KR101168381B1 - 녹차 가수분해물의 면역기능 증강 및 식품 조성물 제조 방법 - Google Patents

녹차 가수분해물의 면역기능 증강 및 식품 조성물 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 녹차의 효소 가수분해물 및 녹차로부터 분리한 다당류를 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물 및 그 제조 방법에 대한 것이다.

Description

녹차 가수분해물의 면역기능 증강 및 식품 조성물 제조 방법{IMMUNE ACTIVATION OF GREEN TEA HDROLYSATE AND THE PREPARATION OF FOOD WITH ACTIVE COMPONENTS}
본 발명은 녹차 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물 및 그 제조 방법에 대한 것이다.
녹차(green tea from leaves of Camellia sinensis L.)는 전 세계적으로 가장 널리 음용되고 있는 음료수 중 하나로, polyphenol류, 다당류, vitamin 등 다양한 영양 성분들을 함유하고 있을 뿐 아니라 여러 질병의 위험을 경감시키는 효과가 있다고 알려져 있다. 예컨대, 녹차 중에 존재하는 polyphenol은 녹차의 주요 활성성분으로 주목받고 있으며, 특히 이 중 epigallocatechin gallate(EGCG)는 항산화, 항동맥경화 활성 등 여러 생리활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이 때문에, 녹차에 대한 대부분의 연구는 녹차 제조에 적합한 어린 잎의 EGCG에 집중되어 있다.
그러나 EGCG가 녹차에서 관찰되는 약리활성을 책임지는 유일한 성분이라고는 할 수 없으며, 녹차의 성숙 잎에도 다당류와 같은 타 생물활성을 소유한 성분이 존재할 가능성은 여전히 남아 있다.
한편, 펙틴 물질(pectin material)은 주로 고등 식물의 1차 세포벽(primary cell wall)과 중엽(middle lamella)에 주로 존재하는 다당류로서 식이 섬유로서의 역할과 생리효과가 기대되는 소재로 기대되고 있다. 펙틴은 과거 D-galacturonic acid(GalA)가 α-1,4 결합으로 연결된 고분자 물질(α-D-1,4-polygalacturonic acid)로 알려져 있었다. 그러나, 최근 구조 분석 기술로 펙틴의 상세구조가 밝혀지면서 펙틴의 많은 부분은 호모갈락투로난(homogalacturonan, HG)으로 구성되어 있지만, 여기에 oligo당 및 polysaccharide가 분지로 결합된 람노갈락투로난(rhamnogalacturonan, RG)류가 공유적으로 결합되어 있는 형태로 존재하는 것이 보고되었다(도 1).
본 발명자들은 현재 음료용으로 사용되고 있는 녹차의 어린잎 및 성숙잎을 대상으로 특정 효소로 가수분해한 후 분획한 획분들이 면역 기능 증강 및 항암 효과를 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 면역기능 증강용 식품 조성물 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 발명은 음료용 녹차의 어린잎 및 음료용으로 사용되지 않는 녹차 성숙잎의 가수분해물 (이하 녹차 가수분해물이라 함)을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물 및 그 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 면역기능 증강 효과를 갖는다.
도 1은 펙틴의 구조 및 펙틴을 구성하는 호모갈락투로난(이하 HG), 람노갈락투로난 Ⅰ(이하 RG-Ⅰ) 및 람노갈락투로난 Ⅱ(이하 RG-Ⅱ)를 나타낸다.
도 2는 녹차로부터 유래한 생리활성 다당류의 정제, 분리 공정을 나타낸다.
도 3은 녹차의 PectinaseTM 가수분해물로부터 분리한 GTE-0-E9를 SephadexTM G-100을 이용하여 gel permeation chromatography(GPC)를 수행한 결과를 나타낸다: ◆, Neutral sugar (490 nm); ■, Uronic acid (520 nm); ▲, KDO (2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid) (548 nm).
도 4는 녹차로부터 분리한 다당류 분획의 GC chromatogram을 나타낸다.
도 5는 녹차 PectinaseTM 가수분해물의 조다당획분으로부터 분리한 GTE-Ⅰ(a) 및 GTE-Ⅱ(b)에 대하여 Asahi-Pak GS-520+GS-320+GS-220 칼럼을 이용하여 high-performance size-exclusion chromatography (HPSEC)를 수행한 용출 패턴을 나타낸다.
도 6은 녹차 가수분해물로부터 유래한 다당류의 항보체 활성을 나타낸다.
1) 항보체활성은 Mayer's 방법에 의한 ITCH50으로 나타내었으며, 2)PSK를 양성대조군으로 사용하였다.
도 7은 Ca 이온의 존재 하, GTE-Ⅰ 및 GTE-Ⅱ에 의하여 C3가 변환된 교차 전기영동 패턴을 나타낸다. 정상 인간 혈청을 시료와 함께 GVB++(A), MG++-EGTA-GVB--(B) 및 EDTA-GVB--(C)에서 37℃ 하, 30분 동안 배양하였다. 상기 혈청을 항-인간 C3 항체를 이용하여 면역 전기영동하여, C3 절단 산물로 이동시켰다.
도 8는 in vitro에서 쥐 복막 대식세포에 대한 녹차 유래의 GTW, GTE-Ⅰ 및 GTE-Ⅱ의 세포 독성 여부를 측정한 결과를 나타낸다.
도 9은 in vitro에서의 녹차 유래의 GTW, GTE-Ⅰ 및 GTE-Ⅱ의 림프구 증식활성을 나타낸다.
도 10는 in vitro에서 쥐 복막 대식세포에 의하여 생산되는 사이토카인에 대한, 녹차 유래의 GTW, GTE-Ⅰ 및 GTE-Ⅱ의 효과를 나타낸다.
도 11은 녹차 유래의 GTW, GTE-Ⅰ 및 GTE-Ⅱ의 ex vivo에서 NK 세포의 암세포에 대한 독성 효과를 나타낸다.
도 12는 B16BL6 종양세포를 정맥주사하여 유도한 폐 전이모델에서의 녹차 유래 GTW, GTE-Ⅰ 및 GTE-Ⅱ의 억제활성을 나타내는 사진이다.
도 13는 In vivo에서 녹차 유래 GTW, GTE-Ⅰ 및 GTE-Ⅱ의 항전이 활성에 대한 NK세포 기능제거의 영향을 나타낸다. 마우스에 B16BL6 종양세포를 접종하기 3일 전, NK 세포기능을 제거시키기 위하여 토끼 항-asialo GM1 혈청을 주사하였고, 2일 전에 시료(100 ㎍/mouse)를 투약한 후 종양을 접종하고 14일이 경과한 후에 평가를 위해 마우스를 희생시켰다.
