KR100487945B1 - 면역증강활성을 갖는 고추잎 추출물 및 그 제조방법 - Google Patents
면역증강활성을 갖는 고추잎 추출물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고추잎의 보체계 활성 및 대식세포 촉진 활성으로 인한 면역증강기능이 있는 유효성분들을 추출 및 정제하는 방법을 제공하는 효과가 있다. 또한 본 발명의 유효성분은 총당이 51.8%, 산성당 8.2%, 단백질 16.8%로 구성되며, 주(主) 구성당은 아라비노우즈, 글루코우즈, 갈락토우즈이며, 높은 보체계 활성을 갖고 있어, 고추잎의 유효성분을 기능성 식품의 원료로 사용하여 기능성 가공제품을 제조함에 있어 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 면역증강활성을 갖는 고추잎 추출물에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 총당이 51.8%, 산성당 8.2%, 단백질 16.8%이고, 주(主) 구성당은 아라비노우즈, 글루코우즈 및 갈락토우즈이며, 높은 보체계 활성으로 인한 면역증강활성을 갖는 고추잎의 유효성분 및 그 분리방법에 관한 것이다.
현대인의 식생활이 고열량 ·고지방식품을 과다 섭취하는 경향으로 바뀌어, 고혈압을 비롯한 순환계 질환, 류마치스성 관절염 등 성인병 질환 발생비율이 증가되고 있으나 효과적인 치료방법이 개발되지는 못하고 있는 실정이다. 그러나 생약재, 식품재료 등에 함유된 특정성분들이 호르몬계, 신경계, 생체방어계 등과 각종 대사계에 적절히 작용하여 항상성을 유지하게 한다는 사실이 보고되고 있다. 현재 보고된 약용식물들의 생리효과로는 항암효과, 항 염증효과, 식세포강화작용, 혈당강화효과, 항 응고활성 등이 있으며, 실제로 당귀, 시호, 대복피, 인삼엽, 계피 등의 한약재와 버섯류, 고추, 청각, 고사리, 마늘, 호박 등에 생리기능 촉진효과가 있음이 보고되고 있다. 식품소재를 포함하여 천연물질로부터 항암제 등의 신약개발 또는 면역 부활기능을 가진 물질에 대한 연구가 진행 중이나, 원재료의 높은 가격, 원재료 수급상의 난점 등 초기단계부터 어려움이 있고, 비 식품소재일 경우 독성, 임상조사 등으로 인해 많은 시간과 노력이 필요하다. 그러나 식품으로 이용되며 대량공급이 원활한 소재 중 고추잎에서 보체계 활성이 있음이 발견되었고, 이미 고추의 냉수 및 열수추출물에서 보체계 활성이 있음이 밝혀졌다. 고추는 농가의 중요한 작물로서 매년 대량 생산되고 있으나, 과잉재배 및 생산으로 인한 가격폭락으로 폐기처분되는 양이 매년 증가하고 있고, 특히 고추잎은 그 이용도가 매우 낮은 실정이다.
따라서 본 발명의 목적은 고추잎의 보체계 활성 및 대식세포 촉진 활성으로 인한 면역증강 기능이 있는 유효성분들의 추출 및 정제하는 방법을 제공함에 있다. 또한 본 발명의 다른 목적은 고추잎의 면역증강 활성이 있는 유효성분을 기능성 식품의 원료로 사용하여 기능성 가공제품을 제조하는 데 있다.
본 발명의 상기 목적은 고추잎을 열수추출하고, 메탄올 환류하며, 에탄올 침전하여, 투석 및 동결건조한 후 고추잎의 유효성분을 분리하고, 분리한 유효성분을 정량 분석하여, 항보체 활성을 측정함으로써 달성하였다.
본 발명은 고추잎을 열수추출하는 단계; 메탄올 환류 단계; 에탄올 침전 단계; 투석 및 동결건조하는 단계; 분리한 유효성분의 정량 분석 단계; 항보체 활성 측정단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험재료의 선택
본 발명의 재료인 고추잎은 4월 말 일반 재래시장에서 구입하여 세척한 다음 건조하여 잎부분과 줄기부분으로 분리하여 사용하였다.
