KR20160088701A

KR20160088701A - 인삼박 유래 갈락토유로노글루코올리고당 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160088701A
Application number: KR1020150008116A
Authority: KR
Inventors: 박용일; 이창원; 서정연; 이지선; 최두진
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2016-07-26

Abstract

본 발명은 인삼박(ginseng cake) 유래 갈락토유로노글루코올리고당(Galacturonoglucooligosaccharide; GuG-OS) 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 인삼박(ginseng cake) 유래 갈락토유로노글루코올리고당은 인삼박으로부터 분리한 갈락토유로노글루칸 타입의 다당체(Galacturonoglucopolysaccharide; GuG-PS)를 효소분해하여 제조한 것이며, 상기 방법으로 제조된 저분자 갈락토유로노글루코올리고당은 대식 세포의 증식률을 높이고 TNF-α 와 IL-6의 생성률을 높이며, 암 세포에 대한 현저한 세포사멸 효과가 있는 동시에 정상세포에는 독성이 없으므로, 면역증강 또는 항암용 의약품 및 건강기능식품에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

인삼박 유래 갈락토유로노글루코올리고당 및 이의 용도{Galactouronoglucooligosaccharide Derived from Ginseng cake and Use Thereof}

본 발명은 인삼박(ginseng cake) 유래 갈락토유로노글루코올리고당(Galacturonoglucooligosaccharide; GuG-OS) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인삼박으로부터 분리한 갈락토유로노글루칸 타입의 다당체(Galacturonoglucopolysaccharide; GuG-PS)로부터 효소분해로 제조한 저분자 갈락토유로노글루코올리고당 및 이를 유효성분으로 포함하는 면역증강 또는 항암용 조성물에 관한 것이다.

면역은 인간 및 동물의 체내에서 외래성 및 내인성 이물질을 생리적으로 인식하여 배제하고, 항상성을 유지하기 위한 기작을 일컫는다. 생체가 자기 성분 이외의 물질이 생체의 항상성을 깨뜨리거나 자기를 위협하는 것을 배제하기 위해 일어나는 일련의 생체방어반응을 의미하며, 대식세포(macrophage)가 관련된 비특이적 면역(선천면역)과 T림프구 및 B림프구가 관련된 특이적 면역(후천면역)으로 분류할 수 있다 (Seo SY et al ., Korean J Oriental Physiol Pathol , 23:1385-1391, 2009).

대식세포는 체내의 모든 조직에 분포하면서 1차적으로 박테리아나 바이러스 등의 감염성 병원체뿐만 아니라 노화된 정상세포와 암세포 등에 대해 탐식 작용을 일으켜 제거하는 방어능력을 갖으며, 항원제시작용 및 인터루킨(interleukin) 계열, TNF-α 등의 다양한 사이토카인(cytokine)과 생리활성물질을 분비하여 면역 반응을 극대화시키는 중요 매개체 역할을 한다. 대식세포가 활성화되면 NO, TNF-α 등의 사이토카인을 분비하는데 이들은 암세포에 대한 독성을 나타내는 대표적 물질들로 알려져 있다 (Hibbs JB Jr et al ., Biochem Biophys Res Commun , 157:87-94, 1998; Nathan CF, J Clin Invest , 79:319-326, 1987).

면역부전증(immunodeficiency disease)은 임상면역학상의 난치성 질환, 암, 당뇨병, 남성불임증에 이르기까지 깊이 관여되어 있으며, 또한 그 밖에도 후천성 면역결증(AIDS)를 비롯하여 각종 병원성 바이러스성 질환기회감염, 기생충감염 등도 모두 면역부전과 관련된 질환이라고 할 수 있다.

최근 들어, 암 환자의 경우 면역력이 자체적으로 떨어지기 때문에 합병증을 유발할 수 있고, 치료효과가 저하될 수 있어서 면역력 강화는 매우 중요하다. 이전에 발표된 논문에 의하면 대식세포 (Macrophages)는 생체방어에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Shin JY et al ., Immunopharmacology and Immunotoxicology, 24;469-482, 2002), 대식세포의 활성화는 종양 억제와 관련이 있는 것으로 보고되었다 (Coha ZA, J Immunol , 121;813-816, 1978).

암의 경우, 세계보건기구에 의하면 서구식 식습관의 확산과 현재의 흡연추세로 볼 때 2020년에는 암 진단자가 1천500만 명으로 50% 이상 증가할 것으로 예상하였다. 또한 우리나라 통계청의 2013년 사망원인 통계 자료에 의하면 폐암에 의한 사망자의 수는 2003년과 비교해 2013년에는 7.8% 증가한 것을 확인할 수 있다. 이러한 이유로 인해 면역력 강화와 암의 억제를 위한 다양한 면역증강제와 항암제 및 암 치료법이 지속적으로 개발되면서 암에 대한 치료나 수명 연장이 기대되고 있는 실정이다.

면역기능 증강제는 주로 선천성 및 후천성 면역결핍 증후군에 사용되는 약물로서, 특히 종양이나 후천성 면역 결핍증후군(AIDS)에 대한 약물요법의 일환으로 절실하게 요구되고 있다. 현재 사용되고 있는 대표적인 면역기능 증강제로는 면역글로불린, 인테페론 등이 있다. 이들 중에서, 인간의 면역글로불린의 하나의 IgG를 농축, 정제한 제제가 홍역, 수두, B형 간염, 유행성 이하선염 등의 예방치료에 사용되고 있으나, 주사 부위의 동통과 혈압강하로 인한 아나필락시스 양성반응으로 다량투여는 위험하다는 단점이 있다. 또한, 인터페론의 경우 항바이러스 인자로서 발견되었으나, 그 후에 세포증식 억제작용, 면역기능 조절작용 등이 확인되어, 항바이러스제 및 항종양제 등으로 사용되고 있으나, β형은 발열, 권태감, 식욕부진, 주사국소통, 탈모증 등의 부작용이 관찰되며, α형은 일시적인 골수기능 억제에 의한 백혈구 감소, GOT의 상승과 같은 부작용을 나타낸다.

