CN109021035B - 一种苯乙酰胺类化合物、其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苯乙基肉桂酰胺类化合物，具有下述结构式：

化合物命名为：(Z)4‑O‑[β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑α‑L‑吡喃鼠李糖基]苯乙基肉桂酰胺，其分子式为C₂₉H₃₇NO₁₁。本发明还公开了所述苯乙基肉桂酰胺类化合物的制备方法及用于制备糖尿病抑制剂的用途。

Description

一种苯乙酰胺类化合物、其制备方法和用途

技术领域

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种从甘青青兰中提取得到的新的苯乙基肉桂酰胺类化合物、其制备方法和用途。

背景技术

唇形科(Labiatae)青兰属(Dracocephalum)植物为多年生草本植物，全世界一共分布约有60种，该属植物在我国资源丰富，约有32种，7变种，主要分布于华北、东北、西南及西北等地区，青兰属植物在民间多作为藏药使用。藏药甘青青兰(Dracocephalumtanguticum Maxim.)又名唐古特青兰，具有清热祛湿、疏风解表、舒肝和胃之功效。用于治疗头晕、肝炎、胃炎、关节炎和疖疮等病症，该属植物化学成分丰富，主要含有黄酮、三萜、黄酮苷、二萜等类型化合物。这种植物多生在海拔1900-4000米的地方，多见于干燥河谷的河岸、草滩。在我国主要分布在青海、西藏、甘肃及云南等地区。

糖尿病是一种血糖高于正常人很多倍的慢性代谢性疾病，持续的高血糖与长期代谢紊乱等可导致神经系统及心血管的损害，严重的可引起全身器官衰竭，严重危害全球人们的健康。糖尿病的发病机理是当胰岛素分泌不足时，首先是引起糖代谢障碍。由于胰岛素不足时，糖进入细胞内部的量减少，糖原合成减少，由此而导致肝、肌肉及脂肪等组织对葡萄糖的消耗减少，从而导致高血糖。目前，临床上主要应用胰岛素来抑制血糖的升高。胰岛素能加速肝脏以及脂肪细胞甚至是全身组织对葡萄糖的消耗和利用，进而加快糖原的分解，从而使血液中的糖分降低，降低血糖。

苯乙基肉桂酰胺(Phenylethylcinnamamide)类化合物多存在于唇形科青兰属植物中，在很多领域如医药、化妆品、食品等是重要的原料，由于这类化合物具有各种不同的生物活性，所以该类化合物在生物、医药等领域具有广阔的应用前景。

本发明首次从植物甘青青兰中分离得到了一种苯乙基肉桂酰胺连糖苷类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道。本发明的新型苯乙基肉桂酰胺类化合物经活性测试之后表明：该化合物能够加速3T3-L1前脂肪细胞对葡萄糖的摄取，进而降低血糖，在一定程度上起到抑制糖尿病的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的苯乙基肉桂酰胺类化合物；第二目的在于提供所述苯乙基肉桂酰胺类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述苯乙基肉桂酰胺类化合物用于制备糖尿病抑制剂的用途。

本发明第一方面公开了一种苯乙基肉桂酰胺类化合物，具有下述结构式：

化合物命名为：(Z)4-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙基肉桂酰胺，其分子式为C₂₉H₃₇NO₁₁。其是从干燥的植物甘青青兰(Dracocephalumtang uticumMaxim)全草中分离得到，英文名为：(Z)4-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl]phenylethylcinnamamide。该化合物为浅黄色油状物。

本发明第二方面公开了所述苯乙基肉桂酰胺类化合物的制备方法，包括如下步骤：

A、浸膏提取：将甘青青兰的全草粉碎，用95v/v％乙醇室温下超声提取，将提取液过滤、减压浓缩成浸膏；

B、硅胶柱层析：将步骤A的浸膏用其重量5-7倍量的100-200目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、1:1和0:1的乙酸乙酯:甲醇溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液，合并相同的部分并减压浓缩；