본 발명에 사용된 시약에 있어서, 양의 감작 적혈구(IgM hemolysin sensitized sheep erythrocyte, EA cell)는 일본 바이오 테스트사(Bio test)로부터 구입하였고, 혈청(정상인의 혈청, NHS)은 실험실의 건강한 성인의 혈액으로부터 추출하여 사용하였다. DEAE 세파로우즈 CL-6B, 도벡스-1 레진(Dowex-1 resin), 프로나제(pronase), 표준 덱스트란(T-2000, T-500, T-70, T-40, T-10, 글루코우즈)은 시그마사(Sigma) 제품을, Sep-pak C18 카트리지는 워터스사(Waters) 제품을 구입하여 사용하였다. TLC 플레이트(cellulose coated plastic sheet, 5577)와 5,5/-디에틸 바비튜린산 소디움 염(5,5/-diethyl barbituric acid sodium salt)는 머크사(Merck) 제품을, TFA(trifluoroacetic acid)와 소디움 퍼록시데이트(sodium perioxidate)는 알드리치사(Aldrich)에서 구입하여 사용하였다. 그 외 기타 시약은 시판 일급 혹은 특급 시약을 사용하였다.
실시예 2: 유효성분의 추출
제 1단계: 유효성분의 추출
본 발명의 고추잎의 유효성분을 추출하기 위하여, 고추잎 600g을 10배 부피의 증류수로 3회에 걸쳐 열수추출한 다음, 얻은 열수추출물을 메탄올로 5회 환류 추출하여 메탄올 가용 성분을 분리하였고, 상기 메탄올 추출로 부터 얻은 메탄올 비가용 성분을 소량의 증류수에 녹인 후 5배 부피의 에탄올을 가해 4oC에서 24시간 교반하여 에탄올 가용 성분과 침전 성분을 분리하였다. 상기 침전 성분을 물에 재용해하여 3일간 증류수로 투석한 다음 비투석 분획을 농축, 동결건조시켜 조다당(CAL-0, 186 g)을 분리하였다(도 1).
제 2 단계: DEAE 세파로우즈 CL-6B 이온-교환 크로마토그래피에 의한 항보체 활성 다당의 분리
조다당 CAL-0(500mg)를 증류수에 녹인 후 증류수로 평형화시킨 DEAE 세파로우즈 CL-6B 컬럼(4.0 x 25 cm)에 흡착시키고, 증류수와 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2M 농도의 NaCl용액으로 용출시켜 8개의 분획을 얻었다.
실시예 3: 시료성분의 분석
제 1단계: 시료성분의 정량 분석
본 발명의 시료성분을 정량함에 있어서, 총당 함량은 아라비노우즈와 글루코우즈를 1:1로 섞어 표준물질로 사용하여 페놀-황산법(phenol-sulfuric acid)으로 정량하였으며, 산성당 함량은 베타-디-갈락튜론 산(β-D-galacturonic acid)을 표준물질로 하여 m-하이드록시다이페닐법(m-hydroxydiphenyl)으로 정량하였으며, 단백질 함량은 소의 혈정 알부민(bovine serum albumin)을 표준 물질로 하여 Lowry법으로 정량하였다.
제 2단계: 시료성분의 구성당 분석
1. 티엘시 크로마토그래피(Thin layer chromatography(TLC))
2M TFA로 121oC에서 1시간 30분 동안 가수분해 한 시료를 셀룰로우즈로 코딩한 플라스틱 시트(cellulose coated plastic sheet, Merck, 5577)에서 에틸 아세테이트, 피리딘, 물, 아세트산(5:5:1:3, v/v)을 전개 용매로 사용하여 전개시킨 다음, 환원당 분석을 위해서는 알칼라인 실버 나이트레이트(alkaline silver nitrate)로, 산성당 분석을 위해서는 n-아니시딘(n-anisidine)으로, 아미노당 분석을 위해서는 닌히드린(ninhydrin)으로 발색시켜 람노우즈, 아라비노우즈, 자일로우즈, 만노우즈, 갈락토우즈, 글루코우즈, 갈락튜론 산, 갈락토사민과의 Rf 값을 비교하여 분석하였다.
