KR100379189B1 - 헬리코박터 파이로리에 의한 위질환 치료제용 조성물 및그 탐색방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 헬리코박터 파이로리에 의한 위질환 치료제용 조성물 및 그 탐색방법에 관한 것으로 쑥(Artemisia capillaris)을 증류수 추출하고 CPC(cetylpyridinium chloride)와 에타놀로 침전한 다음 수용성 추출물을 획득한 후, 이온교환 크로마토그래피로 정제한 산성다당류(acidic polysaccharide)는 헬리코박터에 의한 적혈구 응집반응 및 페투인-퍼록시다제 결합체(peroxidase-conjugated fetuin)의 헬리코박터 접합반응을 억제하는 효과가 있고, 페투인(fetuin)이나 뮤신(musin) 같은 당단백질을 호스래디쉬 퍼록시다아제(horse
radish peroxidase; HRP)에 접합시킨 신규 효소표식 당배합체법(enzyme-linked glycosorbent assay; ELGA)은 천연물이나 여러 화합물 중에서 헬리코박터 접합반응을 저해하는 생리활성물질을 탐색할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 헬리코박터 파이로리에 의한 위질환 치료제용 조성물 및 그 탐색방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 쑥(Artemisia capillaris)을 증류수 추출하고 CPC(cetylpyridinium)침전 및 NaCl을 처리하여 수용성 추출물을 획득하고, 다시 에타놀을 이용 침전하여 이온교환 크로마토그래피로 정제함으로써 제조한 헬리코박터 파이로리의 위장내 증식을 저해하는 효과가 있는 산성다당류(acidic polysaccharide) 및 그 제조방법과 페투인(fetuin)과 뮤신(musin)과 같은 당단백질을 호스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase; HPR)에 접합시켜 헬리코박터 파이로리의 숙주세포 접합을 억제하는 생리활성물질의 탐색방법에 관한 것이다.
헬리코박터는 그램음성(Gram-negative) 박테리아로서 인체에 만성, 급성위염, 위궤양 및 위암 등을 유발하는 것으로 알려진 병원체이다. 산업사회의 경우 60세 이상의 인구 중 과반수 이상이 감염되어 있으며, 개발 도상국가에서는 대부분의 인구가 유년기부터 감염되어 있는 것으로 보고되어 있다. 2살부터 8살 사이 유아의 경우 약 10%가 매년 감염되기 때문에 10대 청소년이 되면 거의 대부분이 감염되는 추세를 보이고 있다. 1999년 현재 국내에서는 회사원이나 전문직 직업을 갖은 사람에게서 높은 감염율을 보이고 있으며, 20대 이후 70%이상의 높은 감염율을 보이고 있다. 이전에는 위염, 위궤양과 같은 위장 질환이 일차적으로 위산과다, 즉 과량의 위산 분비에 기인하며, 원인으로 스트레스, 식품 및 유전적 요인 등에 의하여 염증이 생긴다고 알려져 왔지만, 최근에 와서 헬리코박터에 의하여 감염되었을 때 염증이 발생한다는 것이 정설로 되어 있다. 염증이 위장내 점막하층까지 퍼지게 되면 위궤양으로 발전하게 되고, 위암으로 바로 진행되는 것은 아니지만, 헬리코박터에 감염되면 위암으로 진행될 가능성이 3-5배 정도 높아지는 것으로 알려지고 있다. 수년 전 까지 이들 질환의 치료를 위하여 제산제(antacid), 히스타민 수용체의 길항작용제 등이 사용되어 왔다. 미국 국립보건원은 90년대 중반에 와서야 헬리코박터와 위장질환과의 관계를 인정하여 테트라사이클린(tetracycline)이나 아목시실린(amoxicillin)과 같은 항생제의 사용을 다른 치료제와 병행하여 사용할 수 있도록 허용하고 있다. 최근 헬리코박터 박멸을 위한 3중 치료법(triple therapy)은 2-3 주동안 intensive한 치료를 요구하고 있다. 그러나 항생제의 사용에 따른 인체내의 축적, 부작용 및 내성을 갖는 박테리아의 출현때문에 궁극적으로는 위질환을 치료할 수 있는 대체약품의 개발이 요망되고 있다. 국내, 외 위질환 치료제 및 예방용 제재의 개발현황을 보면, 면역시스템이나 항균제를 이용하거나, 박테리아 세포외 배출효소를 이용한 키트의 제조가 주류를 이루고 있으며 아직까지 세포인식에 관여하는 당배합체를 이용한 제재의 개발은 전무한 상태이다.