C、凝胶柱色谱洗脱：将步骤B洗脱液10:1部分以纯甲醇溶液在凝胶柱色谱上进行洗脱，收集洗脱液；

D、高压液相色谱分离：将步骤C的洗脱液以氯仿:甲醇＝4:1为展开剂经TLC监测，合并R_f值在0.4-0.8之间的部分，浓缩后用甲醇溶解，经高压液相色谱分离纯化，收集24.5min色谱峰多次累加后蒸干，即得所述的苯乙基肉桂酰胺类化合物。

优选地，步骤B的浸膏在经硅胶柱层析前，用其重量1.5-3倍量的氯仿和甲醇混合溶剂溶解，然后用浸膏重量1-1.5倍的100-200目硅胶拌样。

优选地，步骤D所述高压液相色谱分离纯化是以50-65v/v％的甲醇为流动相，流速3ml/min，以10×250mm，5μm的XB-C₁₈反相半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为210-280nm，每次进样50μL。

本发明第三方面公开了所述的苯乙基肉桂酰胺类化合物用于制备糖尿病抑制剂的用途。

以上述方法制备的苯乙基肉桂酰胺类化合物的结构是通过以下方法鉴定出来的：

本发明化合物为浅黄色油状物；紫外光谱(溶剂为甲醇),λ_max(logε)203(3.70)、215(3.59)、254(3.32)nm；红外光谱(溴化钾压片)ν_max 3393、2920、2849、1646、1509、1469、1420、1229、1073、1024、774、696cm^-1；HRESI-MS显示其准分子离子峰为598.2259[M+Na]⁺(计算值598.2259)，结合¹H NMR和DEPT谱确定其分子式为C₂₉H₃₇NO₁₁，不饱和度为12。红外光谱中显示了羟基(3393cm^-1)、羰基(1646cm^-1)和芳环(1509、1469和1420cm^-1)的共振吸收峰。

从¹H和¹³C NMR谱(数据归属见表-1)信号可以看出化合物的29个碳包括1个甲基、3个亚甲基、21个次甲基(其中11个为烯碳次甲基)、4个季碳(包括1个共轭羰基碳)，氢谱显示的δ_H:3.32-5.38之间的氢信号和碳谱显示的δ_C:99.8(d)、71.4(d)、82.7(d)、82.7(d)、72.6(d)、70.2(d)、18.1(q)和δ_C:105.8(d)、75.4(d)、77.7(d)、71.0(d)、77.8(d)、62.2(t)信号可知，分子中存在1个吡喃葡萄糖基和1个吡喃鼠李糖基结构单元。此外分子中还包括1个1,4-二取代的苯环和1个单取代的苯环结构单元，结合文献报道和化合物分子式，确定化合物为苯乙基肉桂酰胺类化合物。

化合物的HMBC谱中(如图3)观察到H-2(δ_H 7.10)与C-7(δ_C 35.4)；H-8(δ_H 3.40)与C-9′(δ_C 170.0)；H-7′(δ_H 6.72)与C-9′；H-2′(δ_H 7.42)与C-7′(δ_C 137.7)的HMBC相关，可确定化合物母核的连接方式。根据H-1″(δ_H 5.38)与C-4(δ_C 156.3)的HMBC相关，可推测该糖的C-1″取代在C-4位；根据H-6″(δ_H 1.22)和C-5″(δ_C 70.2)相关及H-1″与C-5″相关可知与苯环相连的糖为α-L-吡喃鼠李糖基。再根据HMBC谱中H-1″′(δ_H 4.59)与C-3″(δ_C 82.7)相关可知吡喃葡萄糖基的C-1″′位与吡喃鼠李糖基的C-3″位相连。根据H-7′与H-8′偶合常数为12.5Hz，判断C-7′与C-8′之间的双键为顺式双键。至此，化合物的结构得到确定，化合物命名为：(Z)4-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙基肉桂酰胺。

表1 化合物的¹H NMR和¹³C NMR数据(溶剂为CD₃OD)