2. 가스 액체 크로마토그래피(Gas liquid chromatography(GLC))
시료(1-3mg)를 2M TFA로 121oC에서 1시간 30분 동안 가수분해한 후 소디움 보로하이드라이드(sodium borohydride, NaBH4)를 이용하고, 중성당은 알디톨(alditol)로, 산성당은 알도닉산(aldonic acid)으로 각각 환원시킨 다음, 도벡스-1(음이온-교환 레진, 아세테이트 형) 레진으로 분리하였다. 알도닉산에 소디움 보로하이드라이드를 처리하여 다시 알디톨로 환원시킨 다음, 아세틱 안하이드라이드(acetic anhydride)를 이용하여 각각 알디톨 아세테이트 유도체로 전환시켜 가스 액체 크로마토그래피로 구성당을 분석하였다. GLC의 분석 조건은 표 1과 같으며, 표준 구성당들의 보유시간과 비교하여 시료 중의 구성당을 분석하였다. 구성당의 몰 비율은 각 최고점(peak)의 면적비와 구성당들의 알디톨 아세테이트 유도체의 분자량으로부터 계산하였다.
| 기계검출기컬럼 컬럼온도주입타입검출기 온도담체가스수소보유시간 | Varian Co., Gas chromatography 3600Flame ionization detector (FID)Supelco inc. Fused silica capillary columnID : 30m× 0.25mm, film tickness : 0.20㎛260℃온도변환프로그래밍260℃N2(15psi)15 psi30분 |
제 3단계: 항보체 활성의 측정
본 발명의 고추잎의 유효성분의 항보체 활성의 측정은 시료에 의한 보체 소비 후 잔여 보체에 의한 적혈구 용혈 정도를 측정한 보체 고정 시험(complementary fixation test)으로 하였다. 즉, 여러 농도로 증류수에 녹이거나 분산시킨 시료에 정상인의 혈청과 2% 젤라틴, 3mM Ca++, 10mM Mg++이 함유된 GVB++(젤라틴 베로날 완충 식염수, gelatin veronal buffered saline, pH 7.4)을 각각 50㎕씩 혼합하여 37oC에서 20분간 1차 반응시킨 다음, 이 반응액에 GVB++를 350㎕ 첨가하고 이를 10-160배로 연속 희석하였다. 여기에 다시 750㎕의 GVB++를 첨가하고 양의 감작 적혈구(EA cell)를 250㎕ 첨가하여 37oC에서 60분간 2차 반응시킨 다음, PBS(인산염 완충 식염수, pH 7.4) 2.5ml을 넣어 반응을 정지시켰다. 이 반응액을 2800rpm에서 약 10분간 원심분리한 후 얻어진 상등액의 흡광도를 412nm에서 측정하였다. 항보체 활성은 NHS와 완충액, 시료대신 증류수만을 반응시킨 대조군의 총보체 용혈(50%의 총보체 용혈, TCH50 %)에 대한 억제율(50%의 총보체 용혈의 억제율, ITCH50 %)로 나타냈다.
제 4단계: 항보체 활성 본체의 규명.
1. CAL-0의 프로나제 처리
CAL-0(30mg)를 10mM CaCl2가 함유된 50mM tris-HCl buffer(pH 7.9) 50ml에 용해시킨 후 10mg의 프로나제를 가하여 37oC에서 48시간 동안 반응시켰다. 효소 활성을 위해 5분간 가열한 반응액을 원심 분리하여 불용성 침전을 제거한 한 후 상등액을 투석, 동결건조하여 CC-1의 프로나제 소화물을 얻었다.
2. CAL-0의 퍼아이오데이트 처리
CAL-0(30mg)를 50mM 아세테이트 완충액(pH 4.5) 50ml에 녹인 후 50mM 소디움 페록시데이트(NaIO4)를 가한 혼합물을 4oC 암소에서 3일간 교반, 방치하였다. 남아있는 퍼아이오데이트를 제거하기 위해 반응액에 에틸렌 글리콜 5ml을 첨가한 후 투석하고, 비투석 분획을 약 10ml정도로 농축하였다. 이 농축액에 NaBH4를 20mg 가하여 실온에서 12시간 교반하여 환원시킨 후 중화하여 투석하고, 비투석 분획을 동결건조하여 퍼아이오데이트 산화물을 제조하였다.
이하, 상기 실험의 결과를 나타낸 것이다.
