KR100544856B1 - 조류 유래의 생리활성물질을 이용한 의약, 식품 또는 음료 - Google Patents

조류 유래의 생리활성물질을 이용한 의약, 식품 또는 음료 Download PDF

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다까나리 도미나가
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다께시 사까이
푸-공 유
가쯔시게 이까이
이꾸노신 가또
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Abstract

화학식 (1)로 표시되는 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그의 알데히드체, 그의 포수체 및 그들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 유효 성분으로 이루어지는 그 화합물에 감수성을 나타내는 질환의 치료, 개선 또는 예방용의 의약 조성물, 음식품, 화장료 등을 제공한다. 이 화합물은 아포토시스 유발, 항암, 활성 산소 생성억제, 과산화지질 라디칼 생성억제, NO 생성 억제 등의 활성을 나타내고, 항산화제나, 선도 유지제의 유효 성분으로서도 유용하다.
<화학식 1>

Description

조류 유래의 생리활성물질을 이용한 의약, 식품 또는 음료{Drugs, foods or drinks with the use of algae-derived physiologically active substances}
본 발명은 조류 유래의 생리활성물질의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 그 생리활성물질을 함유하는 의약, 항산화제, 선도유지제, 화장료, 그 생리활성 조성물를 함유하는 기능성 식품 또는 음료, 또는 기능성 발현용 당에 관한 것이다.
최근, 세포 또는 조직의 죽음에 관하여 아포토시스(apoptosis, 아포프토시스라고도 한다; 자폭사 또는 세포자멸)라는 양식이 주목을 받고 있다.
이 아포토시스는 병리적 세포사인 괴사와 다르고, 세포 자신의 유전자에 처음부터 프로그램되어 있는 죽음이다. 즉, 어떠한 외부적 또는 내부적 요인이 원인이 되어 아포토시스를 프로그램하는 유전자가 활성화됨으로써, 프로그램사(死) 단백질이 생합성되고, 또한 어떤 경우에는 불활성형으로서 세포내에 존재하는 프로그램사 단백질이 활성화된다. 이렇게 해서 생성된 활성형 프로그램사 단백질에 의해 세포자체가 분해되어 죽음에 이른다고 생각되고 있다.
이러한 아포토시스를 원하는 조직, 세포에서 발현시킬 수 있으면, 불필요 또는 유해한 세포를 자연의 형태로 생체로부터 배제할 수 있게 되어 매우 의의 깊은 것이다.
<발명의 목적>
한천 등의 조류 유래의 올리고당은 식품소재로서의 개발이 기대되고 있지만(푸드케미컬, 1988-2, 40-44; 별책 푸드케미컬-4, 1990년 12월, 127-131; 일본국 특허공개 평 6-38691호), 아포토시스 유발작용 등의 생리기능은 불분명하다.
본 발명의 목적은 천연물 유래의 아포토시스 유발작용 등의 생리기능을 갖는 안정성이 높은 물질을 개발하고, 그 물질를 유효 성분으로 하는 아포토시스 유발제 등의 그 화합물에 감수성을 나타내는 질환용 의약품, 그 물질을 구성성분으로 하는 기능성 음식품 등을 제공하는데 있다.
<발명의 개요>
본 발명을 개설하면, 본 발명의 제 1의 태양은 하기 화학식 (1)로 표시되는 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그의 알데히드체, 그의 포수체 및 그들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원말단에 갖는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물의 적어도 1종을 유효 성분으로서 함유하는, 그 화합물에 감수성을 나타내는 질환의 치료 또는 예방용 의약조성물이다.
Figure 112000009182352-pct00001
본 발명의 제 2의 태양은 화학식 (1)로 표시되는 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그의 알데히드체, 그의 포수체 및 그들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원말단에 갖는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물의 적어도 1종을 포함하여 이루어지는, 이들 화합물에 감수성을 나타내는 질환의 증상개선용 또는 그 질환의 예방용 식품 또는 음료이다.
본 발명의 제 3의 태양은 화학식 (1)로 표시되는 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그의 알데히드체, 그의 포수체 및 그들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물의 적어도 1종을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화제이다.
본 발명의 제 4의 태양은 본 발명의 제 3의 태양의 항산화제를 함유하는 것을 특징으로 하는 음식품이다.
본 발명의 제 5의 태양은 화학식 (1)로 표시되는 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그의 알데히드체, 그의 포수체 및 그들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항산화용 당이다.
본 발명의 제 6의 태양은 화학식 (1)로 표시되는 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그의 알데히드체, 그의 포수체 및 그들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 선도유지제 이다.
본 발명의 제 7의 태양은 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 당 화합물을 유효 성분으로 하는 화장료이다.
본 발명의 제 8의 태양은 화학식 (1)로 표시되는 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그의 알데히드체, 그의 포수체 및 그들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 포함하여 이루어지는 산성 음식품이다.
본 발명의 또 다른 태양은 화학식 (1)로 표시되는 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그의 알데히드체, 그의 포수체 및 그들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 의약조성물, 음식품, 항산화제, 선도유지제 또는 화장료의 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다.
이하, 첨부의 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.
도 1은 한천의 0.12N 염산 분해물의 겔 여과 용출도를 나타내는 도면이다.
도 2는 한천의 1N 염산 분해물의 겔 여과의 용출도를 나타내는 도면이다.
도 3은 한천의 산 분해물의 사이즈-배제 HPLC 크로마토그램을 나타내는 도면이다.
도 4는 아포토시스 유발성 및 항암성 물질의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 5는 아포토시스 유발성 및 항암성 물질(포수체)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 6은 아포토시스 유발성 및 항암성 물질(알데히드체)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 7은 아가로비오스, 아가로테트라오스 및 아가로헥사오스의 순상(順相) HPLC의 용출패턴을 나타내는 도면이다.
도 8은 66.7분의 피크의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 9는 78.5분의 피크의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 10은 85.5분의 피크의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 11은 3,6-안히드로-L-갈락토스의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 12는 3,6-안히드로-L-갈락토스(포수체)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 13은 3,6-안히드로-L-갈락토스(알데히드체)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 14는 최종농도 250μM의 올리고당을 첨가하여 HL-60 세포를 배양하였을 때의 배양 시간과 생세포 수를 나타내는 도면이다.
도 15는 최종농도 125μM의 올리고당을 첨가하여 HL-60 세포를 배양하였을 때의 배양 시간과 생세포 수를 나타내는 도면이다.
도 16은 0.5M 인산 중에서 가열처리한 한천의 순상 HPLC의 용출패턴을 나타내는 도면이다.
도 17은 아가로비오스의 검량선를 나타내는 도면이다.
도 18은 0.2% 한천의 0.1M HCl 용액에 있어서의 가열 시간과 아가로비오스의 생성량과의 관계를 나타내는 도면이다.
도 19는 0.2% 한천의 0.1M 시트르산 용액에 있어서의 가열시간과 아가로비오스의 생성량과의 관계를 나타내는 도면이다.
도 20은 500mM 시트르산, 80℃에서의 아가로올리고당 생성을 나타내는 도면이다.
도 21은 500mM 시트르산, 95℃에서의 아가로올리고당 생성을 나타내는 도면이다.
도 22는 1200mM 락트산, 80℃에서의 아가로올리고당 생성을 나타내는 도면이다.
도 23은 120OmM 락트산, 95℃에서의 아가로올리고당 생성을 나타내는 도면이다.
도 24는 1000mM 말산, 80℃에서의 아가로올리고당 생성을 나타내는 도면이다.
도 25는 1000mM 말산, 95℃에서의 아가로올리고당 생성을 나타내는 도면이 다.
도 26은 1000mM 말산, 70℃에서의 아가로올리고당 생성을 나타내는 도면이다.
도 27은 κ-카라기난산 분해물의 순상 HPLC 크로마토그램를 나타내는 도면이다.
도 28은 아포토시스 유발성 및 항암성 물질의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 29는 아포토시스 유발성 및 항암성 물질의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 30은 셀룰로파인 GCL-25에 의한 겔 여과의 결과를 나타내는 도면이다.
도 31은 세파덱스 LH-20 컬럼에 의한 겔 여과의 결과를 나타내는 도면이다.
도 32는 β-D-갈락토피라노실-(1→4)-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 33은 β-D-갈락토피라노실-(1→4)-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 34는 ConA에 의한 림프구 유약화 반응에 있어서 아가로비오스 농도와 3H-티미딘 포함량의 관계를 나타내는 도면이다.
도 35는 혼합 림프구반응에 있어서 아가로비오스 농도와 3H-티미딘 포함량의 관계를 나타내는 도면이다.
도 36은 아가로비오스를 첨가하고 각 배양조건으로 배양하였을 때의 배지중의 NO2 -농도를 나타내는 도면이다.
도 37은 네오아가로비오스를 첨가하고 각 배양조건으로 배양하였을 때의 배지중의 NO2 -농도를 나타내는 도면이다.
도 38은 한천 염산 분해용액, 한천 시트르산 분해용액을 첨가하고 배양하였을 때의 배지중의 NO2 -농도를 나타내는 도면이다.
도 39는 3,6-안히드로-D-갈락토스 또는 갈락토스를 첨가하고 배양하였을 때의 배지중의 NO2 -농도를 나타내는 도면이다.
도 40은 각 배양조건으로 배양하였을 때의 배지중의 NO2 -농도를 나타내는 도면이다.
도 41은 본 발명의 올리고당의 항암 활성을 나타내는 도면이다.
도 42는 본 발명의 올리고당의 PCA 반응억제를 나타내는 도면이다.
본 발명에 있어서의 화학식 (1)로 표시되는 3,6-안히드로갈락토피라노스(이하, 단순히 3,6-안히드로갈락토피라노스라고 칭한다)의 알데히드체는 화학식 (2)로 표시되는 화합물이다. 그의 포수체는 화학식 (3)으로 표시되는 화합물이다. 또한, 3,6-안히드로갈락토피라노스의 2-O-메틸화체는 화학식 (4)로 표시되는 화합물이다. 또한, 그 메틸화체의 알데히드체는 화힉식 (5)로 표시되는 화합물이다. 그의 포수물은 화학식 (6)으로 표시되는 화합물이다.
Figure 112000009182352-pct00002
Figure 112000009182352-pct00003
Figure 112000009182352-pct00004
Figure 112000009182352-pct00005
Figure 112000009182352-pct00006
본 명세서에 있어서의 화학식 (1)∼(6)의 구조는, 다른 표현형으로 나타내는 것도 가능하며, 그러한 다른 표현형 및 가능한 그들의 호변 이성체도 포함시켜, 화학식 (1)∼(6)으로 나타내는 것으로 한다. 또한, 식 (1)∼(6)에 있어서의 입체배치는 원하는 활성이 얻어지는 한, 특히 한정하는 것이 아니고, D-형, L-형 또는 그것들의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 가용성 당 화합물은 특히 한정하는 것이 아니지만, 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그의 알데히드체, 그의 포수체 및 그들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물(이하, 이들을「화학식 (1)∼(6)의 화합물」로 하여 총칭한다)의 적어도 1종을 함유하는 가용성의 당 화합물로서, 화학식 (1)∼(6)의 화합물의 적어도 1종을 함유하는 물질(이하, 간단히 원료 물질이라 한다)을 pH 7 미만의 산성하에서 산분해 및/또는 효소분해하여 얻을 수 있고, 또한 화학합성법에 의해서도 얻을 수 있다. 본 발명의 가용성의 당 화합물은 사용시에 고화 또는 반고화(겔화)되지 않는 화합물이면 특별히 한정하는 것이 아니다. 따라서, 사용에 있어서 졸화하는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 함유하는 당 화합물은 본 발명의 가용성의 당 화합물에 포함된다. 또, 본 발명에 있어서 적합하게 사용되는 그 가용성의 당 화합물에는, 예를 들어 그 비환원 말단이 L-갈락토스-6- 황산 이외의 당인 당 화합물이고, 예를 들어 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등의 당 화합물이 포함된다.
그 가용성 당 화합물을 얻는데 이용하는 원료물질은 특별히 한정하는 것이 아니고, 예를 들어 아가로스, 아가로펙틴, 푸노란, 포르피란, 카라기난, 푸르셀라란, 히프네안 등의 홍조의 점질다당[쿄리쯔출판(주) 발행, 다당생화학1-화학편-, 제314페이지(1969)]이 예시된다.
또한, 이것들의 다당의 함유물도 원료물질에 포함된다. 예를 들어 아가로스, 아가로펙틴의 원료로서는 겔리디아세아에(Gelidiaceae)에 속하는 홍조류, 예로서 겔리디움 아만시이(Gelidium amansii), 겔리디움 자파니쿰(Gelidium japanicum), 겔리디움 파시피쿰(Gelidium pacificum), 겔리디움 섭코스타툼(Gelidium subcostatum), 프테로클라디아 테누이스(Pterocladiatenuis), 아칸토펠티스 자포니카(Acanthopeltis japonica) 등, 그라시라리아세아에(Gracilariaceae)에 속하는 홍조류, 예로서 그라시라리아 베르루코사(Gracilaria verrucosa), 그라시라리아 기가스(Gracilaria gigas) 등, 세라미아세아에(Ceramiaceae)에 속하는 홍조류, 예로서 세라미움 콘도이(Ceramium kondoi), 캄피라에포라 힙나에오이데스(Campylaephora hypnaeoides)등 및 기타 홍조류가 이용되고, 통상 수종류의 조류를 배합하여 원료로 한다. 원료 조류는, 통상 천일에 말려 건조시킨 것을 이용하지만, 본 발명에 있어서는 생조류 및 건조시킨 조류를 사용할 수 있다. 또한, 건조시에 물을 분무시키면서 표백한, 소위 표백한 원료조류도 사용할 수 있다.
원료 조류를 뜨거운 물로 추출한 후, 냉각시킴으로써 「우무」가 얻어진다. 이 「우무」로부터 동결 탈수 또는 압착 탈수에 의해서 수분을 제거하고 건조시킴으로써 한천이 얻어진다. 한천은 그 기원이 되는 조류를 막론하고, 또한 봉상, 대상, 판상, 사상, 분말상 등의 여러 형태의 것을 사용할 수 있다. 통상적으로 한천 은 약 70%의 아가로스와 약 30%의 아가로펙틴을 포함하고 있지만, 정제를 진행시켜 더욱 고순도의 아가로스를 조제하는 것이 가능하다. 정제 아가로스는 정제도가 낮은 것에서 높은 것까지, 각종 아가로스 함량의 것을 사용할 수 있다.