도 14은 녹차 유래 다당류의 항전이 활성에 대한 NK세포 기능제거의 영향을 나타내는 사진이다.
도 15은 쥐 대식세포의 활성에 대한 녹차 유래의 GTW, GTE-Ⅰ 및 GTE-Ⅱ의 효과를 나타낸다.
도 16은 휴지기 대식세포(resident macrophages)(a) 및 녹차 유래의 다당류에 의하여 활성화된 대식세포(b)를 나타낸다.
도 17는 ex vivo에서 녹차 유래의 GTW, GTE-Ⅰ 및 GTE-Ⅱ의 쥐 대식세포의 암세포에 대한 독성 효과를 나타낸다.
본 발명은 녹차의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 RG-Ⅰ 또는 RG-Ⅱ를 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 녹차를 펙티네이즈를 함유한 효소로 가수분해하는 단계를 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 식물로부터 RG-Ⅰ 또는 RG-Ⅱ의 다당류를 분리하는 단계를 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 녹차의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 녹차의 RG-Ⅰ 또는 RG-Ⅱ의 다당류를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 녹차를 펙티네이즈를 함유한 효소로 가수분해하는 단계를 포함하는 암 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 식물로부터 RG-Ⅰ또는 RG-Ⅱ의 다당류를 분리하는 단계를 포함하는 암 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 녹차의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는, 면역기능 증강 및 항암용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 RG-Ⅰ또는 RG-Ⅱ의 다당류를 유효성분으로 포함하는, 면역기능 증강 및 항암용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 녹차를 펙티네이즈를 함유한 효소로 가수분해하는 단계를 포함하는, 면역기능 증강 및 항암용 약학적 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 식물로부터 RG-Ⅰ또는 RG-Ⅱ의 다당류를 분리하는 단계를 포함하는, 면역기능 증강 및 항암용 약학적 조성물의 제조 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명의 녹차는 Camellia sinensis L.이다. 바람직하게는 본 발명의 녹차는 녹차의 성숙 잎, 또는 어린 잎이며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 녹차는 녹차의 어린 잎이다.
본 발명의 효소는 녹차를 가수분해할 수 있는 가수분해 효소이다. 본 발명의 효소는 셀룰레이즈(cellulase), 펙티네이즈(pectinase), 헤미셀룰레이즈(hemicellulase), 아라비네이즈(arabinase), 베타-글루카네이즈(β-glucanase) 및 자일라네이즈(xylanase)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 효소는 펙티네이즈이다.
본 발명의 녹차 효소 가수분해물은 RG-Ⅰ또는 RG-Ⅱ의 다당류를 유효성분으로 포함한다.
상기 항암은 암 예방, 개선, 치료, 전이의 억제 등을 의미하며, 바람직하게는 전이의 억제를 의미한다.
본 발명의 암은 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 암은 폐암, 난소암, 췌장암, 결장암, 위암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 뇌종양, 간암, 유방암, 자궁암, 고안암, 신암, 담관암, 백혈병, 소화기암, 자궁목암, 비뇨기암, 식도암, 악성 임파종, 신경아종, 웃턱암, 구강암, 방광암, 조혈기 신경아세포종, 세포암, 융털 돌기암 등이 될 수 있으나 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 면역 기능이 저하된 환자, 암 환자 등에게 투여할 수 있으며, 면역 기능이 저하되어 질병에 걸릴 위험이 높은 대상에게도 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여 상기 녹차 효소 가수분해물, RG-Ⅰ또는 RG-Ⅱ의 다당류를 0.01 내지 80 중량부 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.02 내지 65 중량부 포함할 수 있다. 그러나 이는 투약자의 필요에 따라 증감할 수 있으며, 식생활, 영양 상태, 병의 진행 정도, 뇌 기능 장애 정도 등 상황에 따라 적절히 증감할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
본 발명의 녹차 효소 가수분해물을 포함하는 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1 kg 당 0.1 mg 내지 10 g, 바람직하게는 10 mg 내지 5 g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 RG-Ⅰ또는 RG-Ⅱ의 다당류를 포함하는 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1 kg 당 0.001 mg 내지 5.0 g, 바람직하게는 0.01 mg 내지 1.0 g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 식품은 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 녹차 효소 가수분해물, RG-Ⅰ또는 RG-Ⅱ의 다당류를 첨가하는 것도 포함된다.
본 발명의 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 녹차 효소 가수분해물, RG-Ⅰ또는 RG-Ⅱ의 다당류는, 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량부에 대하여 0.1 내지 70 중량부, 바람직하게는 2 내지 50 중량부 첨가될 수 있다. 상기 녹차 효소 가수분해물, RG-Ⅰ또는 RG-Ⅱ의 다당류의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
상기 녹차 효소 가수분해물, RG-Ⅰ또는 RG-Ⅱ의 다당류를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 기타 영양제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 방법>
재료
본 실험에 사용된 녹차은 경상남도 하동군에서 수확한 녹차의 성숙잎 또는 어린잎을 하동군청으로부터 제공받아 실험에 사용하였다. 녹차 분말의 가수분해를 위해 EconaseTM CE, RapidaseTM, ViscozymeTM, CelluclastTM 1.5L, PectinexTM, RohamentTM CL, UltrafloTM L, CytolaseTM PCL 5, PectinaseTM를 각각 구입하여 사용하였으며, 구입처 및 효소의 특성은 표 1과 같다.
Figure 112011030830718-pat00001
효소의 특성
시약 및 실험동물
조다당의 정제에 사용된 SephadexTM G-100은 GE Healthcare 사(Uppsala, Sweden) 로부터 구입하였으며, 투석에 사용된 dialysis tubing (MW cut-off 2,000)은 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 분자량 측정에 사용된 표준물질 Pullulan series(P-800, 400, 200, 100, 50, 20, 10 및 5)는 Showa Denko사(Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
Mitogen과 macrophage 활성 측정 실험에 사용된 RPMI 1640 medium, penicillin-streptomycin, fetal bovine serum 등은 Gibco BRL(Grand Island Co, NY, USA)사의 제품을 사용하였고, 세포 증식능 측정을 위해 Dojindo사(Kumamoto, Japan)의 CCK-8(Cell counting Kit-8)을 구입하여 사용하였다.
Cytokine의 측정을 위해서는 BD Biosciences(San Diego, CA, USA)사의 mouse IL-6, IL-12 ELISA kit를 사용하였다. NK cell의 YAC-1에 대한 세포독성측정을 위해 사용된 lactate dehydrogenase(LDH)는 Oxford Biomedical Research(Oxford, MI, USA)사의 cytotoxicity colorimetric assay kit를 사용하였다. NK cell의 기능을 block하기 위해 rabbit anti-asialo GM1(Wako, Osaka, Japan)을 사용하였다.