本发明的有益效果：

本发明的苯乙基肉桂酰胺类化合物首次从甘青青兰中分离出来的，通过核磁共振和高分辨质谱以及紫外、红外光谱测定方法确定为苯乙基肉桂酰胺类化合物，并表征了其具体结构。本发明的化合物经活性测试，空白对照组(DMSO组)的葡萄糖消耗率为16.86±1.01％，阳性对照组(0.1μM的胰岛素(Insulin))的葡萄糖消耗率为27.45±1.63％，该活性化合物(25μM终浓度)的葡萄糖消耗率为21.26±1.05％。结果显示，本发明的苯乙基肉桂酰胺类活性化合物能够加速3T3-L1前脂肪细胞对葡萄糖的摄取，进而降低血糖，在一定程度上起到抑制糖尿病的作用，可用于制备糖尿病抑制剂的用途。本发明化合物结构新颖且活性较好，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明苯乙基肉桂酰胺类化合物的核磁共振氢谱；

图2为本发明苯乙基肉桂酰胺类化合物的核磁共振碳谱；

图3为本发明苯乙基肉桂酰胺类化合物的主要HMBC相关图示。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为体积百分数。

本发明所述的苯乙基肉桂酰胺类化合物，是从干燥甘青青兰(Dracocephalumtanguticum Maxim)植物全草中分离得到，化合物命名为：(Z)4-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙基肉桂酰胺，英文名为：(Z)4-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl]phenylethylcinnama-mide，其分子式为C₂₉H₃₇NO₁₁，具有下述结构式：

其以干燥的甘青青兰全草为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、凝胶柱色谱、高压液相色谱步骤制备，具体为：

A、浸膏提取：将甘青青兰的全草粉碎，用95v/v％乙醇室温下超声提取3-6次，每次3天，合并提取液、过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏；

B、硅胶柱层析：将浸膏用其重量5-7倍量的100-200目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、1:1和0:1的乙酸乙酯:甲醇溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液，经TLC监测，合并相同的部分并减压浓缩；

C、凝胶柱色谱：将步骤B洗脱液10:1部分以纯甲醇溶液在凝胶柱色谱上进行洗脱，收集洗脱液；

D、高压液相色谱分离：将步骤C的洗脱液以氯仿:甲醇＝4:1为展开剂经TLC监测，合并R_f值在0.4-0.8之间的部分，浓缩后用甲醇溶解，经高压液相色谱分离纯化，收集24.5min色谱峰多次累加后蒸干，即得所述的苯乙基肉桂酰胺类化合物。

步骤B的浸膏在经硅胶柱层析前，用重量1.5-3倍量的氯仿和甲醇混合溶剂溶解，然后用浸膏重1-1.5倍的100～200目硅胶拌样。

步骤D的高压液相色谱分离纯化是以50-65v/v％的甲醇为流动相，流速3ml/min，以10×250mm，5μm的XB-C₁₈反相半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为210～280nm，每次进样50μL，收集24-30min的色谱峰，多次累加后蒸干。

所述D步骤的高压液相色谱分离纯化是以55v/v％的甲醇为流动相，流速为3ml/min，以10×250mm，5μm的XB-C₁₈反相半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为210nm、230nm、254nm，每次进样50μL，收集24.5min的色谱峰，多次累加后蒸干即得所述的苯乙基肉桂酰胺类化合物。

本发明所述的甘青青兰不受地区限制，均可以实现本发明，下面以采自云南省昆明地区的甘青青兰为原料，对本发明做进一步说明：

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本发明中的溶液如果只给出了溶质，没有公开溶剂，则本领域技术人员应该知晓溶剂为水。本发明中纯氯仿指100％氯仿，纯甲醇指100％甲醇，纯乙酸乙酯指100％乙酸乙酯。

实施例1

以采自云南省昆明地区的甘青青兰为原料。将甘青青兰全草风干之后粉碎到80目得甘青青兰粗粉9.5kg，以95v/v％的乙醇超声提取6次，每次提取3天，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏约1.2kg。浸膏用重量1.5倍量的纯甲醇溶解后用1.5kg的100-200目硅胶拌样，取6.0kg的100-200目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、1:1和0:1的乙酸乙酯:甲醇溶液进行梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到7个部分，其中体积配比为10:1的洗脱部分用Sephadex LH-20型葡聚糖凝胶柱层析，以纯甲醇为流动相进行洗脱，收集洗脱液，然后将以上洗脱液以氯仿:甲醇＝4:1为展开剂经TLC监测，合并R_f值在0.4-0.8之间部分，浓缩后用甲醇溶解，经高压液相色谱分离纯化，用安捷伦1260高压液相色谱分离纯化时以55v/v％的甲醇为流动相，流速3ml/min，以10×250mm，5μm的XB-C₁₈反相半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，230nm，254nm，每次进样50μL，收集24.5min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的苯乙基肉桂酰胺类化合物。