원료물질에는, 상기의 한천의 원료 조류, 우무, 한천, 정제 아가로스, 정제 아가로펙틴, 이것들의 제조공정에서 얻어지는 중간산물 또는 부산물이 포함된다.
아가로스는 번갈아 결합된 D-갈락토스와 3,6-안히드로-L-갈락토스를 주구조로 하는 다당이고, D-갈락토스의 1위치와 3,6-안히드로-L-갈락토스의 4위치가 β-글리코시드 결합으로, 또한 3,6-안히드로-L-갈락토스의 1위치와 D-갈락토스의 3위치가 α-글리코시드 결합으로 결합하고 있다. α-1,3 결합은 묽은 산에 의한 온화한 가수분해나, α-아가라아제[Carbohydr. Res., 제66권, 제207페이지(1978)]에 의해서 가수분해되고, 또한 β-1,4 결합은 β-아가라아제에 의해서 선택적으로 가수분해된다.
또한, 카라기난은 기가르티나세아에(Gigartinaceae), 솔리에리아세아에(Solieriaceae), 힙네아세아에(Hypneaceae)의 홍조류에 포함되는 다당이고, κ-카라기난, λ-카라기난, η-카라기난이 알려져 있다.
κ-카라기난은 D-갈락토스-4-황산의 1위치와 3,6-안히드로-D-갈락토스의 4위치가β-글리코시드 결합으로, 또한 3,6-안히드로-D-갈락토스의 1위치와 D-갈락토스-4-황산의 3위치가 α-글리코시드 결합으로 번갈아 되풀이된 기본구조를 가진다. λ-카라기난은 D-갈락토스의 1위치와 D-갈락토스-2,6-이황산의 4위치가β-글리코시드 결합으로, 또한 D-갈락토스-2,6-이황산의 1위치와 D-갈락토스의 3위치가 α-글리코시드 결합으로 번갈아 되풀이된 기본구조를 가진다. 카라기난은 식품 의 겔화제로서 이용되고 있다.
상기의 원료물질을 화학적, 물리적 및/또는 효소적방법으로 부분 분해한 것도 본 발명에 있어서의 원료물질에 포함된다.
화학적분해 방법의 예로서는, 산성으로부터 중성에서의 가수분해, 물리적분해 방법의 예로서는, 전자파나 초음파의 조사, 효소적분해 방법의 예로서는, 가수분해 효소, 예를 들어 아가라아제, 카라기나아제 등에 의한 가수분해를 들 수 있다.
원료물질의 산성으로부터 중성에서의 분해조건은, 아포토시스 유발성, 항암성, 활성 산소 생성억제 활성, 일산화질소(이하, NO라고 칭한다) 생성억제작용 등의 항산화 활성 또는 면역조절 활성 등을 갖는 화학식 (1)∼(6)의 화합물, 이것들의 화합물의 적어도 1 종을 함유하는 가용성의 당 화합물, 예를 들어 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스(이하, 단순히 카라비오스라고 칭한다) 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등의 당 화합물, 또한 그 비환원 말단이 L-갈락토스-6-황산 이외의 당인 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물을 환원 말단에 갖는 당 화합물이 생성하는 조건이라면, 특별한 한정은 없다.
예를 들어, 원료물질을 산에 용해 또는 현탁하여 반응시킴으로써, 본 발명에서 사용하는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물, 이것들의 화합물의 적어도 1종을 함유하는 가용성의 당 화합물이 생성된다. 또한, 반응시에 가열함으로써 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 이것들의 화합물의 적어 도 1종을 함유하는 가용성의 당 화합물의 생성에 필요한 반응시간은 단축된다.
원료물질, 예를 들어 아가로스나 아가로스를 함유하는 물질을 용해 또는 현탁하는 산의 종류에 특별히 한정하는 것이 아니지만, 염산, 황산, 초산 등의 무기산, 시트르산, 포름산, 아세트산, 락트산, 아스코르빈산 등의 유기산, 또한 양이온 교환수지, 양이온 교환섬유, 양이온 교환막 등의 고체산이 사용 가능하다.
산의 농도도 특별한 한정은 없지만, 0.0001∼5 노르말, 바람직하게는 0.001∼1 노르말의 농도로 사용 가능하다. 또한, 반응 온도도 특별한 한정은 없지만, 0∼200℃, 바람직하게는 20∼130℃로 설정할 수 있다. 또한, 반응시간도 특별히 한정하는 것이 아니지만, 수 초∼수 일로 설정할 수 있다. 산의 종류와 농도, 반응 온도 및 반응 시간은 원료가 되는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 적어도 1 종의 화합물을 함유하는 물질, 예를 들어 아가로스, 카라기난 등의 종류 및 목적으로 하는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물, 그것들의 화합물을 함유하는 당 화합물의 생성량, 목적으로 하는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물을 환원 말단에 갖는 가용성의 당 화합물의 중합도에 의해 적절히 선택할 수 있다. 일반적으로 약산보다도 강산, 저농도의 산보다도 고농도의 산, 저온보다도 고온을 선택함으로써 산분해반응은 빠르게 진행된다.
또한, 고체산을 사용하는 경우는, 일반적으로 강양이온 교환수지가 약양이온 교환수지보다 분해반응의 효율이 좋다. 또한, 원료물질당 사용량이 많을수록, 또한 작용온도가 높을수록, 산분해반응이 빠르게 진행한다.
예를 들어, 한천을 0.1 N 염산에 10 중량%로 현탁하여, 100 ℃에서 13 분간 가열용해시켜 불용물을 제거하여 얻어지는 본 발명에 사용되는 당 화합물 용액은 냉각시켜도 그 빙결점에서 더이상 겔화되지 않는다. 이 액에 포함되는 당류를 겔 여과 HPLC, 순상 HPLC 등의 방법으로 분석하면 고분자의 당류는 거의 보이지 않고, 대부분이 가용성의 10당 이하의 당 화합물에 분해되어 있다. 마찬가지로 고정산의 경우, 시판의 강양이온 교환수지의 Na형의 1 중량부를 1N 염산으로 H형으로 한 후, 79 중량부의 탈염수중에 넣고, 추가로 한천을 10 중량부 넣어 현탁하고 95 ℃에서 180 분간 가열하여 얻어지는 본 발명의 당 화합물 용액은, 냉각시켜도 그 빙결점에서 이미 겔화되지 않는다. 이 액에 포함되는 당류를 겔 여과 HPLC, 순상 HPLC 등의 방법으로 분석하면 고분자의 당류는 거의 보이지 않고, 대부분이 가용성의 10당 이하의 당 화합물에 분해되어 있다.
또한, 본 발명에 사용하는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물을 환원 말단에 갖는 가용성의 당 화합물의 제조에 있어서는, 시트르산, 락트산, 말산 등의 유기산을 사용하고, 산의 농도는 수 10 mM ∼ 수 M, 가열온도는 70 ∼ 95 ℃, 가열시간은 수십분∼24 시간의 범위에서 적절히 선택함으로써 생리활성을 갖는 올리고당, 예를 들어 항산화용 올리고당이 다량으로 생성된다. 또한, 가수분해한 후에 있어서, 산성을 유지하고 알칼리 조건하로 하지 않음으로써 생성된 그 생리활성 올리고당은 장기간의 보존 안정성을 나타낸다.
본 발명에 있어서 사용하는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물, 이것들의 화합물의 적어도 1종을 함유하는 가용성의 당 화합물, 예를 들어 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등의 당 화합물로서는 원료물질의 분해물을 그대로, 또는 중화하여 사용할 수 있지만, 더욱 정제하여 사용할 수도 있다. 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물, 그 화합물을 환원 말단에 갖는 가용성의 당 화합물, 예를 들어 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등의 올리고당은, 예를 들어 아포토시스 유발활성 또는 항암 활성을 지표로 하여 정제할 수 있다. 정제수단으로서는 화학적방법, 물리적방법 등의 공지의 정제수단을 이용하면 되고, 겔 여과법, 분자량 분획막에 의한 분획법, 용매추출법, 이온 교환수지 등을 이용한 각종 크로마토그라피법 등의 종래 공지의 정제방법을 조합하여 산 분해물중에 생성시킨 목적의 아포토시스 유발성물질인 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물, 그 화합물의 적어도 1 종을 함유하는 가용성의 당 화합물을 정제할 수 있다.
이렇게 해서 얻어진 화합물의 구조는 질량분석법, 핵자기공명법, 자외흡수 스펙트럼의 측정, 적외흡수 스펙트럼의 측정 등의 공지의 방법으로 해석할 수 있다.
본 발명의 유효 성분의 일례인 아가로비오스는, D-갈락토스의 1위치와 3,6-안히드로-L-갈락토스의 4위치가 β-글리코시드 결합으로 결합한 2당이다. 3,6-안히드로-L-갈락토스의 1위치는 아노머 탄소이기 때문에 α형과 β형이 존재하지만, 모두 본 발명에서 사용하는 아가로비오스에 포함된다.
또한, 본 발명에서 유효 성분으로서 사용하는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부 터 선택되는 화합물을 환원 말단에 갖는 당 화합물이란, 그 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물의 1위치 이외의 수산기에 당이 결합한 것으로서, 아포토시스 유발활성, 항암 활성, 활성 산소 생성억제 활성, NO 생성억제 활성 등의 항산화 활성 및/또는 면역조절 활성을 갖는 것이라면 특별한 한정은 없다. 예를 들어 원료물질의 분해물, 예를 들면 아가로스의 산 분해물이나 α-아가라아제 분해물인 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, 아가로데카오스, β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등을 들 수 있다. 또한, 카라기난의 산 분해물이나 카라기나제 분해물, 예를 들어 카라비오스를 들 수 있다.
또한, 글루코오스, 만노오스, 갈락토오스 등의 헥소오스, 크실로오스, 아라비노오스, 리보오스 등의 펜토오스, 글루쿠론산, 갈락투론산, 만누론산, 글루론산 등의 우론산, 글루코사민, 갈락토사민 등의 아미노당, N-아세틸뉴라민산 등의 시알산, 푸코스 등의 데옥시당, 이것들의 에스테르, 아미드 및 락톤으로부터 선택되는 1개 또는 복수개의 당이 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물의 1위치 이외의 수산기에 결합한 것도 본 발명의 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물을 환원 말단에 함유하는 당 화합물에 포함된다. 또한, 이것들의 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물을 환원 말단에 갖는 당 화합물, 예를 들어 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등의 당 화합물에 피루빈산 및/또는 황산기를 결합한 것, 또한 그 당 화합물의 수산기가 메틸화된 것도 본 발명의 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물을 환원 말단에 갖는 당 화합물에 포함된다. 또 상기와 같이 본 발명에 있어서 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물을 환원 말단에 갖는 당 화합물이란 적합하게는 그 비환원 말단이 L-갈락토스-6-황산 이외의 당이다.
3,6-안히드로갈락토피라노스 또는 그 2-O-메틸화체를 환원 말단에 갖는 당 화합물의 환원 말단의 화합물의 1위치는 아노머 탄소이기 때문에 그 화합물을 환원 말단에 갖는 당 화합물에는 α형과 β형이 존재하지만, 모두 3,6-안히드로갈락토피라노스 또는 그 2-O-메틸화체를 환원 말단에 갖는 당 화합물로서 본 발명에서 사용할 수 있다.
또한, 아포토시스 유발활성, 항암 활성, 활성 산소 생성억제 활성, NO 생성억제 활성 등의 항산화활성 및/또는 면역조절 활성 등의 생리활성을 가지고 있으면, 분자량에는 특별한 한정은 없다.
본 발명에서 사용하는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물, 그 화합물을 환원 말단에 갖는 당 화합물의 환원 말단의 화합물로서는, 당연히 α형, β형, 알데히드형, 포수형의 혼합물 및 D-형, L-형의 혼합물 등도 사용할 수 있다.
이리 하여, 본 발명에서 사용하는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물, 그 화합물을 환원 말단에 갖는 당 화합물은 아포토시스 유발활성, 항암 활성, 활성 산소 생성억제 활성, 과산화지질 라디칼 생성억제 활성, NO 생성억제 활성 등의 항산화 활성, 면역조절 활성, 항알레르기 활성을 갖고, 본 발명에 의하면, 우선 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단 에 갖는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 유효 성분으로 하여 함유한다, 이것들의 화합물의 적어도 1종에 감수성을 나타내는 질환의 치료용 또는 예방용의 의약조성물, 예를 들어 그것들 질환의 치료제 또는 예방제가 제공된다.
이것들의 화합물에 감수성을 나타내는 질환으로서는, 예를 들어 아포토시스 유발을 요하는 질환, 암성질환, 활성 산소 생성억제를 요하는 질환, 과산화지질 라디칼 생성억제를 요하는 질환, NO 생성억제를 요하는 질환, 또는 면역조절을 요하는 질환, 예를 들어 알레르기성 질환 등이 포함되고, 본 발명의 치료용 또는 예방용 의약조성물은, 아포토시스 유발제, 항암제, 활성 산소 생성 억제제, 과산화지질 라디칼 생성 억제제, 일산화질소 생성 억제제 등의 항산화제, 항염증제, 면역조절제, 항알레르기제 등으로 할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 아포토시스 유발제는 자기면역 질환 환자의 자기 반응성 림프구, 암세포, 바이러스 감염세포 등을 배제하는 데 유효하고, 아포토시스를 원하는 조직, 세포로 발현시킴으로써, 불필요 또는 유해한 세포를 자연의 형태로 생체로부터 배제할 수 있다. 본 발명의 아포토시스 유발제가 유효한 질환으로서는, 예를 들어 홍반성루푸스, 면역매개성 사구체 신장염, 다발성 경화증, 교원병 등의 자기면역 질환, 류마티즘 등을 들 수 있다.
본 발명의 아포토시스 유발제는, 아포토시스 유발방법에 사용할 수 있고, 그 방법은 아포토시스 유발기구의 해명, 아포토시스 유발제, 아포토시스 유발저해제의 스크리닝 등에 유용하다.