항암제의 경우 약제 저항성과 정상세포와의 선택성에 대하여 아직도 많은 부분이 해결되지 않고 있으며, 특히 임상에 사용되고 있는 항암제들의 가장 큰 문제점은 암세포와 정상세포를 선택적으로 구분할 수 없는 것이 가장 큰 문제점이라 할 수 있다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 최근에는 세포의 암화, 약제 내성이나 전이 등 분자수준에서의 암의 특성에 대한 집중적인 연구가 진행되고 있는 실정이다.

특히, 최근에는 이러한 면역 작용을 천연물질로 증진시키려는 연구에 대한 관심이 부각되고 있으며, 특히 천연물질로부터 유래된 면역 증강제는 면역 반응을 강화시키거나 저하된 면역능을 원상회복시킬 수 있을 것으로 기대하고 있다 (Kim HS and Kang JS, J Korean Soc Food Sci Nutr , 37:109-116, 2008).

그 중, 인삼은 우리나라를 비롯하여 중국, 일본을 중심으로 오랫동안 매우 좋은 약재로서 인정되어 왔고 또한 그 약효를 높이 평가받아 많은 국가에서 약재로서 사용되어 왔다 (학창사, 현대생약학, 생약학 연구회, 251-297, 1997). 인삼의 주 효능을 나타내는 사포닌의 성분은 인삼의 뿌리, 줄기, 잎 등에 있으며, 총 30여 종류의 진세노사이드로 구성되어 있으며, 진세노사이드는 항암, 노화 방지, 성인병 예방, 간 보호, 항염, 신경 보호 등 다양한 건강 증진 효능이 있다고 알려져 있다.

그러나, 가용성 인삼 성분을 추출하고 남은 찌꺼기인 인삼박의 경우 대부분 다당류 (polysaccharide)로 구성되어 있어 각종 생리활성이 기대됨에도 불구하고, 단순히 사료 또는 폐기되는 등 산업적인 활용이 매우 미흡한 상태이다.

이에, 본 발명자들은 천연 유래의 물질을 활용하여 부작용을 동반하지 않고, 면역증강 및 항암 효과가 있는 물질을 선별하기 위해 예의 노력한 결과, 인삼박 추출물인 갈락토유로노글루칸 타입의 다당체(Galacturonoglucopolysaccharide, GuG-PS)에 효소를 처리하여 제조한 갈락토유로노글루코올리고당 (Galacturonoglucooligosaccharide, GuG-OS)이 대식 세포의 증식률을 높이고 TNF-α 와 IL-6의 생성률을 높이며, 폐암세포에 대한 세포생존율 억제 효과를 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 첫 번째 해결하려는 과제는 인삼박 유래 갈락토유로노글루코올리고당 (Galacturonoglucooligosaccharide, GuG-OS)의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 두 번째 해결하려는 과제는 상기 갈락토유로노글루코올리고당을 포함하는 면역기능 강화, 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

상술한 본 발명의 첫 번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, (a) 인삼박(ginseng cake)으로부터 수득한 갈락토유로노글루칸 다당체(Galacturonoglucopolysaccharide)를 효소분해 한 다음, 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (b) 수득된 상등액을 여과하여 분자량 1 내지 10 kDa의 다당체를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 다당체를 투석하여 갈락토유로노글루코올리고당(Galacturonoglucooligosaccharide)을 수득하는 단계;를 포함하는 갈락토유로노글루코올리고당 제조방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 갈락토유로노글루칸 다당체는 (ⅰ) 인삼박에 용매를 첨가하여 혼합한 다음, 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 수득된 상등액에 용매를 첨가하여 혼합한 다음, 원심분리하여 침전물(pellet)을 수득하는 단계; (ⅲ) 상기 수득된 침전물에 다시 용매를 처리하여 분쇄한 다음, 투석하여 분자량 4,000,000 Da 내지 7,000,000 Da의 다당체를 수득하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (ⅰ) 내지 (ⅲ) 단계의 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 효소분해는 (ⅰ) 갈락토유로노글루칸 다당체에 펙티나제(pectinase)를 첨가한 다음, 45 내지 55℃에서 30 내지 90분 동안 교반하는 단계; 및 (ⅱ) 90 내지 110℃에서 10 내지 20분 동안 가열하여 효소를 불활성화시키는 단계;를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (c) 단계에서 수득한 갈락토유로노글루코올리고당의 분자량은 1800 내지 2600 Da일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (c) 단계에서 수득한 갈락토유로노글루코올리고당은 글루쿠론산(glucuronic acid)에 비해 갈락투론산(galacturonic acid)의 함량이 2 내지 3배 높은 것일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 방법으로 제조된 갈락토유로노글루코올리고당을 포함한다.

본 발명의 두 번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 인삼박 유래 갈락토유로노글루코올리고당을 유효성분으로 함유하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함한다.

