代入步骤(3)构建的原蕨苷标准曲线方程，计算出供试品溶液中原蕨苷的浓度，进而计算出供试品中原蕨苷的含量。

2.根据权利要求1所述的一种蕨菜中原蕨苷含量的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述冷冻干燥法的干燥温度为-50℃以下。

3.根据权利要求1所述的一种蕨菜中原蕨苷含量的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述真空干燥法干燥的干燥温度为40-60℃。

4.根据权利要求1所述的一种蕨菜中原蕨苷含量的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述提取剂正丁醇与蕨菜冻干粉的料液比为1g:10-30mL。

5.根据权利要求1所述的一种蕨菜中原蕨苷含量的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，超声波提取条件：提取功率200w～300w、频率为3.0kHz～5.0kHz、超声提取20-40min。

6.根据权利要求1所述的一种蕨菜中原蕨苷含量的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述C₁₈SPE柱纯化富集为将原蕨苷正丁醇提取物溶于浓度10％的甲醇溶液，上样，采用体积浓度10％的甲醇溶液、体积浓度20％的甲醇溶液和体积浓度45％的甲醇溶液依次梯度洗脱；收集体积浓度45％的甲醇溶液洗脱部分，-105℃冻干，溶于甲醇制成供试品溶液。

7.根据权利要求1所述的一种蕨菜中原蕨苷含量的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，高效液相色谱法的检测条件：C₁₈反向色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：流动相A为水，流动相B为甲醇，检测波长214nm；柱温30℃；流速：1.0mL·min^-1；进样量10μL；梯度洗脱；0-5min,20-40％B；5-10min,40-45％B；10-20min,45-50％B；20-25min,50-57％B；25-27min,57-100％B；27-35min,100％B。

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