KR19990081593A

KR19990081593A - 신규한 면역증강활성 다당류물질 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR19990081593A
Application number: KR1019980015617A
Authority: KR
Inventors: 유익동; 조수묵; 박병욱; 유재국; 홍남두
Original assignee: 한만우; 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 1999-11-15

Abstract

본 발명은 펠리누스속 균주로부터 균사체 또는 자실체를 대량 배양하여 그로부터 면역증강활성을 나타내는 신규한 다당류물질의 분리 정제에 관한 것이다.

본 발명은 펠리누스속 균사체 또는 자실체로부터 T-세포와 B-세포등 임파구의 각각에 대한 세포 독성 작용과 면역작용체인 항체 형성을 유도하여 면역활성이 증가됨을 확인하므로써 면역증강활성을 나타내는 다당류임을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

신규한 면역증강활성 다당류물질 및 그 제조방법

본 발명은 펠리누스속(Phellinus) 균사체 또는 자실체로부터 분리된 신규한 면역증강활성 다당류물질 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 펠리누스속 균주로부터 균사체 또는 자실체의 대량 배양조건을 찾고, 면역증강활성을 나타내는 다당류물질을 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.

상황은 한방에서 오래전부터 각종 질병, 특히 종양에 대한 치료효과가 알려져온 귀중한 약제중의 하나로, 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus)라 불리우는 담자균류의 일종이다. 그러나, 상황이 종양의 치료에 큰 효과가 있다는 사실을 인지하고 있었음에도 불구하고 자연계에 널리 분포하지 않는 희귀종이기 때문에 자실체의 입수가 어려울 뿐만 아니라 균사체의 분리 및 배양도 용이하지가 않아 적극적으로 활용되지 못하는 실정이다.

펠리누스 린테우스 균주가 생산하는 다당류와 관련된 기존의 발명으로는 대한민국 특허공보 제 92-2658호(한만우, 다당류 및 그 제조방법)와 제 95-29192호(유익동 등, 다당류 및 그 제조방법)가 유일한 발명으로 보고되었으나 상기의 발명 특허에서 제한하고 있는 다당류는 본 발명의 다당류와는 활성범위, 구성당의 종류 및 구성당의 구성비율 등이 완전히 상이하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 면역증강활성을 갖는 신규한 다당류물질을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 면역증강활성 다당류물질을 분리 정제하는 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 또다른 목적은 펠리누스 균사체 또는 자실체로부터 상기 다당류물질 및 그의 유도체의 항암 면역활성증강제 및 허용가능한 약학조성물의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 상황버섯 균주를 배양하여 얻은 균사체로부터 면역증강활성물질을 얻고, 이를 추출 분리하여 면역증강활성물질을 정제하고, 면역증강활성과 구성 단당류 및 구조적 특징을 조사하고, 면역증강활성 다당류물질의 구조분석을 수행한 후 펠리누스속에 속하는 각종 균주를 상기 상황버섯 균주와 같이 배양하고 균사체 또는 자실체를 추출, 정제한 후 면역증강활성을 측정함으로써 달성하였다.

도 1은 상황 균사체 및 다당류 생산을 위한 배양특성을 나타낸 것이다.

도 2는 상황균주로부터 면역증강활성 다당류물질을 정제하는 과정을 나타낸 것이다.

도 3은 면역증강활성 다당류물질의 구성당 기체 크로마토그라피 양상을 나타낸 것이다.

도 4는 면역증강활성 다당류물질의 HW 65F 겔 크로마토그라피 용출도를 나타낸 것이다.

도 5는 면역증강활성 다당류물질의 탄소핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

본 발명은 상황균주를 배양하는 단계; 상황균주의 배양 균사체로부터 면역증강활성 다당류물질을 추출 정제하는 단계; 순수한 면역활성물질을 정제하는 단계; 추출분획 다당류물질의 면역증강활성을 조사하는 단계; 면역증강활성 다당류물질의 구성 단당류의 성분을 분석하는 단계; 면역증강활성 다당류물질의 구조적 특징을 조사 하는 단계; 펠리누스속 균주 배양, 균사체 추출, 정제 및 면역항암활성측정 단계 및; 펠리누수속 균주 자실체의 추출, 정제 및 면역항암활성측정 단계로 구성되어 있다.