본 발명은 또한, 인삼박 유래 갈락토유로노글루코올리고당을 유효성분으로 함유하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 치료용 건강기능식품용 조성물을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 갈락토유로노글루코올리고당은 총 조성물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부로 포함될 수 있으며, 상기 갈락토유로노글루코올리고당 제조방법으로 제조된 갈락토유로노글루코올리고당일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 갈락토유로노글루코올리고당은 대식세포의 생존율을 향상시키거나, 종양괴사 인자-α (TNF-α; tumor necrosis factor-alpha) 및 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인(cytokine)의 발현을 증가시켜 면역기능을 강화시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 암은 폐암, 위암, 대장암, 유방암, 자궁경부암 및 간암으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 상기 갈락토유로노글루코올리고당은 암 세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도할 수 있다.

본 발명의 인삼박(ginseng cake) 유래 갈락토유로노글루코올리고당(Galacturonoglucooligosaccharide; GuG-OS)은 인삼박으로부터 분리한 갈락토유로노글루칸 타입의 다당체(Galacturonoglucopolysaccharide; GuG-PS)를 효소분해하여 제조한 것으로, 상기 갈락토유로노글루코올리고당은 대식 세포의 증식률을 높이고 TNF-α 및 IL-6의 생성률을 높이며, 암 세포에 대한 현저한 세포사멸 효과가 있는 동시에 정상세포에는 독성이 없으므로, 면역증강 또는 항암용 의약품 및 건강기능식품에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1a는 인삼박으로부터 분리한 갈락토유로노글루칸 타입의 다당체 (Galacturonoglucopolysaccharide; GuG-PS)의 제조과정을 나타낸 모식도이며, 도 1b는 갈락토유로노글루칸 타입의 다당체의 효소 분해를 통한 갈락토유로노글루코올리고당 (Galacturonoglucooligosaccharide; GuG-OS)의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 생성된 GuG-PS, 도 2b는 GuG-OS를 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)로 분석한 결과이다.
도 3은 생성된 GuG-PS, GuG-OS의 중성당을 HPEAC-PAD (High Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 4는 생성된 GuG-PS, GuG-OS의 유론산을 HPEAC-PAD (High Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection, Dionex, USA)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 5는 GuG-OS를 RAW 264.7 세포에 처리한 후, 세포 생존력의 변화를 분석한 결과이다.
도 6은 GuG-OS를 RAW 264.7 세포에 처리한 후, 사이토카인(cytokine) 중 하나인 TNF-α의 발현량 변화를 분석한 결과이다.
도 7은 GuG-OS를 RAW 264.7 세포에 처리한 후, cytokine 중 하나인 IL-6의 발현량 변화를 분석한 결과이다.
도 8은 GuG-PS 및 GuG-OS를 폐암 세포주인 A549 세포에 처리하였을 때 세포의 형태변화를 확인한 결과이다.
도 9는 GuG-PS 및 GuG-OS를 폐암세포주인 A549 세포에 처리한 후, 세포 생존력의 변화를 MTT assay를 통해 분석한 결과이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 면역 증가제로 사용되는 약물 및 항암제는 다양한 부작용이 발생하는 문제점이 있어 부작용을 최소화하기 위해 천연물질 유래의 면역증강 또는 항암 물질을 선별하기 위한 노력이 꾸준히 이루어지고 있다.

본 발명은 인삼박(ginseng cake) 유래 갈락토유로노글루코올리고당(Galacturonoglucooligosaccharide; GuG-OS) 제조방법 및 이의 용도를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해, 인삼박 추출물인 갈락토유로노글루칸 타입의 다당체(Galacturonoglucopolysaccharide, GuG-PS)에 효소를 처리하여 제조한 갈락토유로노글루코올리고당을 제공하며, 상기 대식 세포의 증식률을 높이고 TNF-α 와 IL-6의 생성률을 높이며, 암 세포에 대한 현저한 세포사멸 효과가 있으므로, 면역증강 또는 항암용 조성물을 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명은 (a) 인삼박(ginseng cake)으로부터 수득한 갈락토유로노글루칸 다당체(Galacturonoglucopolysaccharide)를 효소분해 한 다음, 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (b) 수득된 상등액을 여과하여 분자량 1 내지 10 kDa의 다당체를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 다당체를 투석하여 갈락토유로노글루코올리고당을 수득하는 단계;를 포함하는 갈락토유로노글루코올리고당(Galacturonoglucooligosaccharide) 제조방법을 포함한다.

본 발명의 갈락토유로노글루코올리고당(Galacturonoglucooligosaccharide; 이후 'GuG-OS'로 혼용하여 표기함) 제조방법을 구체적으로 설명하면,

먼저, (a) 단계는 인삼 박으로부터 수득한 갈락토유로노글루칸 다당체(Galacturonoglucopolysaccharide; 이후 'GuG-PS'로 혼용하여 표기함)를 효소분해 한 다음, 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계이다.

상기 '박(粕, cake)'은 지게미, 찌꺼기를 의미하는 것으로, '인삼박(人蔘粕)'은 가용성 인삼 성분을 추출하고 남은 찌꺼기를 의미하며, 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매로 추출하고 남은 찌꺼기일 수 있다.

도 1a는 인삼 박으로부터 분리한 갈락토유로노글루칸 타입의 다당체의 제조과정을 도식화한 것으로, 좀 더 구체적으로, 상기 (a) 단계의 갈락토유로노글루칸 다당체는 (ⅰ) 인삼박에 용매를 첨가하여 혼합한 다음, 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 수득된 상등액에 용매를 첨가하여 혼합한 다음, 원심분리하여 침전물(pellet)을 수득하는 단계; (ⅲ) 상기 수득된 침전물에 다시 용매를 처리하여 분쇄한 다음, 투석하여 분자량 4,000,000 Da 내지 7,000,000 Da의 다당체를 수득하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

상기 (ⅰ) 내지 (ⅲ) 단계의 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매일 수 있다. 바람직하게는 (ⅰ) 단계에서는 인삼박 분말 중량의 10배가 되도록 증류수를 첨가하였으며, (ⅱ) 단계에서는 수득된 상등액의 3배 볼륨의 에탄올(ethanol)을 첨가하여 에탄올 침전을 시켰으며, (ⅲ) 단계에서는 수득한 침전물에 증류수를 첨가하여 분쇄하였다.