종래에 보고된 바에 의하면 헬리코박터는 위장내 점막 상피세포에 결합하는데, 결합 기작이 주로 탄수화물과 이를 인식하는 박테리아 표면 단백질간의 상호작용에 의존하는 것으로 보고되고 있다. 특히 인식 탄수화물로는 뮤신(mucin) 당단백질의 황산화당(sulfated carbohydrate), 사이알릴 락토스(sialyllactose) 및 퓨코실 루이스 비 항원(fucosylated Lewis b antigen) 등이 보고되어 있다. 최근에는글라이코 스핑고리피드(glycosphingolipid)나 침속에 있는 뮤신단백질을 이용하여 박테리아의 세포결합을 저해하려는 노력이 경주되고 있다. 이미 박테리아 표면 단백질수용체(adhesin)의 분리와 동정이 이루어져 있고, 인식 탄수화물을 이용한 당배합체의 개발은 매우 중요한 발명대상에 속한다. 기존의 항생제나 화학약품을 이용하면 부작용 뿐만 아니라 개발기술이 세포 파괴적인 반면, 숙주세포 표면의 탄수화물 인식 및 상호작용을 저해하는 신물질은 세포간 결합을 저해하여 위장밖으로 유출시켜 위염증을 최소화하는 비파괴적 기술이라는 점에서 중요한 의미를 갖고 있다.
그러나 아직까지 헬리코박터 파이로리의 위장내 증식 및 활동을 저해하는 쑥 유래의 다당류에 대해 연구된 바 없다.
본 발명자들은 상기와 같은 점을 착안하여 헬리코박터의 위장내 증식 및 활동을 저해하는 생리활성 물질로 자생식물인 쑥에서 산성다당류를 분리정제하고 적혈구 응집반응과 당단백질인 페투인(fetuin)에 HRP(horseradish peroxidase)를 결합시켜 발명한 효소표식 당배합체법(ELGA)으로 쑥 유래 산성다당류의 헬리코박터 파이로리의 저해활성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 쑥 유래의 헬리코박터 파이로리의 저해활성을 가지는 산성다당류를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 헬리코박터 파이로리의 저해활성을 가지는 산성다당류의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 헬리코박터 파이로리의 결합을 저해하는 생리활성물질의 탐색방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 쑥에 증류수를 가하여 추출물을 얻고 염화나트륨 농도기울기에 따라 이온크로마토그래피로 산성다당류를 분리정제하고 상기 산성다당류의 황화 그룹(sulfate group)분석, 헬리코박터에 의한 적혈구 응집반응 저해활성을 측정하고, 페투인(fetuin)에 HRP(horseradish peroxidase)을 결합시킨 다음 Superdex gel filtration FPLC를 이용하여 결합되지 않은 페투인(fetuin)과 HRP와 결합된 페투인(fetuin)을 분리 및 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis)로 확인하고 상기 제조한 페투인-퍼록시다제 결합체(Peroxidase-conjugated fetuin)을 이용한 효소표식 당배합체법(enzyme-
linked glycosorbent assay; ELGA)으로 헬리코박터 파이로리의 숙주세포 결합 억제활성을 확인함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 쑥으로부터 본 발명 산성다당류의 분리 및 정제과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 이온교환수지 크로마토그래피에서 쑥 수용성 추출물의 유출프로필을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명 산성 다당류의 황화 그룹(sulfate group)을 분석하기 위한 표준화 곡선(standard curve)을 나타낸 것이다.
도 4는 페투인-HRP 결합체(Fetuin-HRP complex)의 젤 여과 크로마토그래피 유출 프로필을 나타낸 그래프이다.
도 5는 SDS-PAGE 상에서의 페투인-HRP 결합체(fetuin-HRP conjugate)와 서로 결합되지 않은 페투인, HRP가 분자량에 따라 구별됨을 나타낸 사진이다.