또, 본 발명의 아포토시스 유발제에 의한 아포토시스 유발작용은, 카스파아제(caspase)의 저해제, 예를 들어 IL-1β 전환 효소 억제제 V [Z-Val-Ala-DL-Asp(OMe)-플루오로메틸케톤: 타카라주조사 제조]에 의해 저해되기 때문에, 카스파아제에 의존하는 아포토시스에 의한 세포사라고 생각되어진다.
이 카스파아제는, 각종 세포사시에 선행하여 상승하는 것, 그 과잉발현에 의해 세포사가 유도되는 것, 펩티드 저해제나 저해단백질인 CrmA, p35에 의해 아포토시스가 억제되는 것, 카스파아제-1, 카스파아제-3의 녹아웃 마우스에서는 정상적으로 보이는 아포토시스의 일부가 억제되는 것으로부터, 아포토시스가 중요한 매개인자로서 기능하고 있는 것이 분명히 되어 있다 [참조: 생화학, 제70권, 제14∼21페이지(1998)]. 즉, 아포토시스의 과정에서는 시스테인 프로테아제인 카스파아제가 활성화되고, 핵이나 세포질의 단백질을 분해한다. 카스파아제는, 우선 전구체로서 합성되고 스플라이싱(splicing)에 의해 활성화형이 된다.
카스파아제의 활성화에 이르는 제어가 세포의 생사를 정한다. 포유류로서는 10 종류 이상의 카스파아제가 존재하고, 상위의 카스파아제가 하위의 카스파아제를 스플라이싱하는 것으로 세포내 단백질 분해활성은 케스케이드 방식으로 증폭된다[세포공학, 제17권, 제875∼880페이지(1998)]」.
반대로, 시스테인 프로테아제인 카스파아제의 저해제로 그 스플라이싱 활성을 저해하면, 카스파아제 의존형의 아포토시스에 의한 세포사를 멈출 수 있다.
또한, 본 발명에 사용하는 화합물은 산화물질, 예를 들어 활성 산소의 생성억제에 유용하고, 그 화합물을 유효 성분으로 하는 활성 산소 생성 억제제 등의 항 산화제는 활성 산소의 생성 및/또는 과잉이 기인이 되는 질병의 치료 또는 예방에 유용하다.
활성 산소는 크게 라디칼과 비라디칼의 활성 산소로 분류할 수 있다. 라디칼계 활성 산소에는, 히드록시 라디칼, 히드록시페르옥시 라디칼, 페르옥시 라디칼, 알콕시 라디칼, 이산화질소(NO2), NO, 티일(thyl) 라디칼, 슈퍼옥시드가 있다. 한편, 비라디칼계 활성 산소에는, 일중선 산소(singlet oxygen), 과산화 수소, 지질히드로페르옥시드, 차아염소산, 오존, 페르옥시아초산이 있다. 모두 많은 병태, 즉, 각종 염증성 질환, 당뇨병, 암, 동맥경화, 신경질환, 허혈재관류 장애 등과 관계가 있다.
생체 내에서는 끊임없이 몇개의 경로로 저농도의 활성 산소가 생성하고 있다. 이것은 생리적으로 미토콘드리아 등의 전자전달계에서 누출하는 슈퍼옥시드나, 과산화 수소, 동이나 철 등의 천이금속이 촉매하는 것에 의한 히드록시 라디칼, 호중구나 단구 등에 의해서 생성되는 감염방어를 위한 차아염소산, 알기닌의 분해에 의해 생성하는 NO 등, 모두 피할 수 없는 것이다. 이것들의 활성 산소 생성에 대해서 생체는 활성 산소 소거계로서의 효소, 저분자 화합물을 갖고, 생성과 소거의 균형을 유지하고 있다. 그러나, 이것들의 경로가 어떠한 원인으로 활성화되거나, 반대로 소거계가 불활성화되어 활성 산소 생성계가 소거계에 대해서 우위에 선 경우, 생체는 산화적 장애를 받게 된다. 이러한 상태를 산화 스트레스라고 한다. 또한, 생체내의 균형이 어긋난 경우뿐만 아니라, 대기나 식품 등의 생체외의 것으로부터 도, 생체는 항상 산화 스트레스에 처해 있고, 일상생활을 보내는 데에 있어서 산화 스트레스는 피할 수 없다.
즉, 산화 스트레스는 상기한 바와 같이, 각종 질환과 관계가 있고, 생체는 항상 산화 스트레스에 의한 질환, 또는 질병의 악화로 이어지는 상황에 놓여져 있다. 따라서, 이러한 산화 스트레스가 야기하는 질병의 예방, 치료 또는 악화방지에도 본 발명의 항산화제, 예를 들어 활성 산소 생성 억제제는 유용하다.
또한, 산화 스트레스에 반드시 따라다니는 것이 지질과산화 반응이고, 이 반응은 과산화지질 라디칼이 가능하다면 일거에 진행하는 반응이다. 거기서 생성되는 4-히드록시-2-노네날(HNE)은 글루타티온이나 단백질을 특이적인 표적으로 하는 독성 알데히드이다. 그 HNE와 단백질과의 반응생성물이 각종 병태조직에 있어서 검출되어 있고, 산화 스트레스가 관계하는 질환병태의 유발인자가 아닌가 생각되고 있다. 그 때문에 과산화지질 라디칼의 생성을 억제할 수 있는 본 발명에 사용되는 항산화물질을 함유하는 항산화제는 산화 스트레스에 의한 생활습관병 질환의 예방 및 치료에 유용하다.
NO는 내피세포유래 혈관평활근 이완인자(EDRF)의 본체이다[참조: Nature, 제327권, 제524∼526페이지(1987)]. 본 발명에 의해서 NO 생성의 억제를 필요로 하는 질병치료제 또는 예방제가 제공된다.
본 발명에 있어서, NO 생성의 억제를 필요로 하는 질병이란, 특별히 한정하는 것이 아니지만, 예를 들어 독성 쇼크나 어느 종류의 사이토카인에 의한 치료 등에 의한 전신성 혈압저하, 혈압응답 저하, 자기면역 질환, 염증, 관절염, 류마티스 성 관절염, 당뇨병, 염증성 장질환, 혈관기능부전, 병인성 혈관확장, 조직손상, 심장혈관계 허혈, 통감 과민증, 뇌허혈, 혈관신생을 수반하는 질병, 암 등이 있고, 일본국 특허 공개 평 9-504524호, 특허공개 평 9-505288호, 특허공개 8-501069호, 특허공개 8-512318호, 특허공개 평 6-508849호의 각 공보에 기재된 질병을 포함하는 것이다.
L- 아르기닌과 산소로부터 L-시트룰린과 NO를 생산하는 NO 합성효소(NOS)에는 항상 발현하고 있는 cNOS와 유도형의 iNOS가 있다. 마크로파지 등에 있어서, iNOS는 세포독소나 사이토카인(LPS, INF-γ 등)의 자극에 의해 유도되어 NO를 생산한다. iNOS 자체는 생체계의 유지에 있어서 없어서는 안돼는 존재이다. 그러나, 한편으로 여러 요인에 의해 필요 이상으로 과잉발현하여 지나친 NO를 생성함으로써, 각종 질병을 야기하는 것도 분명하게 되어 있다.
본 발명자들은 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 갖는 가용성의 당 화합물, 예를 들어 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스가 이 iNOS의 발현을 억제하는 것을 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의해 단백질 수준에서, RT-PCR에 의해 전령 RNA 수준에서 확인하였다. 요컨대, 본 발명에서 사용하는 화합물은 여러 요인에 의해 지나치게 발현하여 지나친 NO를 생산하는 iNOS의 발현을 억제함으로써, NO 생성억제를 필요로 하는 질병의 치료 및 예방에 유효하다.
본 발명의 화합물은 마크로파지의 NO 생성을 억제하여 마크로파지의 NO 생성에 기인하는 질병, 염증, 암 등의 치료, 예방에 유용하다. 또한, 본 발명에 사용하 는 당 화합물의 NO 생성억제는 NO 생성 유기물질인 LPS나, INF-γ에 대한 길항저해가 아니다. 본 발명에 사용하는 당 화합물을 미리 가하여 둠으로써, NO 생성 억제효과의 증강이 보이고, 본 발명의 화합물은 항산화물질의 생성억제의 예방제로서 매우 유용하다.
본 발명의 NO 생성 억제제는 NO 생성기구 연구, NO 작용기작 연구에 유용하고, 또한 NO 생성기구에 관여하는 물질의 스크리닝에 사용할 수도 있다.
고형암의 증대에 혈관신생은 필수적이지만, 혈관내피 증식인자/혈관투과성 항진인자(VEGF)는 이 과정에 중요한 역할을 행하고 있다. 각종 암세포에 있어서 VEGF가 NO에 의해서 유도된다. 본 발명의 NO 생성 억제제는 NO 생성을 억제함으로써 암세포의 VEGF 생성도 억제하며, 그 결과, 암조직 주변에서의 혈관신생이 저해된다. 암세포를 피하에 이식하여 고형종양을 형성시킨 마우스에게 본 발명의 NO 생성 억제제를 투여하면 암조직의 주변의 혈관의 형성이 불충분해져서 암은 탈락한다.
니트로소아민은 2급아민에 니트로소기가 부가한 일군의 화합물로 수백 종류가 알려져 있고, 그 대부분이 DNA에 손상을 가함으로써 동물에 대하여 발암성을 나타낸다. 니트로소아민은 인간의 발암에도 깊게 관여하는 것으로 여겨지며, 통상, 위의 안에서 아초산염과 아민이 반응함으로써 생성된다. NO는 pH 중성의 생리적 조건하에서도 아민와 반응하여 니트로소아민을 생성한다. 또한, 역학적으로 암과의 관계가 높은 간흡충 감염환자나 간경변환자에 있어서 NO 생성은 항진하고 있다. 따라서, 본 발명의 NO 생성 억제제를 투여하여 NO 생성의 항진을 방지함으로써 특히 고위험성 그룹의 발암을 예방할 수 있다. 이상과 같이, 본 발명의 NO 생성 억제제는 발암의 억제와 암조직에 있어서의 혈관신생 저해라는 2단계에서 항암작용을 나타낸다.
NO는 또, 염증성 병변에 특징적으로 확인되는 부종, 즉, 혈관투과성 항진작용을 유발하고[참조: 마에다(Maeda) 등, Japanese Journal of Cancer Research, 제85권, 제331∼334페이지(1994)], 또한, 염증성 메디에이터인 프로스타글란딘류의 생합성을 항진시킨다[참조: 살베미니(Salvemini) 등, Proceedings of National Academy of Sciences, USA, 제90권, 제7240∼7244페이지(1993)]. 한편, NO는 슈퍼옥시드 라디칼과 신속하게 반응하여 페르옥시아초산 이온을 발생시키고, 페르옥시아초산 이온의 염증성의 세포, 조직장애를 야기시킨다고도 생각되고 있다.
활성화된 면역세포가 장기에 들어가 사이토카인을 방출하면 NO의 생성이 유도된다. 인슐린의존형 당뇨병은 아일리트(islet) β세포가 특이적으로 파괴됨으로써 야기되는 질환이고, NO에 의한 파괴라고 되어 있다. 또한, 만성관절성 류마티스, 변형성 관절류마티스, 통풍성 관절염, 베체트 병에 따른 관절염 환자의 병변부 관절액에는 같은 환자가 정상인 관절이나 건강한 사람의 관절의 관절액에 비해 고농도의 NO가 포함되어 있다. 이들의 환자에게 본 발명의 NO 생성 억제제를 투여하면 병변부에 있어서의 NO 생성을 억제하여 증상이 개선된다.
뇌허혈중 및 재관류후에는 NO 생성이 증대하고, 그에 따라 뇌조직이 손상을 받는다. 뇌허혈시에 환자에게 본 발명의 NO 생성 억제제를 투여함으로써 뇌조직의 손상이 경감되어 예후가 개선된다.
본 발명의 면역조절제는 림프구 유약화반응 억제작용, 혼합 림프구 반응억제 등의 면역조절작용을 갖고, 본 발명의 면역조절제는 이것들의 면역계, 면역인자의 이상이 기인이 되는 질병의 치료제 또는 예방제로서 유용하다.
여기에, 림프구 유약화 반응이란, 마이토겐이 림프구 표면의 수용체에 결합하여 림프구를 활성화시키고, 그 분열, 증식을 재촉하는 반응이다. 혼합 림프구반응이란, 동종이계의 동물로부터 얻어진 림프구를 혼합 배양함으로써, 주요조직 적합항원의 불일치에 의한 림프구의 활성화가 유도되어 림프구의 분열, 증식이 촉진되는 반응이다. 본 발명의 면역 조절제는 이들의 반응을 억제하여 림프구의 이상항진이 기인이 되는 자기면역성 질환, 예를 들어 만성 신장염, 궤양성 대장염, I형 당뇨병, 만성 관절류마티스 등의 만성의 질환의 치료 또는 예방에 특히 유용하고, 또한 이식편 거절반응의 억제에 있어서도 유용하다.
IgE 항체로 감작된 매스트(mast) 세포는 항원의 결합에 의해 탈과립이 유도되어 케미컬 메디에이터가 방출된다. 이 I형, 즉, 즉시형 알레르기반응은 천식이나 아토피성 피부염으로 대표되는 알레르기 질환에 있어서 큰 역할을 하여 매스트 세포로부터의 케미컬 메디에이터의 방출을 억제하는 물질은 이들의 알레르기 질환의 치료 및 예방에 매우 유효하다고 생각되어진다.
I 형 알레르기 반응의 모델인 래트 수동피부 아나필락시 반응(PCA)은 매스트 세포의 탈과립에 시작되고, 다음에 과립중에 포함되는 히스타민, 세로토닌 등의 케미컬 메디에이터가 방출되어 혈관 투과성의 항진을 야기하여 최후에는, 피부국소에 색소누출을 발생케하는 반응이다. 본 모델은 현재 in vivo의 항알레르기제의 평가 모델로서 가장 많이 이용되고 있다.
화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 갖는 가용성의 당 화합물은, PCA 억제작용을 갖고, 본 발명에 의하면 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 갖는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 유효 성분으로 하는 항알레르기제도 제공된다.
이 항알레르기제는 I 형 알레르기 반응억제에 의해서 치료할 수 있는 질환, 예를 들어 기관지천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 화분증, 담마진(hives), 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염 등의 치료, 예방에 있어서 매우 유용하다.