본 발명에 사용한 상황균주는 본 발명자들에 의해 미생물 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자원센터에 1997년 11월 17일자로 기탁번호 KCTC 0399BP로서 기탁된 균주이다. 상기의 상황 균주를 포도당, 효모추출액, 펩톤, 미네랄이 혼합된 무기염류가 함유되어 있는 배지에서 5ℓ 발효조에 배양하여 얻은 균사체를 열수로 추출하고 80% 에탄올로 침전시킨 다음, 물로 현탁하고 투석막으로 투석한 면역증강활성 분획을 얻었다. 이 분획은 겔 크로마토그라피를 하여 균질한 다당체임을 확인하고 이 분획들을 동결건조하여 임파구의 증식 및 활성정도를 조사하여 면역증강활성이 인정되었다. 그리고, 구성 성분의 종류 및 구성당의 조성비등을 규명한 후 물리화학적 특성을 조사한 결과 면역증강활성을 나타내는 신규한 다당류물질을 얻은 것이다. 이때, 면역증강활성 측정은 B 임파구의 경우 생명공학연구소 유전자원센터 실험 동물연구실에서 분양받은 B₆C₃F 마우스에서 적출한 비장(splenocyte)에 각 시료와 양성 대조군으로 엘피에스(lipopolysaccharide, LPS)를 처리하여 2일간 면역화시킨 후 형성된 항체를 분광광도계 측정법으로 측정하여 활성의 지표로 삼았다. T 임파구는 임파구 혼합 반응효과로 측정하였다. 임파구의 증식효과는 세포내의 핵 합성 정도를 동위원소로 치환된 티아민(³H thiamine)을 사용하여 측정하여 활성의 지표로 삼았다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 상황 균주의 배양

한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자원센터 미생물 국제기탁기관에 본 발명자들에 의해 신규 미생물 균주로 기탁된 상황(Phellinus linteus KCTC 0399BP )균주를 사용하였다. 본 발명 균주를 액체배양하기 위하여 배지 1ℓ당 포도당 50g, 펩톤 10g, 효모추출액 10g 및 KH₂PO₄0.8g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, CaCl₂0.3g을 혼합한 무기염류용액 1mL가 들어있는 액체배지를 pH 6.0으로 조절한 다음 멸균하여 사용하였다. 이때, 균사체를 배양하기 위하여 5ℓ 발효조를 사용하여 3.5ℓ의 액체배지를 만든 후 온도 28℃, 통기량 2vvm, 회전수 160rpm 조건에서 11일동안 배양하였으며, 이때의 균사체 수율은 5일후 가장 높았으며 리터당 30g이었다(도 1). 5일간 배양된 균사체의 열수 추출로 얻어지는 다당류의 수율은 하기 표 1에서 볼 수 있듯이 균사체 건조중량당 0.873% 이었다.

상황 균사체의 균사체 생산성과 다당류의 생성 정도

조사항목	상황 5일 배양 균사체
균사체 건조중량(g/ℓ)	30
조 다당류의 건조중량(mg/ℓ)	262
조 다당류의 수율( % )	0.873

실시예 2. 상황 균주의 배양 균사체의 추출

상황 균주의 배양 균사체를 다음과 같은 방법으로 추출 정제하여 면역증강활성 다당류 조추출물을 얻었다. 상기 실시예 1에서 얻어진 배양 균사체 280g을 열수 추출한 후 농축하여 3g의 열수 추출액을 얻었다. 이 추출액에 에탄올 농도가 80%가 되게 에탄올을 가한 후 4℃에서 24시간 동안 방치한 후 원심분리하면 상등액과 침전물을 얻었다. 침전물은 물에 녹인 후 투석막(cellulose tubing, 일본 삼광순약제품)을 사용하여 10℃ 저온에서 72시간 동안 12시간 간격으로 투석액을 교환하면서 투석하였다. 투석막속의 내액을 동결건조하여 2.45g의 조 추출물을 얻었다.