도 6은 효소표식 당배합체법(ELGA)을 이용하여 헬리코박터 파이로리의 숙주세포 접합반응 저해비율을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 쑥에 40 ∼ 100℃ 증류수를 1:5(w/v)의 비율로 첨가하고 마쇄한 다음 원심분리하여 상등액을 얻고 5% CPC(cetylpyridinium chloride)용액을 이용하여 침전시킨 후 10% NaCl 용액으로 남아있는 CPC(cetylpyridinium chloride)를 투석 제거한 다음 에탄올 침전하고 이를 최소부피의 20mM Tris 완충용액 (pH 8.0)에녹여 투석한 후 0-1M 염화나트륨 용액 농도기울기로 이온교환 크로마토그래피하여 산성다당류를 제조하는 단계; K2SO4를 이용하여 표준 곡선(standard curve)을 만들고 상기 산성다당류의 황화 그룹(sulfate group)을 분석하는 단계; 헬리코박터 용액과 상기 산성다당류를 혼합한 후 적혈구 용액에 반응시켜 적혈구 응집반응을 조사하는 단계; HRP(horseradish peroxidase)를 활성화시킨 다음 페투인(fetuin)을 혼합하여 반응시키고 Superdex gel filtration FPLC를 이용하여 결합되지 않은 페투인(fetuin)과 HRP와 결합된 페투인(fetuin)을 서로 분리하고 SDS-PAGE로 확인하는 단계; 상기 제조된 페투인-퍼록시다제 결합체(peroxidase-conjugated fetuin)을 이용한 효소표식 당배합체법(ELGA)으로 헬리코박터 접합반응에 대한 저해활성을 측정하는 단계로 구성된다.
본 발명에 이용된 DEAE-Sepharose CL-6B 이온교환 수지는 아마샴-파마시아 바이오텍(Amersham Phamacia Biotech, Sweden)에서 구입하였다.
본 발명에 사용된 트리클로아세틱산, 젤라틴, 페투인(fetuin). 뮤신, 호스래디쉬 퍼록시다제(HRP), BaCl2, K2SO4등은 시그마사(Sigma, USA)에서 구입하였다.
본 발명의 적혈구 응집반응에 이용된 AB형 적혈구는 고대 안암병원에서 구입하여, 항응고제와 트립신효소 처리를 한 다음 이용하였다.
본 발명에서 이용한 헬리코박터 파이로리 박테리아는 10% 소혈청, 브루셀라(Brucella) 배지에서 37oC, 12% 이산화탄소 조건에서 72 시간 배양하였으며, 인산 완충용액을 이용하였다.
전체 탄수화물, 유로닌산(uronic acid) 및 단백질의 양은 페놀-황산방법, 카바졸(carbazole), 및 로우리(Lowry) 방법을 각각 포도당, 갈락튜로닌산
(galacturonic acid), 소혈청 알부민을 표준으로 사용하여 결정하였다.
본 발명 산성다당류는 쑥 함유성분의 분리 및 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 획득할 수 있다.
이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: 쑥으로부터 산성다당류의 분리
쑥 (Artemisia capillaris)으로부터 산성 다당류의 분리 및 정제과정을 도 1에 나타내었다. 즉, 쑥을 뜨거운 증류수(40∼100oC)로 추출하여(w/v=1:5), 10,000 g에서 원심분리한 후 상등액을 얻었다. 이들 상등액을 모아 5% CPC(cetylpyridinium chloride)용액을 이용하여 혼합하면서 3시간정도 반응시키고 원심분리한 다음 침전물을 얻었다. 10% NaCl 용액을 이용하여 남아있는 CPC를 투석 제거한 다음, 에탄올에 3시간 정도 침지시키고 원심분리를 이용하여 침전시켰다. 이를 최소부피의 20mM Tris 완충용액 (pH 8.0)에 녹여 투석후 0-1M 염화나트륨 용액 농도기울기로 이온교환 크로마토그래피하여 분리하였다(도 2). 분리된 다당류는 투석한 다음 동결건조하였다. 비결합성 분획과 달리, 결합성 분획은 활성이 있는 분획임을 확인하였다.