면역활성 대조군으로 사용한 LPS(lipopolysaccharide from Escherichia coli 0127:B8)는 Sigma사의 제품을 사용하였고, PSK(polysaccharide-K from Coriolus versicolor)는 광동제약(Korea)에서 시판하는 코포랑®으로부터 가용획분을 정제하여 사용하였다. 한편 항보체 활성에 사용된 양의 감작적혈구(IgM-hemolysis sensitized, EA cell)는 Biotest사(Biotest K.K. Tokyo, Japan)의 제품을, 교차 면역 전기영동에 사용된 anti-human C3는 Sigma사의 제품을 사용하였다. 그 외 본 연구에서 사용된 모든 시약은 시판 1급 이상의 분석용 제품이 사용하였다.
또한 본 연구에 사용된 실험동물인 6주령의 BALB/c, C57BL/6 mouse는 나라 바이오텍(Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하여 일주일간 적응을 거친 후 실험에 도입하였다. 사육 조건은 23±3℃, 습도 60±10%, 물과 사료의 급이는 자유 급이를 실시하였다.
통계처리
실험결과의 통계처리는 Statistical Package for the Social Sciences(SPSS) program(SPSS Inc., Chicago, IL USA)을 이용하여 분석하여 mean±SD로 표시하였으며, 각 군간 평균치의 통계적 유의성은 Student's two-tailed t-test에 의하여 α<0.05 수준에서 검증하였다.
<실시예 1> 녹차 열수추출물 및 효소 가수분해물의 조다당획분의 제조 및 이들의 면역활성
녹차 열수추출물의 조다당 획분 제조
녹차 분말20 g을 DIW 200 mL에 현탁하고 100℃에서 가열 처리하여 최초 부피의 절반이 될 때까지 열수 추출하였다. 추출액을 6,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 잔사를 제거하고 여기에 4배 부피(v/v)의 95% ethanol을 가하여 24시간 교반하면서 다당을 침전시켰다. 이때 발생한 침전물은 7,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 회수하고, 이를 소량의 증류수에 용해시킨 후, dialysis tubing(MW cut-off 2,000)을 이용하여 3～4일간 투석을 실시하였으며 이를 동결 건조(FreeZone 12Liter, Labconco, Kansas City, MO. USA)하여 조다당 획분, GTW를 획득하였다.
녹차 효소 가수분해물의 조다당 획분 제조
녹차 분말에 EconitaseTM CE, RapidaseTM, ViscozymeTM, CelluclastTM 1.5L, PectinexTM, RohamentTM CL, UltrafloLTM, CytolaseTM PCL 5와 PectinaseTM 를 각각 처리하여(녹차 분말의 0.5% 해당량 첨가), 얻은 효소 가수분해물을 6,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 잔사를 제거하고 여기에 4배 (v/v) 부피의 95% ethanol을 가하여 24시간 교반하면서 다당을 침전시켰다. 이때 발생한 침전물은 7,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 회수하고, 이를 소량의 증류수에 용해시킨 후, dialysis tubing (MW cut-off 2,000)을 이용하여 3～4일간 투석을 실시하였으며 이를 동결건조하여 처리 효소에 따른 조다당 획분들을 수득하였다(표 2).
Figure 112011030830718-pat00002
열수 추출 및 각 효소로 처리한 후 얻어진 조다당의 명명
<실험예 1> 녹차 열수추출물 및 효소 가수분해물 조다당 획분의 면역활성 평가
상기 GTW, GTE-0-E1, GTE-0-E2, GTE-0-E3, GTE-0-E4, GTE-0-E5, GTE-0-E6, GTE-0-E7, GTE-0-E8, GTE-0-E9의 조다당 획분을 대상으로 면역활성을 평가하였다.
<1-1> 녹차 열수추출물 및 효소 가수분해물 조다당 획분의 항보체 활성능
정상인 혈청( normal human serum , NHS )의 제조
건강한 성인의 혈액을 채취하여 실온에서 약 15분간 방치하여 응고시킨 후, 응고된 혈액을 절단하고 약 5분 간 상온에서 방치 시켰다. 이 혈액을 다시 4℃에서 약 20분간 방치한 다음 원심분리(3,000 rpm, 20 min, 4℃)하여 혈청을 분리한 뒤 미량 원심분리용 튜브에 1 mL씩 분주하여 -70℃에서 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다.
항보체 활성능 실험
항보체 활성은 Meyer 법을 이용하여 시료에 의한 보체 소비(Complement consumption)후 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈 정도에 근거를 둔 Complement fixation test 방법으로 측정하였다.
녹차 열수추출물 및 효소별 가수분해물의 조다당 획분 시료를 각각 1,000 μg/mL의 농도로, GVB++(Gelatin veronal buffer, pH 7.4, 0.1% gelatin, 0.15 mM Ca++, 0.5 mM Mg++ 함유) 및 정상인의 혈청과 함께 50 μL씩 혼합하여 37℃에서 30분간 1차 반응시켰다. 동 반응액에 GVB++ 350 μL를 가하고, 이를 10～160 배까지 연속 희석시킨 후, 750 μL의 GVB++와 양의 감작적혈구(IgM-sensitizated sheep erythrocyte, EA cell, 1×108 cells/mL)를 250 μL를 가하여 37℃에서 60분간 2차 반응시키고, PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.4) 2.5 mL를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액은 2,000 rpm에서 10분간 원심 분리하였으며, 얻어진 상등액을 412 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 용혈활성을 측정하였다. 항보체 활성은 정상인의 혈청과 GVB++, 증류수만을 반응시킨 음성대조군의 총보체용혈에 대한 저지율(Inhibition of 50% total complement hemolysis, ITCH50, %)로써 나타내었다. 양성 대조군으로는 운지버섯 유래 시판 면역증강제인 PSK(polysaccharide-K)를 사용하여 비교하였다.
음성 대조군에서의 활성화 정도를 ITCH50 0%로 하여 각 시료의 활성화능을 측정한 결과, GTE-0-E2, GTE-0-0-E5, GTE-0-8 및 GTE-0-E9의 활성이 제일 높았으며, 단순 열수추출 조다당인 GTW의 활성이 가장 낮은 것으로 나타났다(표 3).