표 1은 본 발명의 고추잎의 보체계 활성을 갖는 유효성분을 알아보기 위해, 고추잎을 잎부분과 줄기부분으로 분리한 다음, 각각 10 g을 열수추출 및 냉수추출하여 보체계활성과 수율을 비교한 결과를 나타낸 것으로서, 줄기부분은 잎부분 보다 다소 높은 수율을 나타냈으나 보체계활성과 포스파타아제 활성으로 측정한 대식세포 활성은 잎부분의 열수와 냉수추출물이 다른 부위의 추출물보다 높았으며, 특히 열수추출물에서 높은 보체계 활성을 나타냈으므로 향후, 잎부분을 대상으로 다음 실시예를 수행하였다.
| 잎의 열수추출물 | 줄기의 열수추출물 | 잎과 줄기의 열수추출물 | 잎의 냉수추출물 | 줄기의 냉수추출물 | 일과 줄기의 냉수추출물 | |
| TCH50 (%) | 71.4 | 1.80 | 9.03 | 41.7 | 9.8 | 1.80 |
| 대식세포포스파타아제활성(%) | 42 | 30 | 38 | 40 | 34 | 14 |
| 수율(5) | 19.3 | 23.1 | 15.6 | 10.9 | 13.2 | 13.7 |
ITCH50 (%): 총 보체 활성의 억제율
시료의 농도: 1000 mg/ml
항보체성 다당류의 양성 대조군: CAP-0 (고추 열매의 조다당, 90%)
포스파타아제의 양성 대조군: 리포다당 (50%)
도 2는 본 발명의 고추잎으로부터 보체계를 활성화 시키는 유효성분을 추출하는 과정에서 얻은 고추잎의 메탄올-가용 성분, 에탄올-가용 성분 및 조다당(CAL-0)의 항보체 활성을 나타낸 그래프이다. 상기 실시예 3의 표 2과 같이 고추줄기보다는 고추잎에서 보체계 활성이 있음을 발견하였으므로 고추잎을 재료로 사용하여 도 1의 분리과정을 거쳐 유효성분을 추출하였는 데, 이 과정에서 얻은 메탄올과 에탄올 가용 성분과 조다당의 항보체 활성을 비교한 결과, 메탄올과 에탄올 가용 성분의 항보체 활성은 조다당에 비해 75%이상의 낮은 활성을 보여 고분자 분획인 조다당(CAL-0)에 항보체 활성이 있음을 확인하였다. 조다당(CAL-0)은 총당 51.8%, 단백질 16.8%, 산성당 8.2%을 함유하고 있었으며, TLC 실험 결과 산성당은 갈락투론산 임을 확인하였다. 상기 조다당(CAL-0)은 갈락토우즈, 글루코우즈 및 높은 비율의 아라비노우즈로 구성되어 있었다. 또한 조다당(CAL-0)의 다른 생리활성을 조사한 결과, 대식세포 활성은 대조군에 비해 약 150% 정도 높게 나타났으나 아세틸콜리네스터라아제 활성, 02
- 생성 저해능 및 DPPH 세정 활성은 발견되지 않았다(미도시됨). 이러한 활성들은 일반적으로 저분자 물질에 존재하는 것으로 보고되어 있어 본 발명의 고분자 다당에는 존재하지 않음을 알 수 있었다.
도 3은 프로나제를 처리한 CAL-0 또는 퍼아이오데이트를 처리하여 산화된 조다당 CAL-O의 항보체 활성을 나타낸 그래프이다. 본 발명의 고추잎의 유효성분 추출물인 조다당 CAL-0은 소량의 단백질을 함유하고 있으므로, 프로나제를 처리하여 단백질을 분해하고 퍼아이오데이트를 이용하여 다당 부위를 선택적으로 산화시킨 후, 각각의 활성을 대조군인 CAL-0과 함께 조사하여 조다당 CAL-0의 보체계를 활성화시키는 물질의 본체를 파악하고자 하였다. 그 결과, 프로나제를 처리한 CAL-0에서는 보체계 활성능이 그대로 유지된 반면, CAL-0의 퍼아이오데이트 산화물은 활성이 50% 이하로 감소되었다. 이러한 결과는 현재까지 알려진 보체계 활성화 물질들이 대부분 식물체로부터 분리된 다당인 것처럼 고추잎의 보체계 활성화 물질도 다당 성분에서 기인됨을 확인할 수 있었다.