실시예 2: 본 발명 산성다당류의 황화그룹 (sulfate group)분석
상기 실시예 1에서 얻은 다당류 분획들을 60%(w/v) 포믹산(formic acid)용액에 넣고, 100oC에서 8시간 동안 가수분해하였다. 진공 데시케이터(Vacuum desicator)를 이용하여 KOH pellet 상에서 시료를 건조시키고, 증류수에 용해시켜 사용하였다. 가수분해한 시료들을 4% 트리클로로아세틱산 용액과 젤라틴용액(2g 젤라틴을 뜨거운 증류수 400mL에 넣어 4 oC에서 6시간이상 침지시킨 후 20g BaCl2를 다시 용액에 넣고, 2-3시간 침지시킨 다음 사용)를 혼합한 다음 15분간 방치하고, 흡광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 500nm에서 opacity를 측정하였다.
정량분석 결과, 도 3에 나타낸 K2SO4를 이용한 표준 곡선(standard curve)로부터 쑥에서 추출분리된 분획은 0.3㎍/uL의 농도를 가짐을 확인하였다.
실시예 3: 본 발명 산성다당류의 적혈구 응집반응
세포와 세포간 인식작용에 이용되어온 적혈구 세포의 표면은 위점막 상피세포와 같거나 비슷한 탄수화물 조성을 보유하고 있으며 헬리코박터와 결합함으로써 응집반응을 일으킨다. 대부분 박테리아 세포는 응집반응을 보이는데, 이는 박테리아 표면에 존재하는 결합단백질이 적혈구와 같은 숙주세포 표면의 탄수화물을 인식함으로써 일어나는 반응이다.
상기 실시예 1에서 얻은 산성다당류의 헬리코박터에 의한 적혈구 응집반응저해활성을 측정하였다. 배양된 헬리코박터를 인산 완충용액으로 묽게 만든 후 동량의 적혈구 용액과 혼합하여 실온에서 30분간 반응시켰으며, 이를 양성 적혈구 응집반응으로 하였다. 분리된 당배합체 분획들을 이용하여 응집반응에 대한 저해활성은 우선 헬리코박터 용액과 당배합체 용액을 혼합하여 15분간 반응시켰다. 다시 적혈구 용액을 혼합하여 2시간 동안 반응시킨 후 응집반응을 측정하였으며, 반응 측정은 현미경을 이용하였다.
실험결과, 여러 분획 중에서도 이온교환 크로마토그래피에서 결합하는 분획, 즉 산성다당류 분획은 응집반응을 저해함으로써 기존에 기 보고된 다당류 분획과 더불어 쑥에서 추출된 다당류 분획 중 특정 분획이 상대적으로 높은 활성을 지닌 것을 확인할 수 있었다. 그러나 응집반응은 정성적인 분석이 가능할 뿐, 기존의 저해제에 비하여 상대적인 혹은 정량적인 비교가 불가능하였다. 따라서 실시예 4에 기술된 바와 같은 페투인-퍼록시다제 결합체를 제조함으로써, 효소표식 당배합체법(ELGA)을 발명하였다.
실시예 4: 페투인-퍼록시다제 결합체(Peroxidase-conjugated fetuin)의 제조
활성 HRP(horseradish peroxidase)를 얻기 위하여, 5 mg HRP를 300 mM bicarbonate (pH 8.1)에 녹였으며, 여기에 5% 2,4-dinitrobenzene 용액을 가하여 실온에서 1시간 가량 서서히 저으면서 방치하였다. 30 mM sodium periodate 용액에서 30분간 산화반응을 유도하였고, 바로 0.16 M 에틸렌 글라이콜에 1시간 방치하였다. 활성화된 HRP는 10mM sodium carbonate 완충용액 (pH 9.5)에 투석하여 4oC에 보관하였다. 2.75 mg 페투인(fetuin)을 10 mM sodium carbonate 용액(pH 9.5)에 녹인 다음 활성화된 HRP를 가하고 3시간 실온에서 저어주면서 방치하였다. Sodium cyanoborohydride를 가하고, 18시간 동안 4oC에서 반응하였다. 반응 혼합물은 PBS 용액(pH 7.4)에 투석하였다. Superdex gel filtration FPLC를 이용하여 도 4에 나타난 바와 같이 결합되지 않은 페투인(fetuin)과 HRP와 결합된 페투인(fetuin)을 서로 분리하였다. 분리된 정도는 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 검사하였다.