Figure 112011030830718-pat00003
녹차 열수추출물 및 가수분해물 조다당 획분의 항보체 활성 (시료농도; 1,000 μg/mL)
<1-2> 조다당 획분의 대식세포의 IL-12 생산 유도 활성
Macrophage 배양액의 준비
BALB/c 마우스에 3% thioglycollate medium(TG)를 1 mL 복강주사하고 3일 후에 경추탈구법으로 마우스를 희생시킨 후, 복강에 RPMI-1640 배지 10 mL를 주입하여 복강 내 세포(peritoneal exudative cells; PEC)를 수집하였다. 수집한 PEC를 96 well culture plate에 2.0×106 cells/well의 농도로 조정하여 분주하고 2시간 동안 배양하여 macrophage를 plate에 부착시킨 후, 배양액으로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. Macrophage에 녹차 열수 추출물 및 효소별 가수분해물의 조다당 획분의 시료 용액의 최종농도가 200 ㎍/mL이 되도록 시료를 첨가하고, 72시간 동안 배양하였다. 배양종료 후, 1,500 rpm에서 5분간 원심 분리하여 세포배양 상등액 150 μL를 회수한 후 분비된 cytokine인 interleukin-12(IL-12)의 함량을 측정하였다.
Sandwich ELISA 에 의한 cytokine 측정
Macrophage에 의해 생산된 cytokine(IL-12)의 함량은 sandwich ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 분석하였다. Interleukin-12에 대한 특이적 단일크론 항체인 capture antibody를 제조사의 지침에 따라 coating buffer에 희석하여 flat-bottomed 96-well microplate에 100 μL씩 분주 후 4℃에서 12 시간 incubation 하였다. Coating이 완료된 ELISA plate는 washing buffer(PBS with 0.05% tween® 20, PBST)를 이용하여 3차례 세척하고, assay diluent(PBS with 10% or 2% skin milk) 200 μL를 가하여 1시간 동안 방치하여 항체가 붙지 않은 well 표면을 blocking하였다. Blocking 완료 후 각 well은 washing buffer를 이용하여 3회 세척하고, 각 well에 연속 희석한 표준물질인 recombinant mouse cytokine 혹은 macrophage 배양액을 각각 100 μL씩 분주하였다. 이를 실온에서 2시간 동안 반응시킨 다음 washing buffer로 세척하고, detection antibody-biotin 및 enzyme reagent(avidin-horseradish peroxidase conjugate)를 첨가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 완료 후, washing buffer를 이용하여 5회 세척하고, substrate solution(tetramethylbenzidine, TMB) 100 μL를 가하여 암소에서 30～60분간 반응시킨 후 50 μL의 stop solution(1 M H3PO4 or 2 N H2SO4)을 처리하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, in vitro에서 GTE-0-E2, GTE-0-E5, GTE-0-E8 및 GTE-0-E9의 IL-12 생산 유도능이 높은 것으로 확인 되었는데(표 4), 실험예 <1-1>의 항보체 활성과 동일한 종류의 시료에서 높은 IL-12 생산능을 나타내었다. 상기 GTE-0-E2, GTE-0-E5, GTE-0-E8 및 GTE-0-E9의 조다당 획분은 펙티네이즈가 주된 활성인 효소로 처리하여 얻은 조다당 획분인 바, 이는 녹차 중에 존재하는 pectin이 각 효소에 존재하는 pectinase에 의해 절단되면서, 면역 활성의 유효성분이 수득되었기 때문인 것으로 보인다. 그러므로 Pectinase 함유 효소분해 획분 중 가장 높은 면역 활성능을 보인 GTE-0-E9 (PectinaseTM 가수분해 조다당)를 이용하여 이후의 시험을 수행하였고 또한 이후, GTE-0-E9 획분은 모두 GTE-0로 약칭하였다.
Figure 112011030830718-pat00004
녹차 열수추출물 및 가수분해물 조다당 획분의 대식세포의 IL-12 생산 유도 (시료농도; 200 μg/mL)
<실험예 2> 녹차로부터 다당의 분리 및 정제
<2-1> 다당의 분리 및 정제
상기 실험예 1에서 가장 효과가 좋았던, 녹차를 PectinaseTM 처리하여 얻어진 조다당 GTE-0를 소량의 증류수에 녹여 50 mM acetate buffer(pH 5.2)로 평형화된 SephadexTM G-100 column(4×120 cm)에 전개하여 GPC(Gel permeation chromatography)를 시행하였다. 용출액은 6 mL씩 100개의 획분으로 분획하였으며, 각 분획은 중성당, 산성당, 단백질 및 KDO 함량을 분석하여 용출곡선을 작성하였으며 분자량 및 구성성분이 상이한 2개의 획분, GTE-I과 GTE-II로 분리하였다. 각 획분은 농축, 투석 및 동결 건조를 시행하여 분석용 정제시료로 조제하였다(도 2 및 도 3).
<2-2> 획분의 구성분 분석
다당 시료의 중성당의 함량은 galactose를 표준물질로 하여 phenol-sulfuric acid 법으로 측정하였으며, 산성당의 함량은 galacturonic acid를 표준물질로 하여 m-hydroxybiphenyl 법으로 측정하였다. 또한, TBA-positive material 의 함량은 KDO를 표준물질로 하여 thiobarbituric acid 법으로 측정하고, 단백질의 함량은 bovine albumin을 표준물질로 하여 Bradford 법으로 각각 정량 분석하였다.
상기 획분들의 구성분 분석결과, 단순 열수추출 조다당인 GTW는 중성당 54.3%, 산성당 45.7%로 구성되어 있고, PectinaseTM를 처리하여 얻어진 GTE-0는 중성당 54.9%, 산성당 45.1%로 구성되어 있었으며, GTE-0로부터 분리한 고분자 획분인 GTE-Ⅰ은 중성당 56.2%, 산성당 43.8%로 각 획분은 유사한 화학적 조성을 보였다. 그러나 GTE-0 유래 저분자 획분인 GTE-Ⅱ는 중성당이 54.2%, 산성당 43.6% 외에 특이 단당류로 분류되는 KDO 2.2%를 함유하고 있다(표 5).
Figure 112011030830718-pat00005
녹차 열수 추출물, PectinaseTM 가수분해물 및 이로부터 분리한 GTE-Ⅰ 및 GTE-Ⅱ의 구성분 및 구성당
구성당을 측정한 결과에서는 녹차 조다당의 주 구성당은 rhamnose(Rha), arabinose(Ara), galactose(Gal), glucose(Glc)로 되어 있었고 이것은 단순 열수추출 조다당 GTW와 PectinaseTM을 처리하여 얻은 조다당 GTE-0 모두에서 크게 변화가 없었다. 그러나 GTE-0를 분획한 GTE-Ⅰ과 GTE-Ⅱ에서는 구성당의 조성에서 명백히 차이가 나는 특징을 보여주는데, GTE-Ⅱ의 경우에는, 2-methylfucose(2-Me-Fuc), 2-methylxylose(2-Me-Xyl), apiose(Api), aceric acid(AceA)와 같은 특이 당을 포함하고 있었고 미량의 KDO 및 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid)도 검출되었다. 반면, 고분자 획분인 GTE-Ⅰ에서는 이들이 발견되지 않았다(도 4, 표 5). GTE-Ⅱ에서 검출된 2-Me-Fuc, 2-Me-Xyl, AceA, DHA 및 KDO등은 pectin을 구성하는 RG-Ⅱ의 지표물질로 알려져 있으므로 녹차 유래의 GTE-Ι은 RG-Ι(rhamnogalacturonan Ι), GTE-Ⅱ는 RG-Ⅱ (rhamnogalacturonan Ⅱ)의 다당류로 추정된다.