또한, 상기 (ⅲ) 단계의 투석은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 원하는 크기의 물질은 수득하기 위해 투석막의 종류를 달리하여 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게 12 ~ 14 kDa 투석막(dialysis membrane)을 사용하여 분획을 수득하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 효소분해는 (ⅰ) 갈락토유로노글루칸 다당체에 펙티나제(pectinase)를 첨가한 다음, 45 내지 55℃에서 30 내지 90분 동안 교반하는 단계; 및 (ⅱ) 90 내지 110℃에서 10 내지 20분 동안 가열하여 효소를 불활성화시키는 단계;를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.

도 1b는 갈락토유로노글루칸 다당체의 효소 분해를 통한 갈락토유로노글루코올리고당의 제조과정을 도식화한 것으로, 본 발명에서는 갈락토유로노글루칸 다당체를 분리하기 위해 바람직하게 펙티나제를 사용하였다.

상기 '펙티나제(pectinase)'는 펙틴(pectin), 펙트산(pectic acid) 등의 α-1,4-갈락투론산(α-1,4-galacturonic acid) 결합을 가수분해하는 효소로 폴리갈락투로나아제(polygal- acturonase, EC 3.2.1.15.), 폴리메틸갈락투로나아제(polymethylgalactronase)라고도 부른다. 펙틴 가수분해 효소의 일종이지만 총칭하여 쓰는 수도 있다. 효소의 작용형식에서 α- 1,4결합의 안쪽에서 임의로 분해하여 올리고당을 생성하는 엔도형 펙티나아제(pectinase)와 말단기에서 순차로 분해하여 단당류를 생성하는 엑소형 펙티나아제로 분류할 수 있고 전자는 액화형, 후자는 당화형 펙틴 가수분해효소에 속한다.

다음으로, (b) 단계는 수득된 상등액을 여과하여 분자량 1 내지 10 kDa의 다당체를 수득하는 단계이며, (c) 단계는 상기 수득된 다당체를 투석하여 갈락토유로노글루코올리고당을 수득하는 단계이다.

본 발명의 일양태에서는 수득된 상등액을 한외여과기(ultrafiltrator)를 이용하여 분자량 1 ~ 10 kDa의 시료를 수득하였으며, 이후 얻어진 시료를 1 kDa의 투석막을 이용하여 갈락토유로노글루코올리고당이 포함된 분획을 수득하였다.

본 발명의 방법으로 제조한 갈락토유로노글루코올리고당의 분자량은 1800 내지 2600 Da, 바람직하게는 2000 내지 2400 Da, 더욱 바람직하게는 2400 Da인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 수득된 갈락토유로노글루코올리고당은 글루쿠론산(glucuronic acid)에 비해 갈락투론산(galacturonic acid)의 함량이 2 내지 3배, 바람직하게는 2.4 내지 2.8배 높은 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 상기에서 제조한 GuG-PS 및 GuG-OS의 분자량을 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)로 측정한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 GuG-PS의 분자량은 PS1, PS2, PS3, PS4 순으로 605000, 513000, 470000, 439000 Da 이며, GuG-OS의 분자량은 2200 Da 인 것으로 확인하였다.

본 발명의 일양태에서 GuG-PS 및 GuG-OS의 중성당을 측정한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, GuG-PS 경우 글루코오스(glucose)의 함량이 가장 높았으며, 갈락토오스(galactose), 아라비노오스(arabinose), 람노오스(rhamnose) 순으로 중성당이 포함되어 있으며, GuG-OS 경우 글루코오스(glucose)의 함량이 높아진 반면, 갈락토오스(galactose), 아라비노오스(arabinose)의 함량이 줄어 람노오스(rhamnose)와 비슷한 수준으로 감소된 것을 확인하였다.

또한, GuG-PS 및 GuG-OS의 유론산을 측정한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, GuG-PS 경우 글루쿠론산(glucuronic acid)에 비해 갈락투론산(galacturonic acid)의 함량이 약 10.3배 높은 것을 확인하였으며, GuG-OS 경우 약 2.6배 높은 것을 확인하였다.

상기 결과를 바탕으로 본 발명자들은 GuG-OS 뿐만 아니라 GuG-PS 역시 성분당 조성이 기존의 펙틴 형태인 호모갈락투로난(Homogalacturonan), 람노갈락투로난 Ⅰ(Rhamnogalacturonan Ⅰ), 람노갈락투로난 Ⅱ(Rhamnogalacturonan Ⅱ)와는 다른 새로운 구조의 다당체임을 규명하였다.

즉, GuG-PS는 주로 글루코오스(glucose)로 구성되어 있으며, 글루오코스 : 아라비노오스(Arabinose) : 갈락토오스(galactose) : 갈락투론산(galacturonic acid)의 구성비는 10 : 1 : 1 : 1로 기존의 펙틴 다당체 구조와는 성분당 조성이 다른 신규한 구조의 다당체임을 확인하였다.

본 발명은 또한, 인삼박 유래 갈락토유로노글루코올리고당을 유효성분으로 함유하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 또는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품용 조성물;을 포함한다.