실시예 3. 순수한 면역활성물질의 정제

상기 실시예 2에서 얻어진 조 추출물을 DEAE-셀룰로스와 겔 여과 크로마토그라피를 순차적으로 행하여 순수한 활성분획을 얻었다. 먼저 조 추출물을 5mM 소디움 포스페이트 완충용액(pH 7.2)에 용해한 후 DEAE-셀룰로스 칼럼에 적정하고 동일 완충액으로 세척한 다음, 동일 완충액에 0에서 1몰 농도의 소디움 크로라이드를 조제하여 gradient로 분당 5mL의 유속으로 용출시켜 각 시험관에 15mL씩 분취하였다. 페놀-황산정량법에 의해 당 함량을, 브래드포드방법에 의해 단백질 함량을 결정하였다. 이때 얻어진 당 함량 조 추출물 분획은 Toyopearl HW 65F 겔 여과 크로마토그라피를 행하여 분자량이 균일하고 성질이 동일한 순수 활성분획(PL-2)을 얻었다. 이때 용출은 물로 실시하였다. 당과 단백질 함량은 상기와 동일한 방법으로 결정하였다. 순수한 면역활성물질의 추출 및 정제과정은 도 2에 나타낸 바와 같다.

실시예 4. 추출분획 다당류물질(PL-2)의 면역증강활성 조사

담자균 유래 다당류는 생체내의 면역기구인 임파구의 증식 또는 활성에 영향을 줌으로써 외부 인자에 대한 면역성을 증강시키고, 이러한 결과는 암세포의 파괴를 초래하는 것으로 알려져 있다. 이러한 작용은 직접적인 세포독성에 기인하는 것이 아니라, 면역활성에 의하여 매개되는 것으로 생체내의 부작용이 적은 장점이 있다. 즉, T-세포와 B-세포등 임파구의 각각에 대한 세포독성 작용과 면역작용체인 항체 형성을 유도하여 면역활성이 증가되고, 그 결과로서 항암면역활성을 나타낸다. 따라서, 항체형성 림포사이트를 계수하고 임파구와 T-세포의 증식정도를 측정함으로 항암면역활성을 간접적으로 증명할 수 있다. 본 발명에서는 항체 형성 림포사이트를 계수하는 항체형성 세포 계산법(antibody forming cell method), T-세포의 증식 정도를 측정하는 임파구 혼합 반응효과(Mixed lymphocytes response)와 임파구의 증식효과를 알 수 있는 세포내의 핵 합성량 정도를 동위원소로 치환된 티아민(³H thiamine)을 사용하여 측정하여 활성의 지표로 삼았다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

상황균주 추출분획 다당류물질에 대한 면역증강활성

처리구	임파구 증식효과(DPM×10⁴)	T 세포활성(DPM×10⁴)	B 세포 항체형성능(흡광도 576nm)
순순활성분힉(PL-2)	8.4±0.5	2.5±0.1	0.66±0.01
리포폴리사카라이드(LPS, 양성대조구)	-	-	0.81±0.23
대조구	1.6±0.5	0.5±0.05	0.00±0.00
주: 각 시료는 10㎍/㎖ 농도로 처리하였다.

상황 균사체로부터 얻은 다당류는 대조구에 비해 5배의 높은 임파구 증식 및 T 세포 활성 효과를 나타냈으며, B 세포의 항체 형성능의 경우 면역제제 가운데 효과가 가장 뛰어나지만 생체내의 부작용으로 인하여 사용할 수 없는 양성 대조구 리포폴리사카라이드의 활성 정도와는 거의 유사한 수준을 나타냈다.

실시예 5. 면역증강활성 다당류물질(PL-2)의 구성당 및 구성비율 조사

상기 실시예 3에서 얻은 다당류의 구성 단당류 성분을 분석하기 위하여 가스 크로마토그라피를 실시하였다(도 3). 또한, 구성성분은 탄수화물의 경우 페놀-설퓨릭 에시드 방법으로 측정하였고, 단백질의 경우 폴린-페놀 방법으로 측정하였다. 구성당 분석에 사용한 기종은 휴렛패커드(HP 5890 GC)를 사용하였으며, 칼럼은 휴즈드 실리카 캐피러리 칼럼 에스페 2330(fused silica capillary column sp-2330, 0.32mm×30m)를 사용하였다. 하기 조건에서 가스크로마토그라피를 행하였다. 칼럼 온도를 초기에 200℃로 2분간 유지한 후 1분 간격으로 4℃씩 온도를 증가시켜 최종온도가 250℃로 2분간 유지되게 하여 측정하였으며, 디텍터(detector)의 온도는 260℃, 주입부(injector)의 온도는 250℃로 유지하였다. 상기 실시예 3에서 얻어진 각 추출 분획 다당류 2mg씩을 2N TFA로 가수분해하고 소디움 보라이드(NaBH₄)로 환원시킨 다음, 무수초산으로 아세칠화 시켜 애디톨 아세테이트(aditol acetate)로 만들어 상기의 조건에서 가스 크로마토그라피를 실시하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타냈다.