<2-2> 정제 다당의 분자량 측정
정제 획분인 녹차 유래 다당류 GTE-I 및 다당류 GTE-II의 정제도 및 분자량 측정을 위하여 각 시료를 10 mg/mL의 농도로 증류수에 녹여 Asahi-Pak GS-520+GS-320+GS-220 packed column을 이용하여 표 6의 분석조건으로 HPLC를 행하였다.
분자량 측정은 표준물질 Pullulan series(P-5, 10, 20, 50, 100, 200, 400, 및 800)를 이용하여 retention time을 구한 후, 각 분자량에 대한 Kav값을 산출하여 작성한 표준곡선으로부터 환산하여 결정하였다.
Figure 112011030830718-pat00006
다당류의 분자량 및 정제도 확인을 위한 HPLC 분석 조건
그 결과, GTE-Ⅰ은 약 44 KDa, GTE-Ⅱ는 약 16 KDa의 다당으로 확인되었다. Peak의 형태로 확인해 볼 때 GTE-Ⅱ는 좌우 대칭으로 그 정제도가 양호함을 확인할 수 있었지만, GTE-Ⅰ에서는 하나의 peak로 나타나지 못하고 대칭의 형태도 관찰되지 않았다(도 5). 이는 PectinaseTM가 HG를 분해할 때 많은 가지를 가지는 side chain이 PectinaseTM 의 작용을 간섭하게 되면서 HG가 깔끔하게 분해되지 못했기 때문인 것으로 보인다.
<실험예 3> 녹차 유래 다당의 면역 활성능 측정
<3-1> 녹차 유래 다당의 항보체 활성
정상인 혈청( normal human serum , NHS )의 제조
건강한 성인의 혈액을 채취하여 실온에서 약 15분간 방치하여 응고시킨 후, 응고된 혈액을 절단하고 약 5분 간 상온에서 방치 시켰다. 이 혈액을 다시 4℃에서 약 20분간 방치한 다음 원심분리(3,000 rpm, 20 min, 4℃)하여 혈청을 분리한 뒤 미량 원심분리용 튜브에 1 mL씩 분주하여 -70℃에서 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다.
항보체 활성능 실험
항보체 활성은 Meyer 법을 이용하여 시료에 의한 보체 소비(Complement consumption)후 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈 정도에 근거를 둔 Complement fixation test 방법으로 측정하였다.
여러 농도로 증류수에 용해시킨 시료를 GVB++(Gelatin veronal buffer, pH 7.4, 0.1% gelatin, 0.15 mM Ca++, 0.5 mM Mg++ 함유) 및 정상인의 혈청과 함께 50 μL씩 혼합하여 37℃에서 30분간 1차 반응시켰다. 동 반응액에 GVB++ 350 μL를 가하고, 이를 10～160 배까지 연속 희석시킨 후, 750 μL의 GVB++와 양의 감작적혈구(IgM-sensitizated sheep erythrocyte, EA cell, 1×108 cells/mL)를 250 μL 가하여 37℃에서 60분간 2차 반응시키고, PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.4) 2.5 mL를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액은 2,000 rpm에서 10분간 원심 분리하였으며, 얻어진 상등액을 412 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 용혈활성을 측정하였다. 항보체 활성은 정상인의 혈청과 GVB++, 증류수만을 반응시킨 음성대조군의 총보체용혈에 대한 저지율(Inhibition of 50% total complement hemolysis, ITCH50, %)로써 나타내었다. 양성 대조군으로는 운지버섯 유래 면역증강제인 PSK(polysaccharide-K)를 사용하여 비교하였다.
음성 대조군에서의 활성화 정도를 ITCH50 0%로 하여 각 시료의 활성을 측정한 결과, 단순 열수추출 조다당 GTW에서보다 pectinaseTM 처리하여 얻은 조다당 GTE-0에서 높은 항보체 활성을 보았으며 양성 대조군인 시판 면역 활성다당인 PSK와 유사 정도의 활성을 농도의존적으로 나타냈다. 또한, GTE-0로부터 분자량에 따라 분리, 정제한 GTE-Ⅰ과 GTE-Ⅱ에서는 GTE-Ⅰ이 GTE-Ⅱ보다 더 우수한 활성 경향을 보였으며 1,000 μg/mL 농도에서 양성대조군보다 우수한 87% 정도의 높은 활성을 나타냈다(도 6). 일반적으로 1,000 μg/mL의 농도에서 60% 이상의 항보체 활성을 나타내는 다당체는 그 약리활성이 통상적으로 인정되기 때문에, GTE-0와 GTE-Ⅰ 획분의 보체계 활성화 정도는 매우 우수한 것으로 판단되었다.
2차원 면역전기영동에 의한 보체계 활성 경로의 검토
보체계의 활성 경로를 확인하기 위해 2차원 면역전기영동은 Morrison 등의 방법에 따라 실시하였다. GVB++ buffer 와 Ca++ 이온이 선택적으로 제거된 Mg++-EGTA-GVB-- buffer, Ca++ 과 Mg++ 이온이 모두 제거된 EDTA-GVB-- buffer를 제조하여 시료 및 NHS와 각각 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 냉각하였다. 반응액을 barbital buffer(pH 8.6)에 용해시켜 만든 1% agarose gel plate(5×5 ㎝)의 well에 5 μL씩 loading 하고, 4℃에서 약 3시간 동안 1차 전기영동(75 mA/plate)을 실시하였다. 이 후 1% anti-human C3이 함유된 agarose gel plate 상에서 4℃, 약 15시간 동안 2차 전기영동(25 mA/plate)을 실시하였다. 전개된 gel은 bromophenol blue로 약 10분간 염색 후 탈색하여 침강선(precipitation line)을 확인함으로써 C3의 활성화 여부를 관찰하였다.