实施例2

以采自云南省玉溪地区的甘青青兰为原料。将甘青青兰全草风干之后粉碎到80目得甘青青兰粗粉6.5kg，以95v/v％的乙醇超声提取6次，每次提取3天，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏约800g。浸膏用重量比1.5倍量的纯甲醇溶解后用1.2kg的100-200目硅胶拌样，取4.0kg的100-200目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、1:1和0:1的乙酸乙酯:甲醇溶液进行梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到7个部分，其中体积配比为10:1的洗脱部分用Sephadex LH-20型葡聚糖凝胶柱层析，以纯甲醇为流动相进行洗脱，收集洗脱液，然后将以上洗脱液以氯仿:甲醇＝4:1为展开剂经TLC监测，合并R_f值在0.4-0.8之间的部分，浓缩后用甲醇溶解，经高压液相色谱分离纯化，用安捷伦1260高压液相色谱分离纯化时以55v/v％的甲醇为流动相，流速3ml/min，以10×250mm，5μm的XB-C₁₈反相半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，230nm、254nm，每次进样50μL，收集24.5min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的苯乙基肉桂酰胺类化合物。

实施例3

取实施例1制备的化合物，为浅黄色油状物；测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。

(1)紫外光谱(溶剂为甲醇),λ_max(logε)203(3.70)、215(3.59)、254(3.32)nm；

(2)红外光谱(溴化钾压片)ν_max 3393、2920、2849、1646、1509、1469、1420、1229、1073、1024、774、696cm^-1；

(3)高分辨质谱HRESI-MS显示其准分子离子峰为598.2259[M+Na]⁺(计算值598.2259)，结合¹H NMR和DEPT谱确定其分子式为C₂₉H₃₇NO₁₁，不饱和度为12。红外光谱中显示了羟基(3393cm^-1)、羰基(1646cm^-1)和芳环(1509、1469和1420cm^-1)的共振吸收峰。

从¹H和¹³C NMR谱(数据归属见表-1)信号可以看出化合物的29个碳包括1个甲基、3个亚甲基、21个次甲基(其中11个为烯碳次甲基)、4个季碳(包括1个共轭羰基碳)，氢谱显示的δ_H:3.32-5.38之间的氢信号和碳谱显示的δ_C:99.8(d)、71.4(d)、82.7(d)、82.7(d)、72.6(d)、70.2(d)、18.1(q)和δ_C:105.8(d)、75.4(d)、77.7(d)、71.0(d)、77.8(d)、62.2(t)信号可知，分子中存在1个吡喃葡萄糖基和1个吡喃鼠李糖基结构单元。此外分子中还包括1个1,4-二取代的苯环和1个单取代的苯环结构单元，结合文献报道和化合物分子式，确定化合物为苯乙基肉桂酰胺类化合物。

化合物的HMBC谱中(如图3)观察到H-2(δ_H 7.10)与C-7(δ_C 35.4)；H-8(δ_H 3.40)与C-9′(δ_C 170.0)；H-7′(δ_H 6.72)与C-9′；H-2′(δ_H 7.42)与C-7′(δ_C 137.7)的HMBC相关，可确定化合物母核的连接方式。根据H-1″(δ_H 5.38)与C-4(δ_C 156.3)的HMBC相关，可推测该糖的C-1″取代在C-4位；根据H-6″(δ_H 1.22)和C-5″(δ_C 70.2)相关及H-1″与C-5″相关可知与苯环相连的糖为α-L-吡喃鼠李糖基。再根据HMBC谱中H-1″′(δ_H 4.59)与C-3″(δ_C 82.7)相关可知吡喃葡萄糖基的C-1″′位与吡喃鼠李糖基的C-3″位相连。根据H-7′与H-8′偶合常数为12.5Hz，判断C-7′与C-8′之间的双键为顺式双键。至此，化合物的结构得到确定，化合物命名为：(Z)4-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙基肉桂酰胺。