상기한 본 발명의 치료용 또는 예방용 의약 조성물, 예를 들어 아포토시스 유발제는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 갖는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1 종의 화합물을 유효 성분으로 하고, 이것을 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화함으로써 제조할 수 있다.
일반적으로는, 이들의 화합물을 약학적으로 허용할 수 있는 액상 또는 고체상의 담체와 배합하여, 또한 필요에 따라서 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등을 가하여 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상액제, 현탁제, 유제 등의 액제로 할 수 있다. 또한 이것을 사용전에 적당한 담체의 첨가에 의해서 액상으로 만들 수 있는 건조품으로 할 수 있다.
본 발명의 아포토시스 유발제는 경구제나, 주사제, 점적용제 등의 비경구제중의 어느 것에 의해서도 투여할 수 있다.
의약용 담체는, 상기 투여형태 및 제형에 따라서 선택할 수 있고, 경구제의 경우는, 예를 들어 전분, 유당, 백당, 만니트, 카르복시메틸셀룰로스, 콘스타치, 무기염 등이 이용된다. 또한, 경구제의 조제에 있어서는 추가로 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤택제, 유동성 촉진제, 교미제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다.
한편, 비경구제의 경우는, 상법에 따라서 본 발명의 유효 성분인 아포토시스 유발성을 갖는 당 화합물을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 내지 현탁하여 필요에 따라 살균제, 안정제, 등장화제, 무통화제 등을 가함으로써 조제된다.
본 발명의 아포토시스 유발제는, 제제 형태에 따른 적당한 투여경로로 투여된다. 투여방법도 특별한 한정은 없고, 내용, 외용 및 주사에 의할 수 있다. 주사제는, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 가죽내 등에 투여할 수 있고, 외용제에는 좌제 등도 포함된다.
본 발명의 아포토시스 유발제의 투여량은, 그 제제 형태, 투여방법, 사용목적 및 이것에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 의해서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는, 제제중에 함유되는 유효 성분의 양이 성인 1일당, 10 ㎍ ∼ 200 ㎎/㎏이다. 물론, 투여량은 여러 조건에 의해서 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다. 본 발명의 약제는 그대로 경구투여 하는 외에, 임의의 음식품에 첨가하여 일상적으로 섭취시킬 수도 있다.
본 발명의 항암제는, 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 갖는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1 종의 화합물을 유효 성분으로 하고, 이것을 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화하면 제조할 수 있다. 항암제의 제조는 상기 아포토시스 유발제의 제조방법에 준하여 행할 수 있다.
항암제로서는, 제제 형태에 따른 적당한 투여경로로 투여된다. 투여방법도 특별한 한정은 없고, 내용, 외용 및 주사에 의할 수 있다. 주사제는, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 가죽내 등에 투여할 수 있고, 외용제에는 좌제 등도 포함된다.
항암제로서의 투여량은, 그 제제 형태, 투여방법, 사용목적 및 이것에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는, 제제중에 함유되는 유효 성분의 양이 성인 1일당, 10 ㎍ ∼ 200 ㎎/㎏이다. 물론, 투여량은 여러 조건에 따라서 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다. 본 발명의 약제는 그대로 경구투여하는 외에, 임의의 음식품에 첨가하여 일상적으로 섭취시킬 수도 있다.
또한, 본 발명의 항산화제, 활성 산소 생성 억제제, 과산화지질 라디칼 생성 억제제, NO 생성 억제제, 면역 조절제, 항알레르기제는 상기 아포토시스 유발제에 준하여 제조할 수 있고, 용량, 용법은 상기 아포토시스 유발제에 준하여 사용하면 된다.
즉, 항산화제, 활성 산소 생성 억제제, 과산화지질 라디칼 생성 억제제, NO 생성 억제제, 면역 조절제 또는 항알레르기제로서는, 제제 형태에 따른 적당한 투여경로로 투여된다. 투여방법도 특별한 한정은 없고, 내용, 외용 및 주사에 의할 수 있다. 주사제는, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 가죽내 등에 투여할 수 있고, 외용제에는 좌제 등도 포함된다.
항산화제, 활성 산소 생성 억제제, 과산화지질 라디칼 생성 억제제, NO 생성 억제제, 면역 조절제 또는 항알레르기제로서의 투여량은, 그 제제 형태, 투여방법, 사용목적 및 이것에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제중에 함유되는 유효 성분의 양이 성인 1일당, 10 ㎍ ∼ 200 ㎎/㎏이다. 물론, 투여량은 여러 조건에 의해서 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다. 본 발명의 약제는 그대로 경구투여하는 외에, 임의의 음식품에 첨가하여 일상적으로 섭취시킬 수도 있다.
다음에, 본 발명의 음식품은 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물, 예를 들어 원료물질의 pH 7 미만의 산성하에서의 산 분해물 및/또는 효소 분 해물로부터 생성한다, 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 함유, 첨가 및/또는 희석하여 이루어지는 식품 또는 음료이다, 그 아포토시스 유발작용, 항암작용, 항산화작용, 면역 조절작용 등에 의해, 화학식 l∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물의 적어도 1 종에 감수성을 나타내는 질환, 예를 들어 아포토시스 유발을 요하는 질환, 암성 질환, 활성 산소 생성억제를 요하는 질환, NO 생성 억제를 요하는 질환, 면역조절을 요하는 질환, 알레르기성 질환 등의 증상개선, 예방에 매우 유용하다.
본 발명의 식품 또는 음료의 제조방법은, 특별한 한정은 없지만, 조리, 가공 및 일반적으로 쓰이고 있는 식품 또는 음료의 제조방법을 채용할 수 있고, 제조된 식품 또는 음료에 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1 종의 화합물, 예를 들어 원료물질의 pH 7미만의 산성하에서의 산분해 및/또는 효소분해에 의해 생성된다, 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물이 유효 성분으로서 함유되어 있으면 된다.
본 발명의 음식품은, 특별히 한정하는 것이 아니지만, 예를 들어 곡물 가공품(예, 밀가루 가공품, 전분류 가공품, 프레픽스 가공품, 면류, 마카로니류, 빵류, 팥소류, 메밀류, 밀기울(wheat gluten bread), 라이스 누들(rice noodle), 잡채, 포장떡 등), 유지 가공품(예, 가소성 유지, 튀김유, 샐러드유, 마요네즈유류, 드레싱 등), 대두 가공품(예, 두부류, 된장, 발효콩 등), 식육 가공품(예, 햄, 베이컨, 프레스햄, 소시지 등), 수산 제품(예, 냉동 생선묵, 어묵, 대롱모양 어묵, 생선 굳힌 식품, 어육야채튀김, 어육볼(ball), 피골어육, 어육햄, 소시지, 가다랭이포, 어란가공품, 수산통조림, 생선조림 등), 유제품(예, 원료유, 크림, 요구르트, 버터, 치즈, 연유, 분유, 아이스크림 등), 야채·과실 가공품(예, 밀가루반죽류, 잼류, 야채절임류, 과실음료, 야채음료, 믹스음료 등), 과자류(예, 초콜릿, 비스킷류, 과자빵류, 케이크, 병과자, 미과류 등), 알코올 음료(예, 정종, 중국술, 와인, 위스키, 소주, 보드카, 브랜디, 진, 럼주, 맥주, 청량 알코올 음료, 과실주, 리큐르 등), 기호음료(예, 녹차, 홍차, 우롱차, 커피, 청량음료, 락트산음료 등), 조미료(예, 간장, 소스, 식초, 미린 등), 통조림·병조림·대조림 식품(예, 소고기덮밥, 솥밥, 팥찰밥, 카레, 그 밖의 각종 조리완료 식품), 반건조 또는 농축식품(예, 리버 페이스트(liver paste), 그 밖의 스프레드(spread), 메밀·우동의 스프, 농축스프류), 건조식품(예, 즉석국수류, 즉석카레, 인스턴트 커피, 분말 쥬스, 분말스프, 즉석된장국, 조리완료 식품, 조리완료 음료, 조리완료 스프 등), 냉동식품(예, 전골, 찜요리, 장어구이, 햄버그 스테이크, 중국 찐만두, 만두, 각종 스틱(stick), 후르츠 칵테일 등), 고형식품, 액체식품(예, 스프 등), 향신료류 등의 농산·임산가공품, 축산가공품, 수산가공품 등을 들 수 있다.
본 발명의 음식품에는, 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물, 예를 들어 원료물질의 pH 7 미만의 산성하에서의 산분해 및/또는 효소분해에 의해 생성된다, 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등의 당 화합물로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 화합물이 함유, 첨가 및/또는 희석되어 있고, 그 생리기능을 발현하기 위한 필요량이 함유되어 있으면, 특히 그 형상에 한정은 없고, 정제상, 과립상, 캡슐상 등의 형상의 경구적으로 섭취가능한 형상물도 포함한다.
3,6-안히드로갈락토피라노스 또는 그 2-O-메틸화체 및 그 화합물을 환원 말단에 갖는 당 화합물은, 헤미아세탈환이 개환하기 쉽고, 말단에 알데히드가 생기기 쉽다. 이 알데히드 및 3,6-안히드로갈락토피라노스의 알데히드체의 알데히드는 알데히드에 반응성을 갖는 화합물, 예를 들어 아미노산 등과 같은 구핵성 물질(nucleophiles)과 반응하기 쉽고, 반응한 화학식 (1)∼(6)의 화합물 또는 당 화합물, 예를 들어 올리고당은, 환원 말단의 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물을 없앤 상태가 된다. 그 때문에 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그것들의 화합물을 환원 말단에 지닌 올리고당이 갖는 여러 생리활성을 잃어버린다. 즉, 음료 또는 식품속에서 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그것들의 화합물을 환원 말단에 갖는 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물을 안정적으로 유지하기 위해서는, 이것들의 알데히드의 몰농도보다, 이것들의 알데히드에 대해서 반응성을 나타내는 화합물의 몰농도를 낮은 상태로 유지할 필요가 있다.
그래서, 본 발명의 식품 또는 음료의 제조에 있어서는, 종래 제어되어 있지 않았던 이것들의 알데히드에 반응성을 나타내는 화합물량의 제어를 행함으로써, 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말에 갖는 올리고당으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물을 실질적으로 감소시키지 않고, 이것들의 화합물의 고함유 식품 또는 음료를 제공하는 것이 가능해진다.
또한, 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 갖는 당 화합물의 환원 말단에서의 해당 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물은 산성하에 있어 안정적인 것이 발견되고, 본 발명의 식품 또는 음료의 제조방법에 있어서 그 모든 행정을 산성하에서 행하고, 얻어지는 식품 또는 음료를 산성식품 또는 산성음료로 함으로써, 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 갖는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 높게 함유하는 산성식품 또는 산성음료의 제공이 가능해진다.
본 발명의 산성식품 또는 산성음료의 제조에 있어서, 원료물질을 산분해하는 산의 종류에 특별한 한정은 없고, 유기, 무기중의 어느 쪽의 산도 사용할 수 있지만, 얻어지는 한천산 분해물의 풍미는 유기산 분해물 쪽이 바람직하고, 적합하게는 유기산을 사용함으로써, 신규한 풍미의 산성 분해물을 얻을 수 있다. 유기산으로서는, 목적에 따라서 선택하면 되고, 단독 또는 2종 이상을 병용할 수도 좋다. 유기산으로서는, 예를 들어 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 타르타르산, 숙신산, 푸말산 등이 적합하다. 분해조건으로서는 특별히 한정되는 것이 아니지만, 유기산으로서, 예를 들어 시트르산을 사용하는 경우, 원료물질, 예를 들어 한천의 산분해를 60∼130℃, 적합하게는 90∼105℃에서 3∼300분, 적합하게는 30∼200분 행함으로써, 유기산의 산미가 변화하여 맛의 균형이 좋은, 맛이 순한, 부드러운 산미의 조성물이 된다. 유기산량으로서 0.05∼30중량%, 적합하게는 0.2∼10중량%, 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 갖는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물의 함유물량으로서 1∼20중량%, 적합하게는 5∼15중량% 함유량이 되는 가열 처리물이 바람직한 산미의 산미료가 된다. 얻어지는 산미료는 청량음료, 산성조미료, 산성식품 등의 제조에 매우 유용하다.
본 발명의 산성식품 또는 산성음료는, 생리활성을 갖는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물, 예를 들어 원료물질의 pH 7 미만의 산성하에서의 산분해 및/또는 효소분해에 의해 생성되는 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등의 당 화합물을 다량으로 함유하여 이들이 갖는 아포토시스 유발작용, 항암작용 등의 생리기능에 의해서 이들을 섭취함으로써 발암 예방, 암 억제효과 등의 효과를 갖는 식품 또는 음료이다. 즉, 본 발명의 산성식품 또는 산성음료는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되 는 적어도 1종의 화합물에 감수성을 나타내는 질환의 증상 개선작용 또는 예방작용을 나타내는 건강식품 또는 음료이고, 특히 위장 건강유지에 유용한 식품 또는 음료이다.
또한, 본 발명의 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물, 예를 들어 원료물질의 pH 7 미만의 산성하에서의 산분해 및/또는 효소분해에 의해 생성되는 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등의 당 화합물은 활성 산소 생성 억제작용, 과산화지질 라디칼 생성 억제작용 등의 항산화 활성을 갖고, 항산화용 식품용의 항산화제 또는 항산화용 음료용의 항산화제, 예를 들어 활성 산소 생성 억제제, 과산화지질 라디칼 생성 억제제, NO 생성 억제제 등으로서 항산화용 식품 또는 항산화용 음료의 제조에 사용할 수 있다.
즉, 본 발명에 의해 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 항산화제, 특히 음식품용의 항산화제가 제공된다.
본 발명의 항산화제의 제형은 특별히 한정되는 것이 아니고, 첨가대상이 되는 음식품의 종류에 의해 상법에 따라서, 분말상, 페이스트상, 유화물 등의 적절한 제형으로 할 수 있고, 본 발명에 사용하는 화합물 및 당 화합물로부터 선택되는 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 항산화용 음식품은 본 발명의 항산화제를 사용함 으로써 간편하게 제조할 수 있다.