실험결과, 도 5에 나타난 바와 같이 SDS-PAGE상에서의 분자량에 따라 페투인-HRP 결합체(fetuin-HRP conjugate)의 구별이 가능하였다.
실시예 5: 페투인-퍼록시다제 결합체를 이용한 본 발명 효소표식 당배합체법
(ELGA)으로 헬리코박터 저해활성 측정
상기 실시예 4에서 제조한 페투인-퍼록시다제 결합체(Peroxidase-conjugated fetuin)을 이용한 본 발명 ELGA (enzyme-linked glycosorbent assay)방법으로 다른 자생식물에서 추출 분리된 일부 물질들 사이의 상대적인 헬리코박터 접합반응 저해활성을 비교하였다.
실험결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 쑥의 산성다당류가 다른 자생식물 인삼에서 추출된 다당류보다 0.5㎎/mL에서 10 mg/mL의 농도범위 내에서 더 효과적으로헬리코박터 파이로리의 숙주세포 접합반응을 저해함을 알 수 있다. 특히 0.5 mg/mL 이상되는 농도범위에서 접합반응 저해율이 30%에서 60%로 증가됨을 관찰하였다.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 헬리코박터에 의한 위질환 치료에 기존의 항생제나 화학의약품의 경우 부작용뿐만 아니라 개발기술이 세포 파괴적인 반면, 본 발명 산성다당류는 헬리코박터의 숙주세포 표면의 세포간 결합을 저해시키고 위장밖으로 유출시켜 위염증을 최소화하는 비파괴적 기술이므로 헬리코박에 의한 위질환 치료에 뛰어난 효과가 있으며, HRP(horseradish peroxidase)에 당단백질을 결합시켜 완성한 효소표식 당배합체법(ELGA)은 헬리코박터 저해활성물질의 탐색에 있어서 물질의 상대적인 농도에 따른 활성의 비례관계 뿐만 아니라 탐색대상인 물질들의 정량적 분석을 할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 식품산업상 및 의약산업상 매우 뛰어난 발명인 것이다.
Claims (6)
- (a) 쑥에 증류수를 넣고 마쇄 또는 뜨거운 증류수로 추출한 다음 원심분리하여 얻은 상등액에 1 ∼ 20% 세틸피리디니움 클로라이드(cetylpyridinium chloride) 용액을 혼합하면서 반응시키고 원심분리한 다음 침전물을 얻는 단계(b) 상기 (a)단계의 침전물에 10% NaCl 용액을 이용하여 남아있는 세틸피리디니움 클로라이드(cetylpyridinium chloride)를 투석 제거한 다음, 에탄올에 침지하고 원심분리한 후 침전시키는 단계(c) 상기 (b)단계의 침전물을 최소부피의 10 ∼50 mM Tris 완충용액 (pH 8.0)에 녹여 투석한 후 이온교환 크로마토그래피하여 염화나트륨 0 ∼ 1M의 농도기울기로 용출되는 것을 특징으로 하는 쑥 유래의 산성다당류 제조방법.
- 제 1항의 방법에 의해 제조된 0.3㎍/uL의 높은 황화 그룹(sulfate group)함량을 가짐을 특징으로 하는 산성 다당류.
- 제 1항의 방법에 의해 제조된 쑥의 조추출물 또는 산성다당류를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 위염, 위궤양 또는 위암치료용 조성물.
- 제 1항의 방법에 의해 제조된 쑥의 조추출물 또는 산성다당류를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 건강식품용 조성물.
- 헬리코박터 파이로리의 숙주세포 접합반응을 저해하는 물질탐색을 위하여 페투인(fetuin), 뮤신(mucin)과 같은 당단백질을 호스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase; HRP)에 결합시킴을 특징으로 하는 효소표식 당배합체법(enzyme-linkedglycosorbent assay; ELGA).
- 상기 제 5항에 있어서, 박테리아 균의 인체 숙주세포 접합반응을 정량적으로 측정할 수 있는 효소표식 당배합체법(enzyme-linked glycosorbent assay; ELGA).
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