상기 갈락토유로노글루코올리고당은 바람직하게 상기 인삼박 유래 갈락토유로노글루칸 다당체로부터 제조한 갈락토유로노글루코올리고당을 사용할 수 있으며,총 조성물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부, 바람직하게는 0.01 내지 5 중량부로 포함될 수 있으며, 좀더 구체적으로는 100 내지 1000 ㎍/㎖ 농도로 포함될 수 있다.

상기 조성물의 용매로는 갈락토유로노글루코올리고당의 면역기능 강화 또는 항암 효과를 방해하지 않는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 보다 바람직하게는 물, 에탄올, 프로필 알코올, DMSO 등일 수 있다. 상기 갈락토유로노글루코올리고당의 농도가 0.01 중량부 미만일 경우 면역강화 또는 항암효능이 떨어질 수 있다. 또한, 10 중량부를 초과할 경우 농도 증가로 인한 효능의 향상이 적어 효율이 떨어지는 문제점이 있을 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 갈락토유로노글루코올리고당은 대식세포의 증식율을 향상시키거나, 종양괴사 인자-α (TNF-α; tumor necrosis factor-alpha) 및 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인(cytokine)의 발현을 증가시켜 면역기능을 강화시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 갈락토유로노글루코올리고당 처리에 의한 대식세포인 RAW264.7 세포의 생존율을 측정하였으며, 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 대조군에 비해 갈락토유로노글루코올리고당을 처리한 그룹에서 대식세포의 증식이 향상되는 것을 확인하였으며, 이는 갈락토유로노글루코올리고당이 정상세포에는 독성을 보이지 않는 것을 의미하기도 한다.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에서, 갈락토유로노글루코올리고당 처리에 의한 대식세포에서 사이토카인 발현 정도를 확인한 결과, 도 6 및 도 7 나타난 바와 같이, 갈락토유로노글루코올리고당 농도 의존적으로 TNF-α 및 IL-6의 생성이 증가하는 것을 확인하였다.

상기 암은 폐암, 위암, 대장암, 유방암, 자궁경부암 및 간암으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 상기 갈락토유로노글루코올리고당은 암 세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도할 수 있다

본 발명의 일실시예에서, 갈락토유로노글루칸 다당체(GuG-PS) 및 갈락토유로노글루코올리고당(GuG-OS)의 처리에 따른 암세포의 형태 변화를 관찰한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, GuG-PS는 암세포에 아무런 영향이 없는 것을 확인한 반면, GuG-OS는 농도의존적으로 세포체 응축, 신경돌기 소실, 분절, 세포막수포현상 등의 세포사멸 형태가 증가되는 것을 확인하였다.

또한, GuG-PS 및 GuG-OS 처리 농도에 따른 암세포 성장억제 효과를 확인한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, GuG-PS의 경우 오히려 암세포의 증식을 향상시키는 것을 확인한 반면, GuG-OS은 농도 의존적으로 암세포의 생존율을 현저히 감소시키는 것을 확인하였으며, 1000 ㎍/㎖ 농도의 GuG-OS를 처리한 경우 약 50% 이상의 암세포 성장 억제효과를 보이는 것을 확인하였다.

본 발명에서는 항암효과를 확인하기 위해 폐암 유래 세포를 사용하였으나, 이에 한정되지 않으며, 상기에서 설명한 다양한 암의 세포사멸을 유도할 수 있으며, 본 발명의 갈락토유로노글루코올리고당은 대식세포를 활성화시킬 수 있으므로, 대식세포 활성화에 따른 암세포에 대한 독성을 유도할 수 있다.

또한, 상기 도 8 및 도 9의 결과를 살펴보면, 인삼박 유래의 갈락토유로노글루칸 다당체(GuG-PS)는 암세포에 대한 항암효과가 전혀 없고, 오히려 높은 농도로 처리할 경우에는 암세포의 증식을 향상시키는 것으로 보아 인삼박 유래 물질 대부분이 항암활성을 가진다고 볼 수 없으며, 면역강화 및 항암활성은 본 발명의 방법을 제조한 갈락토유로노글루코올리고당(GuG-OS)의 특이한 기능으로 볼 수 있다.

따라서, 본 발명의 갈락토유로노글루코올리고당을 유효성분으로 포함하는 면역기능 강화, 또는 항암용 조성물은 종래 약학적 조성물에 나타났던 부작용이 없으면서, 효과적으로 대식 세포의 증식률을 높이고 TNF-α 와 IL-6의 생성률을 높이며, 암 세포의 사멸을 유도할 수 있으므로, 면역기능 강화, 또는 항암용 의약품 또는 건강기능식품으로 활용될 수 있다.

본 발명에 따른 갈락토유로노글루코올리고당을 유효성분으로 포함하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물은 면역강화 또는 항암활성을 가지고 있는 다른 천연물질 또는 화합물을 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 면역기능 강화, 또는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물은 여러 가지 제형으로 제제화할 수 있다. 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 갈락토유로노글루코올리고당에 적어도 하나 이상의 부형제(예를 들면, 전분, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴) 등이 섞여 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함될 수 있다. 비수용성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 대상의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 수 있다.

본 발명의 면역기능 강화, 또는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 인체에 투여하는 경우, 천연 추출물인 관계로 다른 합성 의약품에 비하여 부작용의 우려가 적어 안심하고 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 갈락토유로노글루코올리고당을 유효성분으로 포함하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 면역기능 강화, 또는 암 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 포함하는 건강기능식품의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등일 수 있다.