그 결과, GTE-Ⅰ과 GTE-Ⅱ를 2가 금속이온을 모두 제거한 EDTA-GVB-- 반응계에서 정상인의 혈청과 반응시킨 경우는 C3의 활성화가 이루어지지 않았기 때문에 침강선이 1개만이 관찰되는 반면, Ca++와 Mg++가 모두 존재하는 GVB++ 반응계와 Mg++ 이온만이 선택적으로 첨가된 Mg++-EDTA-GVB-- 에서는 각각 2개씩의 침강선을 확인할 수 있었다. 특히 GTE-Ⅰ의 Mg++-EDTA-GVB-- 반응계에서는 well로 부터의 두 번째 peak가 GVB++ 반응계에서 보다 작게 나타났는데 이는 well로부터 첫 번째 peak는 C3에, 두 번째 peak는 C3a 및 C3b에 기인한 침강선임을 고려할 때 alternative pathway활성화가 상대적으로 낮음을 알 수 있었고, GTE-Ⅱ에서는 비슷한 정도의 활성화를 가지는 것을 확인 할 수가 있었다(도 7). 이상의 결과로부터 녹차를 pectinaseTM로 처리하여 얻은 조다당 GTE-0로부터 분획한 GTE-Ⅰ과 GTE-Ⅱ는 classical pathway와 alternative pathway를 모두 경유하여 보체계를 활성화시킬 수 있음을 알 수 있었다.
<3-2> 녹차 유래 다당의 대식세포에 대한 독성
일반세포에 대한 시료의 세포독성 여부를 확인하고자 PBS를 이용, 2 mg/mL 농도로 조제한 다당 시료 용액에 RPMI 1640 medium을 가지고 1 mg/mL에서 0.06 μg/mL의 농도가 되도록 4배수로 연속 희석하고 flat-bottomed 96-well microplate(NuncTM, Roskilde, Denmark)에 100 μL씩 분주하였다. 여기에 6주령 female BALB/C mouse에 3% TG(Thioglycollate medium) 1 mL을 주입하여 72시간 동안 유도된 macrophage(2×105 cells/mL of RPMI 1640 medium)를 100 μL씩 가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 배양하였다. 각 시료 농도에 따른 세포 독성의 효과는 CCK-8를 5배 희석하여 well당 50 μL씩 가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 30～60분간 반응시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 모든 녹차 다당 시료군에서 농도와 무관하게 세포에 대한 세포독성은 관찰되지 않았다. 그러나 GTE-Ⅰ처리군의 경우 62～250 μg/mL의 농도에서 macrophage의 증식 경향을 보였다(도 8). 이러한 사실은 단순 열수추출 방법보다 pectinaseTM를 처리하여 얻어진 다당 분획의 경우 독성의 저감화뿐만 아니라 세포증식, 즉 mitogen 효능을 발현하게 함을 알 수 있었다.
<3-3> 녹차유래 다당의 림프구 증식 활성 측정
6 주령 female BALB/c mouse를 경추탈구법으로 치사시킨 후 무균적으로 비장(spleen)을 적출하여 stainless steel mesh를 이용, PBS 상에서 마쇄(100 mesh) 및 여과(200 mesh)하여 림프구 세포를 획득하였다. 0.2% NaCl 5 mL을 15～30 초 동안 가하고 진탕하여 혼합된 적혈구를 파괴하고 RPMI 1640 medium으로 2～3 회 세척 후 hemacytometer를 이용하여 세포수를 5×106 cells/mL이 되도록 조정하였다. 림프구 세포의 수는 0.2% trypan blue(Gibco BRL Co, Ltd.)로 염색하여 살아있는 세포만을 계수하였다. 분리된 비장 림프구 세포 180 μL와 PBS에 용해한 시료 20 μL를 flat-bottomed 96-well microplate에 분주하여 전체 부피가 200 μL가 되도록 한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 이때, B-림프구와 T-림프구 증식의 양성대조를 위하여 LPS와 concanavalin A이 각각 최종농도 10 μg/mL로 사용하였다. 각 물질의 림프구 자극활성의 측정은 water soluble tetrazolium salt(WST)를 이용하는 CCK-8 kit를 이용하여 제조사의 지침에 따라 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
녹차 유래 다당 획분의 면역자극 활성을 비장세포 증식효과로 조사한 결과, 모든 시료 처리군에서 시료처리를 하지 않은 비장세포의 시험군에 비해 우수한 증식(proliferation) 활성을 가지는 것을 확인할 수가 있었고, GTE-Ⅰ의 경우, 타 다당 획분에 비해 월등한 활성을 보였다. 특히 GTE-Ⅰ 200 μg/mL의 농도에서 가장 높은 증식 활성을 나타내었다(도 9). 이러한 사실은 녹차로부터 열수추출에 의한 다당 시료 조제방법보다 pectinaseTM 처리에 의한 조제가 시료의 면역활성을 배가 시키는 방법임을 확연하게 하는 결과였으므로, 각 획분에 의한 면역세포 활성화에 대한 보다 상세한 실험을 실시하였다.
<3-4> 녹차 유래 다당의 대식세포(Macrophage)의 cytokine 생산 유도 활성 측정
Macrophage 배양액의 준비
BALB/c 마우스에 3% TG를 1 mL 복강주사하고 3일 후에 경추탈구법으로 마우스를 희생시킨 후, 복강에 RPMI-1640 배지 10 mL를 주입하여 복강 내 세포(PEC)를 수집하였다. 수집한 PEC를 96 well culture plate에 2.0×106 cells/well의 농도로 조정하여 분주하고 2시간 동안 배양하여 macrophage를 plate에 부착시킨 후, 배양액으로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. Macrophage에 다당 시료 용액의 최종농도가 0.06～1 mg/mL이 되도록 시료를 첨가하고, 72시간 동안 배양하였다. 배양종료 후, 1,500 rpm에서 5분간 원심 분리하여 세포 배양액 상등액을 150 μL를 회수한 후, 배양 상등액에 유도 분비된 cytokine들인 IL-12 및 IL-6의 함량을 측정하였다.