본 발명에 의하면, 또한 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항산화용 당이 제공된다. 예를 들어 그 항산화용 당은 원료물질의 pH 7 미만의 산성하에서의 산 분해물 및/또는 효소 분해물로서 얻을 수 있다. 또한, 그 정제물, 부분 정제물 등을 사용할 수 있다. 원료물질로서는, 예를 들어 홍조류 유래의 원료물질, 예를 들어 한천, 아가로스, 카라기난 등이 단독적으로, 또는 2종 이상을 병용하여 사용할 수 있다. 특별히 한정하는 것이 아니지만, 대표적인 항산화용 당으로서, 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물, 예를 들어 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토비라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등의 항산화용 당이 예시된다.
본 발명의 항산화용 당은 생체내의 산화물질, 예를 들어 활성 산소의 제거나 생성억제에 유용하고, 그 항산화용 당은 활성 산소의 생성이나 과잉이 기인이 되는 질병의 증상개선 또는 예방에 유용하다.
상기한 바와 같이, 생체내에서 활성 산소 생성계가 소거계에 대해서 우위에 선 경우, 생체는 산화적 장애를 받음으로써 발생되는 산화 스트레스는 각종 질환과 관련되고, 생체는 항상 산화 스트레스에 의한 질환, 또는 질병의 악화로 이어지는 상황에 처해 있다. 따라서, 이러한 산화 스트레스가 야기하는 질병의 예방, 치료 또는 악화방지에는 매일, 적당한 항산화물질을 섭취하는 것이 바람직하다. 매일 적 당량을 섭취하기 위해서는 음식품으로 섭취하는 것이 바람직하고, 본 발명의 항산화용 당을 함유, 희석 및/또는 첨가하여 이루어지는 음식품은 항산화용 식품 또는 항산화용 음료로서, 또한 항산화 스트레스 식품 또는 항산화 스트레스 음료로서 매우 유용하다.
본 발명에 사용하는 화합물 및 당 화합물로부터 선택되는 화합물은 보수성도 겸비하여 이것들의 적어도 1 종의 화합물을 유효 성분으로 하여 항변비제, 항변비용 식품, 항변비용 음료를 제조할 수 있다.
본 발명에 의하면, 또한 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물을 환원 말단에 함유하는 가용성의 당 화합물, 예를 들어 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등의 올리고당을 유효 성분으로 하는 화장료가 제공된다. 그 당 화합물은, 예를 들어 원료물질의 pH 7 미만의 산성하에서의 산 분해물 및/또는 효소 분해물로서 얻을 수 있다. 또한 그 정제물, 부분 정제물을 사용할 수도 있다. 원료물질로서는, 예를 들어 홍조류 유래의 원료물질, 예를 들어 한천, 아가로스, 카라기난 등을 단독으로, 또는 2 종 이상을 병용하여 사용할 수 있다.
화장료로서는, 상기 화합물을 유효 성분으로 하여 크림, 유액, 로션, 세안료, 팩 등의 기초 화장료, 립스틱, 파운데이션 등의 메이크업 화장료, 바디 소프, 비누 등의 형태로 조제할 수 있다. 또한, 두발에 대하여도 유효하여 헤어 토닉, 헤어 리퀴드, 헤어 세트 로션, 헤어 발포제, 헤어 크림, 헤어 코트 등의 헤어 제품이 나 샴푸, 린스, 헤어 트리트먼트 등의 두발용 화장품 등의 헤어 케어 제품의 형태로 할 수 있다. 화장료에의 배합량은 그 미백작용, 보습작용, 항산화작용 등에 따라서 적절히 결정하면 된다. 화장료의 다른 성분은 통상 화장료에 배합되는 것을 사용할 수 있다. 또, 미백작용, 보습작용은 상법으로 측정하면 되고, 예를 들어 일본국 특허공개 평 8-310937호 공보 기재의 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 화장료는 피부에의 미백작용, 보습작용, 항산화작용, 활성 산소 생성 억제작용, 항산화 스트레스작용, 모발에의 보습작용, 항산화작용, 활성 산소 생성 억제작용, 항산화 스트레스작용 등에 의해 우수한 성질을 나타낸다.
또한, 본 발명에 의하면 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물, 예를 들어 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등의 올리고당을 유효 성분으로 하는 선도 유지제가 제공된다. 그 화합물로서는, 예를 들어 원료물질의 pH 7 미만의 산성하에서의 산 분해물 및/또는 효소 분해물로서 얻을 수 있다. 또한, 그 정제물, 부분 정제물을 사용할 수도 있다. 원료물질로서는, 예를 들어 홍조류 유래의 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물을 함유하는 물질, 예를 들어 한천, 아가로스, 카라기난 등을 단독적으로, 또는 2종 이상을 병용하여 사용할 수 있다.
화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1 종의 화합물, 예를 들어 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토비라노실-3,6-안히드로2-O-메틸-L-갈락토스 등의 당 화합물은 항산화작용, 선도 유지작용, 티로시나제 활성 저해작용을 갖고, 이것들을 유효 성분으로 하여 공지의 제제화 방법에 의해 식품의 변색, 부패, 산화 등을 효과적으로 방지하는 식품의 선도 유지제를 제조할 수 있다. 본 발명의 선도 유지제는 여러 식품, 생선식품, 가공식품 등의 맛이나 선도의 유지에 매우 유용하다.
본 발명에 사용하는 화학식 (1)∼(6)의 화합물로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물은, 모두 1 g/㎏의 투여량으로 마우스에게 경구 또는 복강내 투여하더라도 급성 독성은 확인되지 않는다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것들의 실시예에 한정되는 것이 아니다.
실시예 1
(1) 시판의 한천분말(와코쥰야쿠사 제조) 400㎎을 1N의 염산 20㎖에 현탁하고, 전자레인지로 가열 용해시켰다. 용해액을 냉각시켜 수산화 나트륨으로 pH를 4로 하고, 384㎎의 시트르산을 첨가하여 수산화 나트륨으로 pH를 3으로 조정하였다. 이 수용액에 물을 가하여 40㎖로 하고, 120℃에서 4시간 처리하였다. 이 산 분해액 을 수산화 나트륨에 의해 pH 6.5로 하고, 0.2㎛(코닝사 제조)의 필터로 여과하였다.
56℃, 30분간 처리한 소태아혈청(JRH 바이오사이언스사 제조)을 10% 포함하는 RPMI 1640 배지(기브코사 제조)로 37℃에서 배양한 인간 전골수성 백혈병세포 HL-60(ATCC CCL-240)을 같은 배지로 2500개/90㎕이 되도록 현탁하였다. 이 현탁액을 96웰 플레이트(팔콘사 제조)에 90㎕씩 분주하고, 각각의 현탁액에 대해서 상기의 산 분해액, 상기의 산 분해액의 10배 희석물, 및 물을 각각 10㎕씩 첨가하고, 37℃, 5% 탄산 가스 존재하에서 배양하여 배양 개시후 24시간 및 48시간에 광학현미경으로 세포의 형태를 관찰한 후, 「아포토시스 실험 프로토콜」[슈쥰사, 타누마 세이이치 감수, 제156페이지(1994)]에 따른 MTT법에 의해, 5㎎/㎖의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드(시그마사 제조) 인산 완충식염수 용액 10㎕을 가하여 재차 4시간 배양을 계속하고, 0.04N 염산 함유 2-프로판올 100㎕을 가하여 잘 교반하여 590㎚에 있어서의 흡광도를 측정하고, 측정한 흡광도로부터 계산되는 생 세포수를 비교하였다.
이 결과, 상기 산 분해액 및 그 10배 희석액을 첨가한 배지에 있어서는, 물을 첨가한 것에 비해 현저히 생 세포수가 감소하였다. 또한, 사세포에 있어서 아포토시스 소체가 관찰되었다.
(2) 한천분말 400㎎을 1N의 염산 20㎖에 현탁하고 전자레인지로 가열 용해하여 산분해액을 조제하였다. 용해액을 냉각한 후, 50mM의 시트르산 완충액 (pH 3)을 20㎖ 첨가하여 수산화 나트륨으로 pH를 6.5로 하고, 0.2㎛(코닝사 제조)의 필터로 여과하여 산 분해액을 얻었다.
이 산 분해액 및 이 산 분해액을 10배에 희석한 것을 상기 실시예 1-(1)과 같은 방법에 의해 HL-60 세포의 증식 억제활성 및 아포토시스 유발활성을 측정하였다. 그 결과, 이 산 분해액도 실시예 1-(1) 기재의 산 분해액과 거의 동등한 암세포 증식 억제활성 및 아포토시스 유발활성을 나타내었다.
(3) 한천분말 400㎎을 1N의 염산 40㎖에 현탁하여 비등탕 욕상으로 용해하여 용해액을 얻었다. 이 용해액을 8등분하여 비등탕 욕상으로 각각 O, 30, 60, 90, 120, 180, 210분간 유지한 후, 냉각시켜 2N의 수산화 나트륨으로 pH를 6.5로 조정하였다.
각각의 처리액을 실시예 1-(1)과 같은 방법에 의해 HL-60 세포의 증식 억제활성 및 아포토시스 유발활성을 측정하였다. 그 결과, O분 및 30분 처리액에 관해서는 실시예 1-(1) 기재의 산 분해액과 동등한 활성을 나타내었지만, 60분 이상의 처리액은 양활성을 나타내지 않았다.
(4) 30㎖의 1, 0.5, 0.25, 0.13, 0.063, 0.031, 0.016, 0.0078N의 염산에 각각 300㎎의 한천분말을 현탁하고, 비등탕 욕상으로 10분간 유지하여 용해액을 조제하였다. 이 용해액을 냉각시킨 후, 2N의 수산화 나트륨으로 pH를 6.5로 조정하였다.
각각의 처리액을 실시예 1-(1)과 같은 방법에 의해 HL-60 세포의 증식 억제활성 및 아포토시스 유발활성을 측정하였다. 그 결과, 1N(pH 0.05)으로부터 0.063N(pH 1.3)의 염산 처리액에 관해서는 실시예 1-(1) 기재의 산 분해액과 동등 한 활성을 나타내었다. 0.063N 미만의 염산 농도에서는 염산 농도가 저하함에 따라서 활성은 감소하였지만, 0.0078N의 염산 처리액에 있어서도 양활성은 검출되었다.
(5) 40㎖의 1N 염산 및 0.12N 염산에 각각 400㎎의 한천분말을 첨가하고, 비등탕 욕상으로 10분간 유지하여 용해액을 조제하였다. 이 용해액을 2N의 수산화 나트륨으로 pH 6.5로 중화시킨 후, 셀룰로파인 GCL-25를 이용하여 용출액 10% 에탄올 함유의 0.2M NaCl로 겔 여과를 행하였다. 각각의 용출액에 관하여, 실시예 1-(1)과 같은 방법에 의해 HL-60 세포의 증식 억제활성 및 아포토시스 유발활성을 측정하였다. 또 증식 억제활성은 상대 활성으로서 하기와 같이 측정하였다.
각각의 용출액을 첨가하여 3일간 배양한 HL-60 세포에 관해서 실시예 1-(1) 기재의 MTT법에 의해 590㎚의 흡광도를 측정하였다(AbsT).
용출액 대신에 겔 여과용 용출액을 첨가하여 배양한 HL-60 세포에 관해서 실시예 1-(1) 기재의 MTT법에 의해 590㎚의 흡광도를 측정하였다(AbsC).
상대활성 : AbsC-AbsT
도 1에 한천의 0.12N 염산 분해물의 겔 여과의 용출도를 나타낸다. 도면중에서 종축은 페놀 황산법에 의해 측정한 용출액중의 당 함량(흡광도 480㎚: 동그라미 표시)또는 상대활성(검은 동그라미 표시)을 나타내고, 횡축은 분획번호(1분획 12㎖)를 나타낸다.
도 2에 한천의 1N 염산 분해물의 겔 여과의 용출도를 나타낸다. 도면중에 종축은 페놀 황산법에 의해 측정한 용출액중의 당 함량(흡광도 480㎚: 동그라미 표시)또는 상대활성(검은 동그라미 표시)을 나타내고, 횡축은 분획번호(1분획 12㎖) 를 나타낸다.
도 1, 도 2에 나타내는 바와 같이 한천의 산 분해물은 암세포 증식 억제활성을 나타내고, 또한 사세포에는 아포토시스 소체가 관찰되었다.
도 1의 분획번호 51∼64의 용출액, 및 분획번호 65∼84의 용출액을 각각 합하여 아포토시스 유발용 및/또는 항암용의 당 화합물을 조제하였다.
도 2의 분획번호 60∼78의 용출액, 및 분획번호 79∼95의 용출액을 각각 합하여 아포토시스 유발용 및/또는 항암용의 당 화합물을 조제하였다.
실시예 2
(1) 시판의 한천(아가 노블(Agar Noble), 디프코사 제조) 1g을 100㎖의 0.1N 염산에 현탁하여, 비등할 때까지 전자레인지로 가열하여 용해시켰다. 실온까지 냉각시켜 pH 6으로 조정한 후, 코스모나이스 필터(나칼라이 테스크사 제조)로 여과하고, 그 여과액 2㎖을 이하의 역상 HPLC로 분리하였다.
컬럼 :TSK-gel ODS 80Ts (20㎜×250㎜, 토소사 제조)
TSK guard column ODS-80Ts (2O㎜×50㎜, 토소사 제)
이동상 : 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 수용액
유속 : 9㎖/분
검출 : 215㎚에 있어서의 흡광도
각 용출 피크를 분취하여 감압하에 건조시킨 후, 300㎕의 물에 용해시켰다. 각 분획을 여과 멸균하여, 10㎕씩 96웰 마이크로타이터 플레이트에 넣었다. 거기에 5,000개의 HL-60 세포(ATCC CCL-240)를 포함하는 10% 소태아혈청(기브코사 제조) 함유 RPMI 1640 배지(닛스이사 제조) 90㎕을 가하여 5% 탄산 가스 존재하에 37℃에서 48시간 배양하였다. 광학현미경으로 세포의 형태를 관찰한 후, 5㎎/㎖의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드 인산 완충식염수 용액 10㎕을 가하여 재차 4시간 배양을 계속하여 0.04N 염산 함유 2-프로판올 100㎕을 가하고 잘 교반하여 590㎚에 있어서의 흡광도를 측정하고, 이것을 세포 증식도로 하였다.
그 결과, 8.26분의 피크 유래의 분획을 첨가한 구분에 있어서, 아포토시스 소체가 관찰되었고, 대조의 수첨가 구분에 비해 590㎚에 있어서의 흡광도가 낮아 세포증식이 저해되고 있었다.