면역활성분획 다당류의 구성당 및 구성비율

추출분획다당류	탄수화물(%)	단백질(%)	구성당(몰비 %)
추출분획다당류	탄수화물(%)	단백질(%)	글루코스	만노스	갈락토오스
PL-2	82.7	17.3	78.6	18.0	3.4

실시예 6. 면역증강활성 다당류물질의 구조분석

면역증강활성 다당류 PL-2에 대한 구조분석을 시행하였다. 먼저, 순수도를 HW 65F 겔 칼럼 크로마토그라피를 하여 확인하였다. 이 크로마토그라피에서 단일 대칭 피크를 나타내어 PL-2의 순수도가 확인되었다(도 4). 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 분석결과(도 5), 알파(1→4) 및 베타(1→6) 타입의 글루코오스 단당류의 긴사슬 결합양식에 만노스와 갈락토오스가 가지 형태로 부착되어진 갈락토만노글루칸(Galactomannoglucan)으로 확인되었다. 이상의 결과는 구성 단당류 성분결과와 잘 일치하며, 추출분획 단당류 PL-2가 베타-글루칸과는 상이한 구조를 가진 신규 다당류임이 확인되었다.

실시예 7: 펠리누스속 균주 배양 균사체의 추출, 정제 및 면역증강활성 조사

상기 실시예 1 ~ 4까지 실시했던 방법과 동일하게 펠리누스속에 속하는 펠리누스 이그니아리우스(Phellinus igniarius), 펠리누스 바우미(P. baumi), 펠리누스 피니(P. pini), 펠리누스 길브우스(P. gilvus) 및 펠리누스 리그리칸스(P. nigricans)를 배양하고 균사체를 추출, 정제한 후 T-세포와 B-세포 등 임파구의 각각에 대한 세포독성 작용과 면역작용체인 항체형성을 유도하여 항체형성 림포사이트를 계수하고 임파구와 T-세포의 증식정도를 측정하여 항암면역활성을 간접적으로 증명하였다. 결과는 상기 실시예 4와 거의 같음을 알 수 있었다.

실시예 8: 펠리누스속 균주 자실체의 추출, 정제 및 면역증강활성 조사

상기 실시예 1 ~ 4까지 실시했던 방법과 동일하게 펠리누스속에 속하는 펠리누스 이그니아리우스(Phellinus igniarius), 펠리누스 바우미(P. baumi), 펠리누스 피니(P. pini), 펠리누스 길브우스(P. gilvus) 및 펠리누스 리그리칸스(P. nigricans)를 배양하고 자실체를 수득하여 추출, 정제한 후 T-세포와 B-세포 등 임파구의 각각에 대한 세포독성 작용과 면역작용체인 항체형성을 유도하여 항체형성 림포사이트를 계수하고 임파구와 T-세포의 증식정도를 측정하여 항암면역활성을 간접적으로 증명하였다. 결과는 상기 실시예 4와 거의 같음을 알 수 있었다.

이상 실험예와 실시예를 들어 설명한 바와같이, 본 발명은 펠리누스속 균사체로부터 T-세포와 B-세포등 임파구의 각각에 대한 세포 독성 작용과 면역작용체인 항체 형성을 유도하여 면역활성이 증가됨으로서 항암면역활성을 나타내는 다당류를 제공할 수 있는 효과가 있어 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

펠리누스속 배양균사체 또는 자실체로부터 추출 정제하여 얻은 신규한 면역활성 다당류물질.
제1항에 있어서, 상기 다당류물질이 만노스, 갈락토오스 및 글루코오스로 구성됨을 특징으로 하는 천연물질.
상황 균주를 포도당, 효모추출액, 펩톤이 함유되어 있는 배지에서 배양하여 얻은 균사체 또는 자실체를 열수로 추출하고 에탄올로 침전시킨 다음 물로 현탁하고 투석막으로 투석하여 면역증강활성 분획을 얻은 후, DEAE 셀룰로스 크로마토그라피와 겔 크로마토그라피를 순차적으로 수행하여 분리정제함을 특징으로 하는 신규한 면역증강활성 다당류의 제조방법.
펠리누스속 균사체 또는 자실체로부터 얻은 다당류 및 그 유도체로의 항암 면역활성증강제 또는 허용가능한 약학적 조성물