Sandwich ELISA 에 의한 cytokine 측정
Macrophage에 의해 생산된 cytokine의 함량은 sandwich ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 분석하였다. 각 cytokine에 대한 특이적 단일크론 항체인 capture antibody를 제조사의 지침에 따라 coating buffer에 희석하여 flat-bottomed 96-well microplate에 100 μL씩 분주 후 37℃에서 12시간 incubation하였다. Coating이 완료된 ELISA plate는 washing buffer(PBS with 0.05% tween® 20, PBST)를 이용하여 3차례 세척하고, assay diluent(PBS with 10% or 2% skin milk) 200 μL를 가하여 1시간 동안 방치하여 항체가 붙지 않은 well 표면을 blocking하였다. Blocking 완료 후 각 well은 washing buffer를 이용하여 3회 세척하고, 각 well에 연속 희석한 표준물질인 recombinant mouse cytokine 혹은 macrophage 배양액을 각각 100 μL씩 분주하였다. 이를 실온에서 2시간 동안 반응시킨 다음 washing buffer로 세척하고, detection antibody-biotin 및 enzyme reagent(avidin-horseradish peroxidase conjugate)를 첨가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 완료 후, washing buffer를 이용하여 5회 세척하고, substrate solution(tetramethylbenzidine, TMB) 100 μL를 가하여 암소에서 30～60분간 반응시킨 후 50 μL의 stop solution(1 M H3PO4 or 2 N H2SO4)을 처리하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, IL-6에서는 저농도에서 고농도로 증가할수록 cytokine의 생산이 증가하였고, 모든 시료군이 40 μg/mL의 농도에서 양성대조인 LPS 만큼 생성이 되었다. 특히, 같은 농도에서 비교를 할 때 GTW보다 GTE-Ⅰ, GTE-Ⅱ가 더 높은 cytokine의 증가를 확인할 수 있었다(도 10 (b)). IL-12의 결과에서도 IL-6와 같은 경향을 보이는데, 저농도에서 고농도로 증가할수록 cytokine의 생산이 증가하였다. 특히, 같은 농도에서 비교를 할 때 GTW보다 GTE-Ⅰ, GTE-Ⅱ의 경우가 더 높은 cytokine의 증가를 확인할 수 있었다(도 10 (a)). 이 두 가지의 cytokine 유도능 결과는 단순 열수추출 조다당 GTW 보다 효소 가수분해물 다당인 GTE-Ⅱ, GTE-Ⅰ순으로 사이토카인 생산능이 증가하는 경향을 특징으로 하는데 따라서, 효소처리는 녹차의 전체 다당으로부터 면역세포를 활성화하는 주 활성성분을 분리하기 위한 중요한 수단으로 활용될 수 있음을 확인하게 하였다. 또 녹차 성숙잎 유래 다당이 대식세포를 자극함으로써 면역 반응이 일어나는 초기에 생체 방어에 유리한 작용을 할 수 있을 것으로 보인다.
녹차유래 다당의 자연 살해 세포에 의한 암세포 살해 활성능( NK cell activity )
NK cell의 감염세포 및 암세포에 대한 세포살해력은 interleukin과 같은 cytokine의 분비에 의하여 증가되고 다른 작동세포 즉, Tc lymphocyte(Cytotoxic T cell; CTL), macrophage의 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 따라서 NK cell의 활성자극 효과는 단순 항암효과의 기대 이외에도 체내 면역력의 증가와 유사한 연장선상에 있다고 할 수 있다.
녹차로부터 정제한 다당 시료를 6주령 female BALB/c mouse에 각각 1 μg/mouse, 100 μg/mouse, 1,000 μg/mouse씩 혈관 주사하고 3일 후에 경추탈구법으로 희생하여 무균적으로 비장(spleen)을 적출하였다. Stainless steel mesh를 이용, PBS 상에서 마쇄(100 mesh) 및 여과(200 mesh)하여 림프구 세포를 획득하였다. 0.2% NaCl 5 mL을 15～30초 동안 가하고 진탕하여 혼합된 적혈구를 파괴하고 무혈청배지로 3회 세척 후 hemacytometer를 이용하여 세포수를 1×106 cells/mL이 되도록 조정하고 이를 effector cell로 사용하였다. 마우스 NK cell에 대한 감수성이 높은 YAC-1 lymphoma 세포를 target cell로 하여 round-bottomed 96-well microplate(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA)에 effector cell과 target cell의 비율(E/T ratio)이 25, 50, 100이 되도록 조정하여 가하였다. 37℃, 5% CO2 배양기에서 18～24시간 동안 배양 후 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 배양액 상등액을 100 μL를 회수하였다. NK cell의 세포독성 효과는 effector cell인 NK cell에 의하여 살해됨으로서 target cell로부터 배양상등액으로 유리된 LDH를 LDH assay kit를 사용하여 측정하였다. NK cell의 종양세포 살해능은 다음 식에 의해 계산하였다(식 1).
<식 1>
Figure 112011030830718-pat00007
E - experimental release from effect cell,
S - average spontaneous release from target cell,
M - maximum release from target cell,
TSR - spontaneous release from target cell
시료의 투여에 의한 NK cell 자극 활성의 결과, 정상적인 mouse의 NK cytotoxicity보다 GTE-Ⅰ와 GTE-Ⅱ의 투여군에서 저농도에서 고농도로 농도 의존적으로 종양세포에 대한 살해활성이 높아지는 것을 확인하였다. GTE-Ⅰ에서는 100 μg/mouse의 농도에서 가장 활성이 높았고 GTE-Ⅱ에서는 1,000 μg/mouse의 농도에서 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 NK-cell의 활성화 측면에서 볼 때, GTE-Ⅰ의 경우가 GTE-Ⅱ 보다 더 높은 활성이 있음을 확인할 수 있었다(도 11 (a) 및 (b)).
<실험예 4> 녹차 유래 다당의 항암 활성
<4-1> 녹차유래 다당의 항전이 활성
시료의 항전이 활성은 폐(lung)에 대한 고전이성 종양세포주인 B16BL6을 이용한 실험동물 종양전이 모델을 이용하였다. 시료에 의한 종양전이 효과를 관찰하기 위해 B16BL6 melanoma를 4×104 cells/mouse의 수로 조정하여 6주령 female C57BL/6 mouse에 정맥 주사하였고, 시료는 종양 투여 2일전에 각 농도별로 정맥 주사하였다. 종양투여 14일 후 mouse를 경추탈구법으로 희생하고, 종양세포의 표적기관인 폐를 적출하여 Bouin's solution (Sigma)에서 전이된 종양을 고정, 염색한 후 전이된 검은색의 종양 colony를 계수하였다. 시료에 의한 항종양전이 효과는 종양만을 접종한 대조군과 비교 산출하였다.
실험 결과 tumor control군에서는 평균 70 여 개의 colony가 계수되었고, 이를 기준으로 GTE-Ⅰ과 GTE-Ⅱ에서의 억제율을 계산하였을 때 시료를 투여 하였던 모든 실험군에서 75%이상의 높은 억제율을 확인하였다. 또한, GTE-Ⅰ과 GTE-Ⅱ에서 저농도에서 고농도로 농도 의존적으로 억제율이 높아지는 것을 확인 할수 있었다. GTE-Ⅰ에서는 100 μg/mouse의 농도에서 93 %, GTE-Ⅱ에서는 1,000 μg/mouse의 농도에서 94.3 %로 가장 높은 억제 활성을 보임으로서 앞서 실험한 NK cell의 종양세포 살해능과 동일한 경향을 보였다(표 7, 도 12). 실험전이 모델에서의 BRM 물질의 투여에 의한 항종양 활성은 주로 대식세포나 NK cell의 활성화가 주로 작용한다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서 이하, <4-2>에서 본 시료에 의한 항종양 활성의 작동기구가 NK cell의 활성화에 의한 것인지를 확인하기 위하여 인위적으로 NK cell의 기능이 제거된 마우스에서의 항종양 활성 조사를 실시하였다.