(2) 실시예 2-(1) 기재의 8.26분의 피크 유래의 분획 100㎕을 이하의 사이즈 배제 HPLC 크로마토그라피로 분리하였다.
컬럼 :TSK-gel α-2500 (7.8㎜×300㎜, 토소사 제조)
TSK guard columnα(6㎜×40㎜, 토소사 제조)
이동상 : 0.01%TFA 수용액
유속 : 0.8㎖/분
검출 : 시차 굴절계
사이즈 배제 HPLC 크로마토그라피에서의 분리도를 도 3에 나타낸다. 즉, 도 3은 한천의 산 분해물의 사이즈 배제 HPLC 크로마토그라피를 나타내는 도면이고, 횡축은 용출 시간(분), 종축은 시차 굴절계의 출력을 나타내다.
분리된 각 피크를 분취하여 감압하에 건조시켰다. 각 분획을 1O㎎/㎖가 되도록 물에 용해시켜 여과 멸균한 후, 상기 실시예 2-(1) 기재의 방법으로 아포토시스 유발활성과 암세포 증식 억제활성을 측정하였다. 그 결과, 용출 시간 8.87분과 9.40분의 피크가 양활성을 갖고 있었다.
용출 시간 8.87분의 물질과 9.40분의 물질을 인산 완충식염수에 용해시키고, 37℃에서 1시간 방치한 후, 같은 사이즈 배제 HPLC로 분석하였다.
그 결과, 모든 시료에서 용출 시간 8.87분과 9.40분의 피크가 보였고, 피크의 면적비가 거의 같았다. 따라서 인산 완충수용액 상태로 용출 시간 8.87분의 물질과 9.40분의 물질은 평형상태에 있는 것이 분명해졌다.
용출 시간 8.87분과 9.40분의 피크 유래의 분획을 합하여 감압하에 건조시켜 아포토시스 유발성 및 항암성 물질을 얻었다.
(3) 실시예 2-(2) 기재의 아포토시스 유발성 및 항암성 물질의 질량분석을 DX302 질량 분석계(닛폰덴시사 제조)를 이용하여 행하였다. 글리세롤을 매트릭스로서 이용하고, 네거티브 이온 모드로 측정하였다.
FAB-MS
m/z 323 [M-H]-
415 [M+글리세롤-H]-
507 [M+2글리세롤-H]-
그 결과를 도 4에 나타낸다. 즉, 도 4는 아포토시스 유발성 및 항암성 물질의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이고, 횡축은 m/z치, 종축은 상대강도(%)를 나타 낸다.
실시예 2-(2)에서 얻은 아포토시스 유발성 및 항암성 물질의 핵자기공명 스펙트럼을 측정하였다. 핵자기공명 장치는 JNM-A500(닛폰덴시사 제조)을 이용하였다.
1H-NMR: δ3.36 (1H, dd, J=8.0, 10.0Hz), 3.51 (1H, dd, J=3.0, 10.0Hz), 3.56(1H, m), 3.58 (1H, m), 3.63 (1H, m), 3.67 (1H, m), 3.70 (1H, dd, J=3.0, 10.OHz), 3.77 (1H, d, J=3.OHz), 3.83 (1H, dd, J=4.5, 1O.0Hz), 3.93 (1H, dd, J=5.0, 3.5Hz), 4.23 (1H, m), 4.25 (1H, m), 4.41 (1H, d, J=8.0Hz), 4.85 (1H, d, J=6.0Hz)
시료는 중수에 용해시키고, HOD의 화학 쉬프트치를 4.65ppm으로서 나타내었다.
13C-NMR: δ61.9, 69.4, 71.5, 73.37, 73.42, 73.8, 76.0, 76.1, 83.7, 86.5, 90.7, 103.3
시료는 중수에 용해시키고, 디옥산의 화학 쉬프트치를 67.4ppm으로서 나타내었다.
도 5에 아포토시스 유발성 및 항암성 물질의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 5에 있어서, 횡축은 화학 쉬프트치(ppm)를, 종축은 시그널의 강도를 나타낸다.
또한, 시료를 중디메틸설폭시드에 용해시키고, 1H-NMR 스펙트럼을 측정하였 다.
1H-NMR: δ9.60 (1H, 알데히드의 H)
도 6에 아포토시스 유발성 및 항암제 물질의 중디메틸설폭시드 용매에서의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 6에 있어서, 횡축은 화학 쉬프트치(ppm)를, 종축은 시그널 강도를 나타낸다.
이것들의 질량분석, 1H-NMR, 13C-NMR의 해석결과로부터, 실시예 2-(2) 기재의 아포토시스 유발성 및 항암성 물질은 아가로비오스로 동정되었다. 또, 아가로비오스의 환원 말단의 3,6-안히드로갈락토스는 비수용매중에서는 주로 개환한 알데히드체로서 존재하고 있는 것이 중디메틸설폭시드 용매에서의 1H-NMR에 의해 나타내어졌다. 또한, 수용액중에서는 알데히드체의 포수체로서 존재하고 있는 것이 중수용매에서의 1H-NMR에 의해 나타내어졌다.
이상의 결과로부터 실시예 2-(2)에서 얻은 아포토시스 유발성 및 항암성 물질은 아가로비오스인 것이 분명하게 되었다.
(4) 실시예 2-(2)에서 얻은 아포토시스 유발성 및 항암성 물질, 즉, 아가로비오스를 0.78㎎/㎖이 되도록 물에 용해시켜 10㎕을 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 넣고, 상기 실시예 2-(1) 기재의 방법으로 아포토시스 유발활성과 암세포 증식억제 활성을 측정하였다. 그 결과, 광학현미경 관찰에 있어서 아포토시스 소체가 보였고, 대조의 수첨가 구분에 비해 아가로비오스 첨가 구분에서는 세포증식이 약 86% 억제되어 있었다. 즉, 아가로비오스는 78㎍/㎖에서 HL-60 세포에 아포토시스를 유발시키고, 세포증식을 억제하였다.
실시예 3
(1) 시판의 한천(Agar Noble) 2.5g을 50㎖의 O.1N HCl에 현탁하고, 100℃에서 13분간 가열하여 용해시켰다. 실온까지 냉각시켜 NaOH로 pH 중성 부근까지 중화시킨 후, 코스모나이스 필터로 여과하여 이하의 순상 HPLC로 분리하였다.
컬럼 :TSK-gel Amide-80 (21.5㎜×300㎜, 토소사 제조)
용매 A : 90% 아세토니트릴 수용액
용매 B : 50% 아세토니트릴 수용액
유속 : 5㎖/분
용출 : 용매 A에서 용매 B로의 직선농도 구배 (80분간)→용매 B(20분간)
검출 : 195nm에 있어서의 흡광도
시료 부하량 : 2㎖
유지시간 66.7분, 78.5분 및 85.5분의 피크를 분취하여 질량분석을 행한 바, 이것들의 물질은 각각, 아가로비오스, 아가로테트라오스 및 아가로헥사오스이었다. 상기의 HPLC에 의한 분리를 8회 되풀이하여 감압하에 건조시켜 122㎎의 아가로비오스, 111㎎의 아가로테트라오스 및 55㎎의 아가로헥사오스를 얻었다.
그 결과를 도 7∼10에 나타낸다. 즉, 도 7은 아가로비오스, 아가로테트라오스 및 아가로헥사오스의 순상 HPLC의 용출 패턴을 나타내는 도면이고, 횡축은 유지시간(분)을, 종축은 195nm에 있어서의 흡광도를 나타낸다. 도 8은 66.7분의 피크의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이고, 횡축은 m/z치를, 종축은 상대강도(%)를 나타낸다. 도 9는 78.5분의 피크의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이고, 횡축은 m/z치를, 종축은 상대강도(%)를 나타낸다. 도 10은 85.5분의 피크의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이고, 횡축은 m/z치를, 종축은 상대강도(%)를 나타낸다.
(2) 실시예 3-(1)에서 얻은 아가로비오스의 100mM 수용액 450㎕에 10배 농도의 인산 완충식염수(타카라슈조사 제조, T900) 50㎕과 10단위/㎕의 β-갈락토시다제(시그마사 제조, G5635) 인산 완충식염수 용액 50㎕를 가하고 혼합하여 37℃에서 1시간 반응시켰다.
이 반응액에 5㎖의 1-부탄올:에탄올=1:1 혼합액을 가한 후, 원심에 의해서 불용물을 제거하였다. 이 액을 컬럼크로마토그라피용 실리카 겔 BW-300SP (3×50㎝, 후지실리시아화학사 제조)에 어플라이하고, 1-부탄올:에탄올:물=5:5:1을 용리액으로 하여 컴프렛서로 0.3㎏/㎠에 가압하여 분리를 행하였다. 1분획당, 7㎖이 되도록 분리를 행하고, 각 분획의 일부를 취해 박층 크로마토그라피로 분석한 바, 14번에서 17번까지의 분획에 고순도의 3,6-안히드로-L-갈락토스가 포함되어 있었다. 이것들의 분획을 모아 감압하에 건조시켜 3.8㎎의 3,6-안히드로-L-갈락토스를 얻었다. 본 물질의 구조는 질량 분석법 및 핵자기공명법에 의해서 확인하였다.
그 결과를 도 11∼13에 나타낸다. 즉, 도 11은 3,6-안히드로-L-갈락토스의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이고, 횡축은 m/z치를, 종축은 상대강도(%)를 나타낸다. 도 12는 3,6-안히드로-L-갈락토스의 중수용매에서의, 또한 도 13은 중디메틸 설폭시드 용매에서의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이고, 횡축은 화학 쉬프트치(ppm)를, 종축은 시그널의 강도를 나타낸다.
3,6-안히드로-L-갈락토스에 있어서도, 중디메틸설폭시드 용매에서의 1H-NMR 스펙트럼이 9.60ppm에 알데히드의 수소의 시그널을 나타냄으로 인해, 비수용매중에서는 개환한 알데히드체로서 존재하고, 또한 중수에서의 1H-NMR 스펙트럼으로부터, 수용액중에서는 그 알데히드체의 포수체로서 존재하고 있는 것이 나타내어졌다.
실시예 4
(1) 실시예 3에서 얻은 3,6-안히드로-L-갈락토스의 20mM 수용액을 멸균수로 2배, 4배 및 8배 희석하고, 실시예 2-(1) 기재의 방법으로 아포토시스 유발활성과 암세포 증식 억제활성을 측정하였다. 그 결과, 3,6-안히드로-L-갈락토스의 2배 희석액 첨가 구분(최종농도 1mM)으로 아포토시스 소체가 관찰되었고, 590㎚에 있어서의 흡광도가 대조의 수첨가 구분의 2분의 1 이하가 되었다.
(2) 실시예 3-(1)에서 얻은 아가로비오스, 아가로테트라오스 및 아가로헥사오스의 50mM 수용액을 여과 멸균하고, 멸균수로 2배, 4배, 8배, 16배, 32배, 64배 및 128배 희석하였다. 실시예 2-(1) 기재의 방법으로 이것들의 희석액의 각종세포에 대한 증식억제활성을 측정하였다. 이용한 세포 및 배지를 표 1, 표 2에 나타낸다.
세포 배지
인간 전골수성 백혈병세포 HL-60 (ATCC CCL 240) 인간 말초 림프구 RPMI 1778 (ATCC CCL 156) 마우스 단핵구 RAW 264.7 (ATCC TIB 71) 인간 위암 세포 MKN45 (리겐진뱅크, RCB1001) 인간 간암 세포 HepG2 (ATCC HB 8065) 인간 결장선암 세포 HT-29 (ATCC HTB38) 인간 결장선암 세포 HCT116 (ATCC CCL-247) 섬유육종 HT-1080 (ATCC CCL-121) 10% 소태아혈청 (기브코사 제조) 함유 RPMI 1640배지 (닛스이사 제조) 상동 1O% 소태아혈청함유 DMEM 배지 (닛스이사 제조) 10% 소태아혈청함유 RPMI 1640배지 1O% 소태아혈청함유 DMEM 배지 10% 소태아혈청함유 McCoy'S 배지(바이오위택커사 제조) 상동 1O% 소태아혈청함유 D-MEN 배지 (바이오위택커사 제조)
세포 배지
글리알 아세포 A-172 (ATCC CRL1620) 인간 유방암 세포 MCF7 (ATCC HTB-22) 인간 유방암 세포 T-47D (ATCC HTB-133) 인간 방광암 세포 T24 (ATCC HTB-4) 인간 자궁경부암 세포 HeLa S3 (ATCC CCL-22) 인간 폐암 세포 A 549 (ATCC CCL-185) 인간 결장선암 세포 WiDr (ATCC CCL-218) 1O% 소태아혈청함유 D-MEN 배지 1O% 소태아혈청함유 DMEM 배지 10% 소태아혈청함유 RPMI 1640 배지 10% 소태아혈청함유 McCOY'S 배지 1O% 소태아혈청함유 DMEM 배지 동상 10% 소태아혈청함유 RPMI 1640 배지

이 결과, 아가로비오스, 아가로테트라오스 및 아가로헥사오스는 이것들의 세포에 대해서 증식 억제활성을 나타내었다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
또, 표 3중의 숫자는 590㎚에 있어서의 흡광도가 수첨가의 대조에 비해 2분의 1 이하가 된 구분에 첨가한 희석액의 희석배율을 나타내고, 1배 희석은 세포 배양액중의 농도 5mM에 상당한다. 다음에 아가로비오스, 아가로테트라오스 및 아가로헥사오스에 있어서, 590nm에 있어서의 흡광도의 변화를 바탕으로 50%의 증식 억제율을 나타내는 농도(IC50)를 산출하여 표 4에 나타낸다.