상기 건강식품은 갈락토유로노글루코올리고당 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 갈락토유로노글루코올리고당을 유효 성분으로 함유하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 및 개선용 음료는 갈락토유로노글루코올리고당이 유효성분으로 포함되는 것 이외에 칼슘, 가시오가피 농축액, 액상과당, 정제수 등을 첨가 혼합하여 드링크용 병에 충진하여 살균한 후 실온으로 냉각하여 음료를 제조할 수 있다. 또한, 상기 갈락토유로노글루코올리고당을 유효 성분으로 함유하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 및 개선용 건강보조제는 갈락토유로노글루코올리고당에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드), 올리고당, 50% 에탄올, 정제수를 첨가 혼합하여 과립상으로 성형하여 진공건조기에서 건조시킨 후, 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하여 적당량씩 압출 성형하여 정제 또는 분말로 하거나 경질캡슐에 충전하여 경질캡슐제품으로 제조할 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 상기 갈락토유로노글루코올리고당의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 예방 또는 치료적 처치 등의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

갈락토유로노글루칸 다당체( Galacturonoglucopolysaccharide ; GuG - PS ) 제조공정

본 발명에서는 인삼박에서 갈락토유로노글루칸 다당체를 수득하기 위해 도 1a에 나타난 공정도에 따라 갈락토유로노글루칸 다당체를 수득하였다.

먼저, 인삼박 분말 60 ｇ에 증류수 600 ㎖을 첨가하고 5 시간 동안 교반한 다음, 원심분리하여 상등액을 수득한 후 수득된 상등액의 3배 볼륨의 에탄올(ethanol; EtOH)을 처리하였다. 그 다음, 다시 한번 원심분리하여 침전물을 획득한 후 균질기(homogenizer)를 이용하여 분쇄하고, 분쇄물을 12 ~ 14 kDa의 투석막(dialysis membrane; Part No. 132576, SPECTRUM LABS, 미국)을 사용하여 분획물을 수득하였다. 수득된 분획물을 건조하여 분말(powder) 형태의 다당체(polysaccharide)를 획득하였다.

갈락토유로노글루칸 다당체로부터 갈락토유로노글루코올리고당( Galacturonoglucooligosaccharide; GuG - OS ) 제조공정

본 발명에서는 도 1b에 나타낸 공정도에 따라 실시예 1에서 제조한 GuG-PS로부터 갈락토유로노글루코올리고당을 제조하였다.

먼저, 실시예에서 수득한 분말 형태의 GuG-PS가 1%가 되도록 0.1 M의 소듐아세테이트(0.1 M sodium acetate, pH 4.0)에 녹여 준비한 다음, 가수분해효소인 펙티나제(No. 17389, Sigma, 미국)가 10%가 되도록 0.1 M의 소듐아세테이트(pH 4.0)에 녹여 준비하였다. 그 다음, 1% GuG-PS 및 10% 펙티나제를 1 : 1로 혼합하고 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 시료를 100℃에서 15분간 가열하여 효소를 불활성화시킨 후 원심분리하여 상등액을 수득하였으며, 수득한 상등액을 한외여과기 (ultrafiltrator; No. 17521-105, Sartorius, 독일)를 이용하여 분자량 1 ~ 10 kDa의 시료를 획득하였다. 이 후, 얻어진 시료를 1 kDa의 투석막(dialysis membrane; Part Number. 132640, SPECTRUM LABS, 미국)을 사용한 후 분획을 건조하여 분말(powder) 형태의 갈락토유로노글루코올리고당을 수득하였다.

GuG - PS 및 GuG - OS 의 분자량 측정

본 발명의 실시예 1에서 수득한 GuG-PS 및 실시예 2에서 수득한 GuG-OS의 분자량을 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 수행하였으며, HPLC는 미국 워터스사 (Waters Alliance HPLC 2695)의 제품을 사용하였다.

컬럼은 SB-showdex 804 HQ 컬럼을 사용하였으며, 이동상으로는 3차 증류수를 사용하였다. 분석 시료인 GuG-PS 및 GuG-OS는 각각 10㎕이 되도록 주입하였으며, 분식시 이동상의 속도는 0.7 ㎖/min으로 하여 분석하였다. 표준물질로는 pullulan (P-1320, P-5900, P-11800, P-212000, P-404000; Fluka, 독일)을 사용하였다.

그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이 GuG-PS의 분자량은 PS1, PS2, PS3, PS4 순으로 605000, 513000, 470000, 439000 Da인 것을 확인하였으며, 도 2b에 나타난 바와 같이 GuG-OS의 분자량은 2200Da 인 것을 확인하였다.

GuG-PS 및 GuG-OS의 중성당 측정

본 발명에서는 실시예 1 및 실시예 2에서 수득한 GuG-PS 및 GuG-OS를 구성하고 있는 중성당을 측정하였다.

먼저, GuG-PS 및 GuG-OS 각각을 100 ㎍을 증류수 340 ㎕에 녹인 후 60 ㎕의 TFA(trifluoroacetic acid)을 가한 다음, 100℃에서 4시간 동안 가열하여 가수분해하였다. 그 다음, SpeedVac을 이용하여 시료 속의 수분과 용매를 제거하였다.

단당류 (Fuc; fucose, Rha; rhamnose, Ara; arabinose, Gal; galactose; Glc; glucose, Man; mannose, Xyl; xylose) 표준품은 1 M로 만들어 필터한 후 사용하였으며, 중성당의 측정을 위해 사용한 Bio-LC는 Dionex(DX 500 Chromatography system, Dionex Co, 미국)의 제품을 사용하였다. 컬럼은 Carbo-Pak PA1(Dionex Co, 미국)을 사용하였으며, 검출기(detector)는 ED 50(Dionex Co, 미국)을 사용하였다.