도 4는 DEAE 세파로우즈 CL-6B를 이용한 이온 교환 크로마토그래피로 분리한 조다당(CAL-0) 재분획물의 항보체 활성을 나타낸 그래프이며, 도 5는 조다당(CAL-1)을 DEAE 세파로우즈 CL-6B 컬럼에 통과시켜 얻은 분획물들의 항보체 활성을 나타낸 그래프로서, 본 발명의 고추잎의 유효성분 추출물인 조다당 CAL-0를 DEAE 세파로우즈 CL-6B에서 0→2 M NaCl로 이온교환 크로마토그래피를 행하여 1개의 비흡착 분획(CAL-1)과 7개의 흡착 분획(CAL-2~CAL-8)을 얻은 후, 이들 분획의 보체계 활성을 조사하였다. 1000 ug/ml의 농도의 시료에서, 0.4 M NaCl에서 용출된 CAL-5 분획은 다른 분획 보다 수율은 낮았으나 80% 정도로 비교적 높은 활성을 나타냈으며, 다음으로는 0.1 M NaCl 용출물 (CAL-2)과 비흡착 분획 순으로 나타났다. 이들 분획 각각의 당 함량, 단백질 함량, 산성당 함량을 측정한 결과 표 3과 같이 총당 함량은 비흡착 분획인 CAL-1에서 81.6%로 가장 높았으며, 단백질 함량은 0.5 M과 1 M NaCl 용출물에서 45%이상의 높은 함량을 보였고, 산성당 함량은 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M NaCl 용출물에서 만 측정되었다. 구성당의 조성은 전(全)분획에서 아라비노우즈와 갈락토우즈가 주(主) 구성당이었으며, 비흡착 분획과 0.4M NaCl 이상의 분획에서 비교적 높게 나타났다.
| CAL-1(DIW) | CAL-2(0.1M) | CAL-3(0.2M) | CAL-4(0.3M) | CAL-5(0.4M) | CAL-6(0.5M) | CAL-7(1M) | |
| 총당산성당단백질생산량 | 81.6013.419.8 | 52.207.819.0 | 61.112.214.130.0 | 48.420.06.222.2 | 31.615.524.44.4 | 27.4045.73.8 | (%)16.1049.21.8 |
| 중성당(몰비율) | |||||||
| 람노우즈아라비노우즈자일로우즈만노우즈갈락토우즈글루코우즈 | 0.201.140.190.681.002.76 | 근소값0.94근소값0.121.000.27 | 0.581.08근소값근소값1.000.12 | 1.601.35근소값근소값1.000.17 | 1.700.780.130.231.000.94 | 0.571.02근소값0.411.002.37 | 0.731.080.140.361.001.40 |
이상과 같이 본 발명은 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 고추잎의 보체계 활성 및 대식세포 촉진 활성이 있는 유효성분들의 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 효과가 있다. 또한 본 발명의 유효성분은 총당이 51.8%, 산성당 8.2%, 단백질 16.8%로 구성되며, 주(主) 구성당은 아라비노우즈, 글루코우즈, 갈락토우즈이며, 높은 보체계 활성으로 인한 면역증강 기능을 갖고 있어, 고추잎의 유효성분을 기능성 식품의 원료로 사용하여 기능성 가공제품을 제조함에 있어 뛰어난 효과가 있으므로 식품가공산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1은 고추잎으로부터 조다당(CAL-0)을 분리하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 고추잎의 메탄올-가용 성분, 에탄올-가용 성분 및 조다당(CAL-0)의 항보체 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 프로나제를 처리한 CAL-0 또는 퍼아이오데이트를 처리하여 산화된 조다당 CAL-O의 항보체 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 DEAE 세파로우즈 CL-6B를 이용한 이온 교환 크로마토그래피로 분리한 조다당(CAL-0) 재분획물의 항보체 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 조다당(CAL-1)을 DEAE 세파로우즈 CL-6B 컬럼에 통과시켜 얻은 분획물들의 항보체 활성을 나타낸 그래프이다.
Claims (2)
- 고추잎을 증류수로 3회 열수추출하고, 상기 열수추출물을 메탄올로 5회 환류추출하며, 상기 추출에서 얻은 메탄올 비 가용성분에 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 교반하며, 상기 에탄올 침전 성분을 증류수로 3일간 투석하며, 상기 비투석 분획을 농축 및 동결 건조하는 단계를 포함하는 면역증강용 고추잎 추출물의 제조 방법.
- 제 1항의 제조 방법에 의해 제조되며, 주(主)구성당이 아라비노우즈, 글루코우즈, 갈락토우즈인 면역증강용 고추잎 추출물.
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-
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