세포 아가로비오스 아가로테트라오스 아가로헥사오스
HL-60 RPMI 1788 RAW264.7 MKN45 HepG2 HT-29 HCT116 HT-1080 A-172 MCF7 T-47D T24 HeLa S3 A549 WiDr 32 64 16 8 8 8 16 8 16 16 16 8 8 8 8 64 128 32 16 8 16 32 16 16 16 16 8 8 8 8 64 128 32 16 16 32 32 16 16 16 16 8 16 16 16

세포 IC50(μM)
아가로비오스 아가로테트라오스 아가로헥사오스
HL-60 RPMI 1788 RAW264.7 MKN45 HepG2 HT-29 HCT116 HT-1080 A-172 MCF7 T-47D T24 HeLa S3 A549 WiDr 170 44 179 344 652 622 244 317 289 274 210 352 353 570 405 97 28 133 196 413 208 158 216 185 276 183 399 400 494 399 78 22 109 166 430 144 136 185 151 238 158 365 334 279 334

실시예 5
시판의 한천 5g을 50㎖의 0.1N HCl에 현탁하고, 100℃에서 13분간 가열하여 용해시켰다. 실온까지 냉각시킨 후, NaOH로 pH 중성 부근까지 중화시킨 본 가열 처리액 2㎖를 물로 세정한 활성탄소(60-150메쉬, 나칼라이 테스크사 제조, 079-21)를 충전한 컬럼(10×255㎜)에 어플라이하였다. 200㎖의 물로 세정한 후, 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20%, 22.5%, 25%, 27.5%, 30%, 35%, 40%, 45% 및 50% 에탄올 수용액 각각 200㎖로 이 순서로 용출하였다.
각 용출 분획을 감압하에 1O배 농축하여 실리카 겔 시트 6OF254 (머크사 제조)에 스포트하여, 1-부탄올:에탄올:물=5:5:1로 전개한 후, 오르시놀 시약[400㎎의 오르신-수화물(나칼라이 테스크사 제조)를 22.8㎖의 황산에 용해시키고 물을 가하여 200㎖로 한 것]을 분무하여 스포트를 관찰하였다.
그 결과, 5% 및 7.5% 에탄올 수용액 용출 분획에는 아가로비오스, 15% 및 17.5% 에탄올 수용액 용출 분획에는 아가로테트라오스, 22.5% 및 25% 에탄올 수용액 용출 분획에는 아가로헥사오스, 27.5% 및 30% 에탄올 수용액 용출 분획에는 아가로옥타오스가 각각 고순도로 포함되어 있었다.
실시예 6
실시예 5에서 얻은 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스 및 아가로옥타오스(이하, 이것들의 올리고당을 아가로올리고당이라고 칭하는 경우가 있다)를 2.5mM 및 1.25mM이 되도록 물에 용해시키고, 여과 멸균하였다. HL-60 세포를 2.5×105개/4.5㎖가 되도록 10% 소태아혈청 함유 RPMI 1640 배지에 현탁하고, 상기 각 올리고당 수용액 0.5㎖를 첨가하여 5% 탄산 가스 존재하, 37℃에서 24시간 및 48시간 배양하였다. 세포 배양액의 일부를 취해 트리판 블루(trypan blue)를 가하여 현미경으로 생세포수를 측정하였다. 그 결과, 각 구분에 있어서 수첨가 구분(대조)에 비해 생세포수가 감소하여 있었고, 아포토시스 소체가 관찰되었다.
그 결과를 도 14, 도 15에 나타낸다. 즉, 도 14는 최종농도 250μM의 올리고당을 첨가하여 HL-60 세포를 배양하였을 때의 배양시간과 생세포수를 나타내는 도면이고, 도 15는 최종농도 125μM의 올리고당을 첨가하여 HL-60 세포를 배양하였을 때의 배양시간과 생세포수를 나타내는 도면이다. 도 14 및 도 15에 있어서, 횡축은 배양시간(시간)을, 종축은 생세포수(×105/5㎖)를 나타내고, 검은 동그라미 표시(●)는 수첨가(대조)를, 마름모형 표시(◇)는 아가로비오스 첨가를, 동그라미 표시( ○)는 아가로테트라오스 첨가를, 삼각 표시(△)은 아가로헥사오스 첨가를, 사각 표시(□)은 아가로옥타오스 첨가를 나타낸다.
실시예 7
(1) κ-카라기난(시그마사 제, C-1263) 또는 λ-카라기난(와코쥰야쿠사 제조, 038-14252) 0.2g을 20㎖의 0.1N HCl에 현탁하여 95℃에서 10분간 가열하였다. 1N NaOH로 중화시킨 후, 물로 1.5배, 2.25배, 3.38배 및 5.06배 희석하여 실시예 2-(1)의 방법으로 HL-60 세포에 대한 세포증식 저해활성을 측정하였다. 그 결과, κ-카라기난 가열물의 1.5배, 2.25배 및 3.38배 희석액 첨가 구분과 λ-카라기난 가열물의 1.5배 및 2.25배 희석액 첨가 구분에 있어서 590nm에서의 흡광도가 대조의 수첨가 구분의 2분의 1 이하가 되고, 또한 아포토시스 소체가 보였다.
(2) 시판의 한천(아가 노블), 아가로스 L03 (타카라슈조사 제조), 및 시판의 봉한천을 각각 1%이 되도록 0.1N HCl에 현탁하여 100℃에서 15분간 가열하였다. 이 가열액을 냉각시킨 후, 1N NaOH로 중화시킨 후, 물로 2배, 4배, 8배 및 16배 희석하여 실시예 2-(1)의 방법으로 HL-60 세포에 대한 세포증식 억제활성을 측정하였다. 그 결과, 한천 및 아가로스의 산 분해물의 2∼8배 희석액 첨가 구분과 봉한천 산 분해물의 2배, 4배 희석액 첨가 구분에 있어서 590 nm에서의 흡광도가 대조의 수첨가 구분의 2분의 1 이하가 되고, 또한 아포토시스 소체가 보였다.
상기 산 분해물을 각각 순상 HPLC로 분석한 바, 모든 분해물에서 아가로비오스를 비롯한 아가로올리고당이 검출되었다.
실시예 8
(1) 시판의 한천을 이하의 산의 수용액에 1% 농도가 되도록 현탁하였다. 0.5M, 1M 또는 2M 시트르산; 0.1M, 0.5M, 1M 또는 2M 아세트산; 0.1M 또는 0.5M 황산; 0.1M, 0.5M 또는 1M 인산; 0.1M 염산.
이것들의 한천 현탁액을 전자레인지로 용해될 때까지 가열한 후, NaOH로 중화시켜 증류수로 2, 4, 8, 16 또는 32배로 희석하고, 실시예 2-(1) 기재의 방법으로 HL-60세포에 대한 아포토시스 유발활성과 암세포 증식 억제활성을 측정하였다.
이 결과, 상기의 각종 산 가열처리를 행한 한천은 HL-60에 대하여 아포토시스를 유발하였고, 세포증식을 억제하였다. 그 결과를 표 5에 나타낸다. 또, 표 5중의 숫자는 590nm에 있어서의 흡광도가 수첨가의 대조에 비해 2분의 1 이하가 된 희석액의 희석배율을 나타낸다. 또한, 괄호안의 숫자는 한천을 가하지않고 본 실시예에서 사용한 최대농도의 산을 NaOH로 중화시킨 후, 증류수로 희석하여 첨가한 경우의, 590nm에 있어서의 흡광도가 수첨가의 대조에 비해 2분의 1 이하가 된 희석액의 희석배율을 나타낸다.
0.1M 0.5M 1M 2M
시트르산 니트르산 황산 인산 염산 8 8 4 16 4 16 16(2) 8 8 16(2) 16(1) 16(8)

(2) 실시예 8-(1)에서 얻은 한천의 산 가열처리물을 이하의 순상 HPLC로 분석하였다.
컬럼 : PALPAK Type S (4.6×250㎜, 타카라슈조사 제조, CA8300)
용매 A : 90% 아세토니트릴 수용액
용매 B : 50% 아세토니트릴 수용액
유속 : 1㎖/분
용출 : 용매 A (10분간)→용매 A에서 용매 B의 직선농도 구배(40분간)→용매 B (10분간)
검출 : 195㎚에 있어서의 흡광도
컬럼온도 : 40℃
이 결과, 0.5M, 1M, 2M 시트르산, 0.1M, 0.5M, 1M, 2M 아세트산, 0.1M, 0.5M 황산, 0.1M, 0.5M, 1M 인산, 0.1M 염산중에서 가열처리를 행한 시료에 아가로비오스를 비롯한 아가로올리고당이 포함되어 있었다.
그 대표적인 결과를 도 16에 나타낸다. 즉, 도 16은 0.5M 인산중에서 가열처리를 행한 한천의 순상 HPLC의 용출 패턴을 나타내는 도면이고, 횡축은 유지시간(분)을, 종축은 195㎚에 있어서의 흡광도를 나타낸다.
실시예 9
시판의 한천(이나 한천 타이프 S-7, 이나식품공업사 제조) 5g을 20, 50 또는 100mM 시트르산 45㎖에 현탁하여 95℃에서 가열하고, 하기 시간 가열한 후에 일부를 샘플링하였다.
20mM 시트르산 처리물은 310분, 350분, 380분, 440분 및 530분, 50mM 시트르산 처리물은 100분, 120분, 140분, 160분, 180분, 200분, 220분, 240분, 260분, 290분 및 320분, 100mM 시트르산 처리물은 60분, 70분, 80분, 90분, 100분, 120분, 140분, 160분, 180분, 200분, 220분 및 240분.
각 시료의 1O배 희석액 1㎕를 실리카 겔 6O시트 F254 (머크사 제조)에 스포트하여 1-부탄올:에탄올:물=5:5:1로 전개하여 오르시놀 황산법으로 검출하였다.
이 결과, 각 시료에 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스 등의 아가로올리고당이 포함되어 있었다.
20mM 시트르산 처리물은 350분 가열까지 아가로올리고당의 함량이 증가하였고, 그 이후는 거의 일정하게 되었다.
50mM 시트르산 처리물은 200분 가열까지 아가로올리고당의 함량이 증가하였고, 그 이후는 거의 일정하게 되었다.
100mM 시트르산 처리물은 160분 가열까지 아가로올리고당의 함량이 증가하였고, 그 이후는 거의 일정하게 되었다.
고농도의 시트르산으로 처리한 시료일수록 최종적인 아가로올리고당의 함량은 높았다.
실시예 8-(2)과 동일한 순상 HPLC로 각 시료를 분석한 바, 박층 크로마토그라피와 동일한 결과가 얻어졌다. 단지, 100mM 시트르산 처리물에는 50mM 시트르산 처리물보다도 다량의 불순물이 포함되어 있었고, 가열시간과 함께 불순물은 증가하였다.
실시예 10
(1) 실시예 3-(1)에서 조제한 아가로비오스를 0.05mM, 0.1mM, 0.2mM, 0.4mM, 0.6mM, 0.8mM, 1mM이 되도록 용해시켰다. 각 시료 1㎕를 실리카 겔 6O시트 F254에 스포트하여 클로로포름:메탄올:아세트산=7:2:2의 용매로 3회 전개하여 오르시놀 황산법으로 발색시켰다. 발색시킨 시트는 FOTODYNE FOTO/Analyst Archiver Ecripse(센트럴과학무역사 판매)에 의해 화상 데이터로서 받아들이고, 이 화상 데이터를 화상해석 소프트1-D Basic (애드반스트 아메리칸 바이오테크놀로지사 제조)에 의해 화상처리를 행하고, 각 농도의 아가로비오스의 스포트의 강도를 수치화하여 검량선을 제작하였다.
검량선의 그래프를 도 17에 나타낸다. 즉, 도 17은 아가로비오스의 검량선을 나타내는 도면이고, 각 농도의 아가로비오스에 대한 스포트의 강도를 그래프로 하여, 횡축은 아가로비오스의 농도(mM, 종축은 스포트의 강도를 나타낸다. 또한, 도 17중의 계산식은 스포트의 강도(y) 와 아가로비오스의 농도(x)의 관계를 나타낸 것으로, 아가로비오스의 농도가 미지의 시료에 있어서, 스포트의 강도를 얻음으로써 계산식으로부터 아가로비오스의 농도가 산출된다.
또한, 동일하게 하여 실시예 5에서 얻은 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스의 검량선을 작성하였다.
(2) 시판의 한천(아가 노블) 0.2g을 90㎖의 물에 현탁하여 전자레인지로 가열 용해시켜 실온 부근까지 냉각시켰다. 여기에 1M HCl 또는 1M 시트르산을 10㎖ 가하고, 각각 0.2% 한천 0.1M HCl 용액 및 0.2% 한천 0.1M 시트르산 용액을 조제하 였다. 이 용액을 90℃에서 가열하여, 5분, 10분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 21시간의 각 시간에서 샘플링하였다. 각 시료는 실시예 10-(1)에 기재의 방법으로 박층 크로마토그라피를 행하고, 스포트의 강도를 구하여 아가로비오스의 농도를 산출하였다. 또, 각 시료는 아가로비오스의 농도가 0.05mM에서 1mM의 범위에 들어가도록 적절하게 희석하였다.
도 18, 도 19에 0.2% 한천 0.1M HCl 용액 및 0.2% 한천 0.1M 시트르산 용액에 있어서의 가열시간과 아가로비오스의 생성량과의 관계를 나타낸다. 즉, 도 18은 0.2% 한천의 0.1M HCl 용액에 있어서의 가열시간과 아가로비오스의 생성량과의 관계를 나타내는 도면이고, 도 19는 0.2% 한천의 0.1M 시트르산 용액에 있어서의 가열시간과 아가로비오스의 생성량과의 관계를 나타내는 도면이다. 도 18, 도 19에 있어서, 횡축은 가열시간(시간), 종축은 아가로비오스의 농도(mM)를 나타낸다.
도 18에 나타내어지는 바와 같이, 0.2% 한천의 0.1M HCl 용액으로서는, 1시간에서 아가로비오스의 농도는 최고에 달하였고, 그 이후 감소가 확인되었다. 또한, 도 19에 나타내어지는 바와 같이, 0.2% 한천의 0.1M 시트르산 용액에서는, 8시간까지 아가로비오스의 농도는 서서히 증가하였고, 21시간째에서 감소가 확인되었다. 또, 0.2% 한천의 0.1M HCl 용액에 있어서의 5분 가열시료 및 0.2% 한천의 0.1M 시트르산 용액에 있어서의 5, 10, 20분 가열시료에 있어서는 아가로비오스의 농도는 검출한계 이하이었다.
(3) 5, 50, 500mM의 시트르산에 10%가 되도록 아가 노블을 현탁하여, 65, 80, 95℃에서 가열하고, 가열한 후, 30분, 1, 2, 4, 8, 24시간에서 샘플링하여, 아 가로올리고당의 생성량을 실시예 10-(1) 기재의 방법으로 측정하였다.