각 시료는 10 ㎕씩 주입하였으며, 버퍼 A(dH₂O)와 버퍼 B(200 mM NaOH)를 이용하여 0.8 ㎖/min으로 하여 용출하였다.

GuG-PS 및 GuG-OS의 중성당 분석 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 GuG-PS 경우 글루코오스(glucose)의 함량이 가장 높았으며, 갈락토오스(galactose), 아라비노오스(arabinose), 람노오스(rhamnose) 순으로 중성당이 포함되어 있으며, GuG-OS 경우 글루코오스(glucose)의 함량이 높아진 반면, 갈락토오스(galactose), 아라비노오스(arabinose)의 함량이 줄어 람노오스(rhamnose)와 비슷한 수준으로 감소된 것을 확인하였다.

GuG-PS 및 GuG-OS의 유론산 측정

본 발명에서는 실시예 1 및 실시예 2에서 수득한 GuG-PS 및 GuG-OS를 구성하고 있는 유론산의 함량을 측정하였다.

유론산(GalA; galacturonic acid, GlcA; glucuronic acid) 표준품은 1 M로 만들어 필터 후 사용하였다. 유론산의 측정을 위해 사용한 Bio-LC는 Dionex(DX 500 Chromatography system, Dionex Co, 미국)의 제품을 사용하였다. 컬럼은 Carbo-Pak PA100(Dionex Co, 미국)이고 detector는 ED 50 (Dionex Co, 미국)을 사용하였다.

GuG-PS 및 GuG-OS의 유론산을 측정한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, GuG-PS 경우 글루쿠론산(glucuronic acid)에 비해 갈락투론산(galacturonic acid)의 함량이 약 10.3배 높은 것을 확인하였으며, GuG-OS 경우 약 2.6배 높은 것을 확인하였다.

GuG-OS 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 생존율 확인

본 발명에서는 갈락토유로노글루코올리고당의 면역 기능 강화 효능을 확인하기 위해 갈락토유로노글루코올리고당 처리 농도에 따른 대식세포인 RAW264.7 세포의 생존율을 측정하였다.

먼저, RAW264.7 세포(No. TIB-71^TM, ATCC, 미국)를 1×10⁵ cells/㎖이 되도록 48-웰 플레이트(48-well culture plates; SPL, 한국)의 각 웰에 500 ㎕씩 첨가하고 24 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한 다음, GuG-OS를 처리하기 전에 새로운 DMEM 배지(10% FBS, 1% penicillin-streptomycine)으로 교환해 주었다. 그 다음 GuG-OS는 각각 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 RAW264.7 세포에 처리하였다.

그 후 24 시간 동안 배양한 다음, MTT 어세이 방법을 이용하여 세포 생존율을 측정하였으며, 각 웰에 PBS 완충액에 녹인 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, 5 ㎎/㎖, ROTH, Germany) 용액을 100 ㎕씩 첨가하여 다시 4시간 동안 배양시켰다.

포르마잔(Formazan) 형성을 확인한 후, 배지를 완전히 제거한 다음, 각 웰 바닥에 형성된 formazan을 녹이기 위해 500 ㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하고 ELISA reader를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 대조군에 비해 갈락토유로노글루코올리고당을 처리한 그룹에서 대식세포의 증식이 향상되는 것을 확인하였으며, 이는 갈락토유로노글루코올리고당이 정상세포에는 독성을 보이지 않는 것을 의미하기도 한다.

GuG-OS 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 사이토카인 생성 정도 측정

본 발명에서는 갈락토유로노글루코올리고당 처리에 의한 대식세포에서 사이토카인 발현 정도를 확인하기 위해 갈락토유로노글루코올리고당 처리 농도에 따른 종양괴사 인자-α (TNF-α; tumor necrosis factor-alpha) 및 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6)의 생성정도를 측정하였다.

먼저, RAW264.7 세포를 1×10⁵ cells/㎖이 되도록 6-웰 플레이트(6-well culture plates; SPL, 한국)의 각 웰에 1 ㎖씩 첨가하고 24 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한 다음, GuG-OS를 처리하기 전에 새로운 DMEM 배지(10% FBS, 1% penicillin-streptomycine)으로 교환해 주었다. 그 다음 GuG-OS는 각각 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 RAW264.7 세포에 처리하였다.

24시간 배양한 후 세포배양액을 수득한 다음, 배양액에 함유된 사이토카인을 ELISA kit (Quantikine Immunoassay Mouse TNF-α, Quantikine Immunoassay Mouse IL-6, R&D systems, 미국)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 대조군과 비교하였을 때 GuG-OS 농도(0, 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖) 의존적으로 TNF-α 생성 농도가 각각 8.96, 534.94, 1801.77, 2045.96, 2031.59 pg/㎖로 증가하는 것을 확인하였으며, 도 7에 나타난 바와 같이 IL-6 생성 농도는 각각 2.645, 6.228, 18.272, 75.484, 570.974pg/㎖로 증가하는 것을 확인하였다.

GuG - PS 및 GuG - OS 처리에 따른 암세포 형태변화 관찰

본 발명에서는 갈락토유로노글루칸 다당체(GuG-PS) 및 갈락토유로노글루코올리고당(GuG-OS)의 처리에 따른 암세포의 형태 변화를 광학현미경으로 관찰하였다.