Figure 112011030830718-pat00008
B16BL6 종양세포의 정맥주사로 유도된 폐 전이모델에서의 녹차 잎 유래 GTE-Ⅰ및 GTE-Ⅱ의 항전이 활성
<4-2> NK cell 기능이 제어된 mouse에서의 녹차잎 유래 다당의 항전이 활성
NK cell 기능이 제거된 mouse에 대한 시료의 항전이 활성을 측정하기 위하여 시료의 접종 1일전에 anti-asialo GM1을 50 μL씩 mouse에 복강주사하여 mouse의 NK cell 기능을 제거 시켰다. B16BL6 lung carcinoma를 4×104 cells/mouse의 수로 조정하여 6주령 female C57BL/6 mouse에 정맥 주사하였고, 시료는 종양 투여 2일전에 각 농도별로 정맥 주사하였다. 종양 투여 14일 후 종양세포의 표적기관인 폐를 적출하여 시료에 의한 항전이 효과를 측정하였다.
그 결과, mouse에 아무것도 투여하지 않고 종양세포만 투여한 tumor control군에서 전이된 colony 수가 100개인 반면, rabbit anti-asialo-GM1 항체를 이용하여 NK cell을 block한 실험군에서는 310개로 증가하는 것이 확인되었다. 이것은 정상적인 mouse에서 NK cell이 항전이 효과에 중요한 역할을 담당하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 GTW, GTE-0, GTE-Ⅰ 및 GTE-Ⅱ를 100 μg/mouse 농도로 투여했던 실험군의 결과에서는 각각 35, 13, 7, 10개로 65% 이상의 높은 억제 효과를 확인하였다. 그러나, NK cell의 기능이 제거된 mouse에서 GTE-Ⅱ는 100 μg/mouse의 투여에서 21%의 낮은 억제효과를 나타내었으며, GTW, GTE-0, GTE-Ⅰ에서는 억제 효과가 없음을 확인하였다(도 13 및 도 14). 이러한 결과로 GTW, GTE-0, GTE-Ⅰ의 항전이 활성은 전적으로 NK cell에 의존하는 것으로 나타났으며 GTE-Ⅱ는 NK cell뿐만 아니라 아직 확인되지 않은 다른 면역계 자극활성 효과가 함께 관여하고 있음을 시사하고 있다.
<4-3> 암세포에 대한 macrophage의 활성 및 세포독성
녹차유래 다당에 의한 macrophage 의 활성평가
6주령 female Balb/c mouse에 3% TG 1 mL을 주입하여 72시간 동안 유도된 macrophage(4×105 cells/mL of RPMI 1640 medium)를 slide glass 위에 seeding하고 30분 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 비부착된 세포는 PBS로 세척하여 제거한 후, 100 μg/mL의 농도로 GTW, GTE-0, GTE-Ⅰ, GTE-Ⅱ 시료를 조제하여 가하여 48시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한다. Slide glass는 PBS로 세척 후 Bouin's solution(Sigma)으로 5분 동안 고정시켜준 후, Giemsa 염색으로 2시간 동안 염색하였으며, acetone으로 탈수한 후, Entelan으로 봉입하였다. 현미경으로 400배 시야 4 곳에서 활성화된 macrophage를 계수하여 평균과 표준편차를 구하였다.
그 결과, 무처리 대조군 대비 GTW, GTE-0, GTE-Ⅰ 100 μg/mL의 농도에서 20 개 내외로 크게 활성화 시키지는 못했던 반면, GTE-Ⅱ 100 μg/mL의 농도에서는 약 54 개 정도로 macrophage 활성화 경향이 매우 우수함을 알 수 있었다(도 15 및 도 16).
활성화된 macrophage 에 의한 tumor cell 에 대한 세포 독성
녹차 유래의 다당에 의해 활성화된 macrophage를 얻기 위해 3% TG 1 mL을 복강내 주입하여 24 시간 후, 각 농도별로 시료를 200 μL씩 투여하여 48시간 동안 활성화된 effect cell인 macrophage를 얻었다. Effertor cell에 의한 세포독성 효과를 측정하기 위한 암세포(target cell)은 B16BL6 melanoma를 사용하였다. 즉, flat-bottomed 96-well microplate에 effector cell과 target cell의 비율(E/T ratio)이 10, 20이 되도록 조정하여 분주 후. 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 18～24 시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후, culture plate를 1,500 rpm에서 5 분간 원심분리하여 세포 배양액 상등액을 100 μL를 회수하였다. 이 상등액에 effect cell의 상해능에 의해 target cell로부터 유리되는 LDH를 LDH assay kit를을 사용하여 측정하였다. Macrophage의 종양세포 살해능은 다음 식에 의해 계산하였다(식 2).
<식 2>
Figure 112011030830718-pat00009

E - experimental release from effect cell,
S - average spontaneous release from target cell,
M - maximum release from target cell,
TSR - spontaneous release from target cell
시료를 처리하지 않은 정상군 마우스의 macrophage 및 100 μg/mouse 의 GTW, GTE-0, GTE-Ⅰ를 투여한 마우스의 macrophage는 유의한 암세포 살해활성이 유도되지 않았다. 그러나 동일 농도 100 μg/mouse의 GTE-Ⅱ를 투여한 마우스의 macrophage는 약 18% 정도의 살해 활성을 보였으며, 타 시료와 다르게 그 활성이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다(도 17). 이 결과와 실험예 <4-2>의 결과는 GTW, GTE-0, GTE-Ⅰ는 주로 세포살해능을 갖는 NK cell를 활성화시켜 항전이 활성의 주요 effector cell로 활성화된 NK cell이 관여함을 시사하였고, GTE-Ⅱ의 경우는 NK cell뿐만 아니라 macrophage도 활성화시켜 항전이 활성에 이들 2종류의 면역세포가 함께 작용하여 높은 활성을 나타내는 것으로 평가된다.

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  7. 녹차를 펙티네이즈(pectinase)로 가수분해하는 단계;및
    상기 녹차 가수분해물의 잔사를 제거한 후 에탄올을 이용하여 다당을 침전시키고, 조다당을 수득하는 단계를 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물의 제조 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 조다당은 람노갈락투로난 Ⅰ 또는 람노갈락투로난 Ⅱ를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 조다당은 람노갈락투로난 Ⅰ 및 람노갈락투로난 Ⅱ를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  10. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 방법으로 제조한 면역기능 증강용 식품 조성물.
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