实施例4

取实施例1中制备的苯乙基肉桂酰胺类化合物进行3T3-L1前脂肪细胞葡萄糖消耗量活性测试，测试情况如下：

活性测试采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)测定3T3-L1前脂肪细胞葡萄糖消耗量的方法，具体操作为：使用含有25mmol/L葡萄糖和10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，将3T3-L1前脂肪细胞置于37℃、体积分数为5％CO₂、饱和湿度条件下培养、传代。将融合2天后的细胞置于含有250nmol/L地塞米松，0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和1μg/mL胰岛素的10％FBS-DMEM中。2天后，将培养基更换为仅含有1μg/mL胰岛素的10％FBS-DMEM，再于2天后用10％FBS-DMEM替换。此后，每2天更换一次培养基，直到诱导分化成为成熟的脂肪细胞。

将3T3-L1细胞诱导分化成脂肪细胞后，将细胞消化并接种到96孔板中，培养过夜，用低糖培养基(葡萄糖浓度为1800mg/L)将细胞清洗一次后，分别加入200μL含胰岛素、待测样品工作液。实验设置空白对照组(DMSO组)、阳性对照组(0.1μM的胰岛素(Insulin))，待测样品组用25μM终浓度孵育。每组设置3个重复孔。孵育24小时后吸取10μL上清培养基，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定培养基中葡萄糖的浓度。计算并比较本发明的化合物的葡萄糖消耗率。

通过以上测试方法，结果表明，空白对照组(DMSO组)的葡萄糖消耗率为16.86±1.01％，阳性对照组(0.1μM的胰岛素(Insulin))的葡萄糖消耗率为27.45±1.63％，本发明的化合物(25μM终浓度)的葡萄糖消耗率为21.26±1.05％。以上结果说明本发明的苯乙基肉桂酰胺类活性化合物可以促进3T3-L1脂肪细胞消耗葡萄糖，进而降低血糖。因此本发明的苯乙基肉桂酰胺类活性化合物具有一定抗糖尿病的活性，可用于制备糖尿病抑制剂的用途。

Claims (2)

1.一种苯乙基肉桂酰胺类化合物的制备方法，其特征在于，所述苯乙基肉桂酰胺类化合物具有下述结构式：

化合物命名为：(Z)4-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙基肉桂酰胺，其分子式为C₂₉H₃₇NO₁₁；

所述苯乙基肉桂酰胺类化合物的制备方法包括如下步骤：

A、浸膏提取：将甘青青兰的全草粉碎，用95％v/v 乙醇室温下超声提取，将提取液过滤、减压浓缩成浸膏；

B、硅胶柱层析：将步骤A的浸膏用其重量5-7倍量的100-200目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、1:1和0:1的乙酸乙酯:甲醇溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液，合并相同的部分并减压浓缩；

C、凝胶柱色谱洗脱：将步骤B洗脱液10:1部分以纯甲醇溶液在凝胶柱色谱上进行洗脱，收集洗脱液；

D、高压液相色谱分离：将步骤C的洗脱液以氯仿:甲醇＝4:1为展开剂经TLC监测，合并R_f值在0.4-0.8之间的部分，浓缩后用甲醇溶解，经高压液相色谱分离纯化，收集24.5min色谱峰多次累加后蒸干，即得所述的苯乙基肉桂酰胺类化合物；

步骤D所述高压液相色谱分离纯化是以50-65％v/v 的甲醇为流动相，流速3ml/min，以10×250mm，5μm的XB-C₁₈反相半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为210-280nm，每次进样50μL。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B的浸膏在经硅胶柱层析前，用其重量1.5-3倍量的氯仿和甲醇混合溶剂溶解，然后用浸膏重量1-1.5倍的100-200目硅胶拌样。

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