먼저, 인간 폐암 세포주인 A549 세포(KCLB No. 10185, 한국세포주은행)가 1×10⁵ cells/㎖이 되도록 6-웰 플레이트(6-well culture plates; SPL, 한국)의 각 웰에 1 ㎖씩 첨가하고 RPMI 1640 배지(10% FBS, 1% penicillin-streptomycine)에서 24 시간 동안 37℃ 조건으로 5% CO₂ 배양기에서 배양하였으며, GuG-PS 및 GuG-OS를 각각 0, 125, 250, 500, 750, 1000 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 세포에 처리한 다음, 96시간 동안 배양한 후 광학현미경(×200)으로 세포의 형태를 관찰하였다.

그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, GuG-PS는 암세포에 아무런 영향이 없는 것을 확인한 반면, GuG-OS는 농도의존적으로 세포체 응축, 신경돌기 소실, 분절, 세포막수포현상 등의 세포사멸 형태가 증가되는 것을 확인하였다.

GuG-PS 및 GuG-OS 처리에 따른 암세포 성장억제 효과확인

본 발명에서는 갈락토유로노글루칸 다당체(GuG-PS) 및 갈락토유로노글루코올리고당(GuG-OS)의 처리에 따른 암세포의 성장 억제 효과를 MTT 어세이를 이용하여 측정하였따.

먼저, 인간 폐암 세포주인 A549 세포가 1×10⁵ cells/㎖이 되도록 96-웰 플레이트(96-well culture plates; SPL, 한국)의 각 웰에 200 ㎕씩 첨가하고 24 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후, GuG-PS 및 GuG-OS를 처리하기 전 혈청이 없는 RPMI 1640 배지로 교환하여 2시간 동안 배양하였다.

그 후, GuG-PS 및 GuG-OS를 각각 0, 125, 250, 500, 750, 1000 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 세포에 처리하여 96 시간 동안 배양한 다음, 실시예 6과 동일한 방법으로 MTT 어세이를 수행하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, GuG-PS의 경우 오히려 암세포의 증식을 향상시키는 것을 확인한 반면, GuG-OS은 농도 의존적으로 암세포의 생존율을 현저히 감소시키는 것을 확인하였으며, 1000 ㎍/㎖ 농도의 GuG-OS를 처리한 경우 약 50% 이상의 암세포 성장 억제효과를 보이는 것을 확인하였다.

Claims

(a) 인삼박(ginseng cake)으로부터 수득한 갈락토유로노글루칸 다당체(Galacturonglucopolysaccharide)를 효소분해 한 다음, 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
(b) 수득된 상등액을 여과하여 분자량 1 내지 10 kDa의 다당체를 수득하는 단계; 및
(c) 상기 수득된 다당체를 투석하여 갈락토유로노글루코올리고당(Galacturonoglucooligosaccharide)을 수득하는 단계;
를 포함하는 갈락토유로노글루코올리고당 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 갈락토유로노글루칸 다당체는
(ⅰ) 인삼박에 용매를 첨가하여 혼합한 다음, 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
(ⅱ) 상기 수득된 상등액에 용매를 첨가하여 혼합한 다음, 원심분리하여 침전물(pellet)을 수득하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 수득된 침전물에 다시 용매를 처리하여 분쇄한 다음, 투석하여 분자량 4,000,000 Da 내지 7,000,000 Da의 다당체를 수득하는 단계;
를 포함하는 방법으로 수득된 것을 특징으로 하는 갈락토유로노글루코올리고당 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 (ⅰ) 내지 (ⅲ) 단계의 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 갈락토유로노글루코올리고당 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 효소분해는
(ⅰ) 갈락토유로노글루칸 다당체에 펙티나제(pectinase)를 첨가한 다음, 45 내지 55℃에서 30 내지 90분 동안 교반하는 단계; 및
(ⅱ) 90 내지 110℃에서 10 내지 20분 동안 가열하여 효소를 불활성화시키는 단계;
를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 갈락토유로노글루코올리고당 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 수득한 갈락토유로노글루코올리고당의 분자량은 1800 내지 2600 Da인 것을 특징으로 하는 갈락토유로노글루코올리고당 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 수득한 갈락토유로노글루코올리고당은 글루쿠론산(glucuronic acid)에 비해 갈락투론산(galacturonic acid)의 함량이 2 내지 3배 높은 것을 특징으로 하는 갈락토유로노글루코올리고당 제조방법.
인삼박 유래 갈락토유로노글루코올리고당을 유효성분으로 함유하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 갈락토유로노글루코올리고당은 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항 이상의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 갈락토유로노글루코올리고당은 대식세포의 생존율을 향상시키거나,
종양괴사 인자-α (TNF-α; tumor necrosis factor-alpha) 및 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인(cytokine)의 발현을 증가시켜 면역기능을 강화시키는 것을 특징으로 하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 대장암, 유방암, 자궁경부암 및 간암으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 갈락토유로노글루코올리고당은 암 세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 것을 특징으로 하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
인삼박 유래 갈락토유로노글루코올리고당을 유효성분으로 함유하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제12항에 있어서, 상기 갈락토유로노글루코올리고당은 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항 이상의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제12항에 있어서, 상기 갈락토유로노글루코올리고당은 대식세포의 생존율을 향상시키거나,
종양괴사 인자-α (TNF-α; tumor necrosis factor-alpha) 및 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인(cytokine)의 발현을 증가시켜 면역기능을 강화시키는 것을 특징으로 하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제12항에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 대장암, 유방암, 자궁경부암 및 간암으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제12항에 있어서, 상기 갈락토유로노글루코올리고당은 암 세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 것을 특징으로 하는 면역기능 강화, 또는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.