그 결과, 한천을 5mM 시트르산에 용해시킨 경우는, 80℃에서 약간의 아가로올리고당의 생성이 보였지만, 65℃에서는 아가로올리고당은 거의 생성되지 않았다. 95℃에서는 아가로비오스는 8∼24 시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스도 8∼24 시간에서 높은 값을 나타내었다. 한천을 50mM 시트르산에 용해시킨 경우는, 65℃에서는 아가로올리고당은 거의 생성되지 않았다. 80℃에서는 아가로비오스는 24 시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스는 4∼8 시간에서 높은 값을 나타내었다. 95℃에서는, 아가로비오스는 24 시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스는 4∼8 시간에서 높은 값을 나타내었다. 한천을 500mM 시트르산에 용해시킨 경우는, 65℃에서는 4∼24 시간에서 약간의 아가로올리고당의 생성이 보였다. 80℃에서는 아가로비오스는 2∼24 시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스는 1∼6 시간에서 높은 값을 나타내었다. 아가로옥타오스는 1∼2 시간에서 높은 값을 나타내었다. 95℃에서는, 아가로비오스는 1∼24 시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스는 1∼2 시간에서 높은 값을 나타내었다. 아가로헥사오스, 아가로옥타오스는 30분∼1시간에서 높은 값을 나타내었다.
500mM 시트르산에 의한 가수분해의 예를 도 20 및 도 21에 나타낸다. 즉, 도 20은 500mM 시트르산, 80℃에서의 아가로올리고당 생성을 나타내는 도면이고, 도면중에 종축은 아가로올리고당 생성량(동그라미 표시: 아가로비오스, 삼각 표시: 아가로테트라오스, 사각 표시: 아가로헥사오스, × 표시: 아가로옥타오스), 횡축은 시간을 나타낸다. 또한, 도 21은 500mM 시트르산, 95℃에서의 아가로올리고당 생성을 나타내는 도면이고, 도면중에 종축은 아가로올리고당 생성량(동그라미 표시: 아가로비오스, 삼각 표시: 아가로테트라오스, 사각 표시: 아가로헥사오스, × 표시: 아가로옥타오스), 횡축은 시간을 나타낸다.
(4) 50, 500, 1000mM의 아세트산을 사용하여, 실시예 10-(3)과 동일한 방법으로 아가로올리고당의 생성을 측정하였다.
그 결과, 한천을 50mM 아세트산에 용해시킨 경우는, 80℃에서 약간의 아가로올리고당의 생성이 보였지만, 65℃에서는 아가로올리고당은 거의 생성되지 않았다. 한천을 500mM 아세트산에 용해시킨 경우는, 65℃에서는 아가로올리고당은 거의 생성되지 않았다. 80℃ 및 95℃에서는 약간의 아가로올리고당의 생성이 보였다. 한천을 1000mM 아세트산에 용해시킨 경우는, 65℃에서는 아가로올리고당은 거의 생성되지 않았다. 80℃에서는 아가로비오스는 24시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스는 8시간에서 약간 생성되어 있었다. 95℃에서는, 아가로비오스는 8 시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스도 8 시간에서 높은 값을 나타내었다.
(5) 60, 600, 1200mM의 락트산을 사용하여, 실시예 10-(3)과 동일한 방법으로 아가로올리고당의 생성을 측정하였다.
그 결과, 한천을 60mM 락트산에 용해시킨 경우는, 95℃에서 약간의 아가로올리고당의 생성이 보였지만, 65, 80℃에서는, 아가로올리고당은 거의 생성되지 않았다. 한천을 600mM 락트산에 용해시킨 경우는, 80℃에서는 아가로비오스는 8∼24 시 간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스는 4∼8 시간에서 높은 값을 나타내었다. 아가로옥타오스는 4시간에서 높은 값을 나타내었다. 95℃에서는, 아가로비오스는 4∼8 시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스는 2∼6 시간에서 높은 값을 나타내었다. 한천을 1200mM 락트산에 용해시킨 경우는, 80℃에서는 아가로비오스는 4∼24 시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스는 2∼6 시간에서 높은 값을 나타내었다. 아가로옥타오스는 2 시간에서 높은 값을 나타내었다. 95℃에서는, 아가로비오스는 2∼8 시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스는 1∼2 시간에서 높은 값을 나타내었다.
1200mM 락트산에 의한 가수분해의 예를 도 22 및 도 23에 나타낸다. 즉, 도 22는 1200mM 락트산, 80℃에서의 아가로올리고당 생성을 나타내는 도면이고, 도면중에 종축은 아가로올리고당 생성량(동그라미 표시: 아가로비오스, 삼각 표시: 아가로테트라오스, 사각 표시: 아가로헥사오스, × 표시: 아가로옥타오스), 횡축은 시간을 나타낸다. 또한, 도 23은 1200mM 락트산, 95℃에서의 아가로올리고당 생성을 나타내는 도면이고, 도면중에 종축은 아가로올리고당 생성량(동그라미 표시: 아가로비오스, 삼각 표시: 아가로테트라오스, 사각 표시: 아가로헥사오스, × 표시: 아가로옥타오스), 횡축은 시간을 나타낸다.
(6) 20, 200, 1000mM의 말산을 사용하여, 실시예 10-(3)과 동일한 방법으로 아가로올리고당의 생성을 측정하였다.
그 결과, 한천을 20mM 말산에 용해시킨 경우는, 95℃에서 약간의 아가로올리 고당의 생성이 보였지만, 65, 80℃에서는, 아가로올리고당은 거의 생성되지 않았다. 한천을 200mM 말산에 용해시킨 경우는, 65℃에서는 24 시간에서 약간의 아가로올리고당의 생성이 보였다. 80℃에서는 아가로비오스는 8∼24 시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스는 4∼8 시간에서 높은 값을 나타내었다. 아가로헥사오스는 4시간에서 높은 값을 나타내었다. 아가로옥타오스는 4 시간에서 높은 값을 나타내었다. 95℃에서는, 아가로비오스는 4∼8 시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스는 4 시간에서 높은 값을 나타내었다. 한천을 1000mM 말산에 용해시킨 경우는, 65℃에서는 24 시간에서 약간의 아가로올리고당의 생성이 보였다. 80℃에서는 아가로비오스는 2∼24 시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스는 2∼6 시간에서 높은 값을 나타내었다. 아가로헥사오스, 아가로옥타오스는 2 시간에서 높은 값을 나타내었다. 95℃에서는, 아가로비오스는 1∼8 시간에서 높은 값을 나타내었고, 아가로테트라오스는 1∼2 시간에서 높은 값을 나타내었다. 아가로헥사오스, 아가로옥타오스는 1 시간에서 높은 값을 나타내었다.
1000mM 말산에 의한 아가의 가수분해의 예를 도 24 및 도 25에 나타낸다. 즉, 도 24는 1000mM 말산, 80℃에서의 아가로올리고당 생성을 나타내는 도면이고, 도면중에 종축은 아가로올리고당 생성량(동그라미 표시: 아가로비오스, 삼각 표시: 아가로테트라오스, 사각 표시: 아가로헥사오스, × 표시: 아가로옥타오스), 횡축은 시간을 나타낸다. 또한 도 25는 1000mM 말산, 95℃에서의 아가로올리고당 생성을 나타내는 도면이고, 도면중에 종축은 아가로올리고당 생성량(동그라미 표시: 아가로비오스, 삼각 표시: 아가로테트라오스, 사각 표시: 아가로헥사오스, × 표시: 아 가로옥타오스), 횡축은 시간을 나타낸다.
(7) 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000mM의 말산에 10%가 되도록 노블 한천을 현탁하여, 70, 80, 90℃에서 가열하였다. 가열한 후, 30분, 1, 2, 3, 4, 8, 24 시간에서 샘플링하여, 아가로올리고당의 생성을 실시예 10-(3)과 동일한 방법으로 측정하였다.
300mM 이상의 말산 농도에서는, 70℃에서도 8 시간 이상에서 높은 아가로올리고당의 생성이 보였다. 1000mM, 70℃에서의 가수분해의 예를 도 26에 나타낸다. 즉, 도 26은 1000mM 말산, 70℃에서의 아가로올리고당의 생성을 나타내는 도면이고, 도면중에 종축은 아가로올리고당 생성량(동그라미 표시: 아가로비오스, 삼각 표시: 아가로테트라오스), 횡축은 시간을 나타낸다.
상기 실시예 10-(3)∼(7)의 결과로부터, 아가로올리고당의 제조에 이용하는 산으로서는 시트르산, 락트산, 말산, 산의 농도는 수십 mM에서 수 M, 가열온도는 70∼95℃, 가열시간은 수십분에서 24 시간이 바람직하다.
(8) F-키트 락토스/갈락토스(베링거 만하임주식회사 제조, 코드 176303)를 이용하여 아가로비오스에 β-갈락토시다제를 작용시켜서 생성되는 갈락토스의 농도를 측정하는 방법으로 아가로비오스의 정량을 행하였다.
키트의 사용방법에 따라서 정량을 행하였지만, β-갈락토시다제의 반응은 37℃, 1시간으로 변경하였다. 검량선은 락토스를 이용하여 제작하고, 락토스 환산의 몰농도(mM)를 산출한 후, 아가로비오스 농도(㎎/㎖)로 변환시켰다.
상기 실시예에서 조제한 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스를 이용하여 상기방법으로 정량을 시도하였다. 그 결과, 아가로비오스는 계산치와 실측치가 일치하였다. 그 한편으로 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스는 상기 방법에서는 실질적으로 검출되지 않았다. 요컨대, 아가로비오스 이외의 아가로올리고당은 상기 검출방법에서는 실질적으로 검출되지 않은 것이 분명해졌고, 상기 방법을 이용함으로써, 아가로올리고당중의 아가로비오스의 농도측정을 행할 수 있는 것이 분명해졌다.
(9) 시판의 한천(이나 한천 타이프 S-7: 이나식품공업사 제조) 100g 및 H형의 강양이온 교환수지(다이아이온 SK104H: 미쯔비시화성 제조) 10g을 95℃의 탈염수 900g중에서 혼합하여 95℃에서 교반하면서 180분간, 한천의 산 분해를 행하였다. 이어서, 실온까지 냉각시키고 활성탄 1% W/W, 및 셀라이트 545(셀라이트사 제조) 0.5% W/W 보디 피드(body feed)로 여과하여, 여과액을 조제하였다.
실시예 8-(2)과 동일한 순상 HPLC로 조제한 여과액을 분석하여 아가로올리고당으로서 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스가 주성분으로서 생성하고 있는 것을 확인하였다.
그 여과액은, pH 2.4, 산도 1.7, 브릭스(brix) 9.4%, 상기 실시예 10-(8) 기재의 F-키트 락토스/갈락토스를 이용하여 측정한 아가로비오스량은 7.4%이었다.
(10) 탈염수 100g중에 H형의 강양이온 교환수지(다이아이온 SK104H)를 18.5g 넣어 95℃에서 교반하였다. 한천(이나 한천 타이프 S-7)은 이하, 10분 간격으로 각 10g을 5회 첨가하고, 이어서 각 15g을 2회 첨가하고, 추가로 각 20g을 3회 첨가하고 마지막으로 30g를 첨가하였다. 한천의 합계 첨가량을 185g으로 한 후, 95℃에서 150분 교반하고, 이어서 실온까지 냉각시켰다. 디켄테이션(decantation)에 의해 수지와 액을 나눈 후, 분리액에 활성탄 3% W/W, 및 셀라이트 545 (셀라이트사 제조) 0.5% W/W 보디 피드로 여과하여 여과액을 조제하였다.
실시예 8-(2)과 동일한 순상 HPLC로 조제한 여과액을 분석하여 아가로올리고당으로서 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스가 주성분으로서 생성하고 있는 것을 확인하였다.
그 여과액은 pH 1.2, 산도 11.9, 브릭스 64%, 상기 실시예 10-(8) 기재의 F-키트 락토스/갈락토스를 이용하여 측정한 아가로비오스량은 24.4%이었다.
(11) 시판의 한천(이나 한천 타이프 S-7) 100g를 이용하여 여러 인산 농도의 탈이온수로 1ℓ에 합쳐서 95℃에서 교반하면서 한천 액화를 행하였다.
또한, 1% W/V 시트르산 농도의 탈이온수 1ℓ에 합친 것을 이용하여 인산과 동일하게 하여 한천 액화를 행하였다. 액화란 그 빙결점에서도 겔 화하지 않는 상태를 의미하고, 그 상태가 되는 시간(액화시간)을 측정하였다. 또한, 액화시 및 그 후의 아가로비오스 생성량을 상기 실시예 10-(8) 기재의 F-키트 락토스/갈락토스를 이용하여 측정하였다.
그 결과를 표 6, 표 7에 나타낸다.
인산 농도 (% W/W) 액화 시간 (분) 95℃ 유지시간(분) 아가로비오스 (g/ℓ)
0.2 0.3 0.5 1.0 150 120 110 90 150 180 300 120 180 300 110 180 300 90 120 2.57 3.80 7.97 4.88 7.04 13.90 6.09 8.48 21.40 7.58 18.80

시트르산 농도 (% W/W) 액화 시간 (분) 95℃ 유지시간(분) 아가로비오스 (g/ℓ)
1.0 90 90 120 150 300 360 0.95 3.40 4.09 5.70 14.80

실시예 11
(1) 시판의 한천(이나 한천 타이프 S-7, 이나식품공업사 제조) 150g,식품첨가용 시트르산(무수)(산에이겐 F·F·I사 제조) 15g를 탈이온수로 1.5ℓ에 합쳐 온도 92℃까지 상승시킨 후, 92∼95℃에서 교반하에 130분 유지하였다. 이어서, 실온까지 냉각시키고 셀라이트 545 (셀라이트사 제조)의 0.5% 보디 피드로 여과하여, 여과액(한천분해 올리고당 용액)을 조제하였다. 실시예 8-(2)과 동일한 순상 HPLC로 조제한 여과액을 분석하여, 당 화합물로서 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스가 주성분으로서 생성하고 있는 것을 확인하였다.
그 여과액의 pH는 약 2.6, 산도는 0.92, 브릭스는 9.2%, 실시예 10-(8) 기재의 방법에서 측정한 아가로비오스 생성량은 43.1mM이었다.
(2) 실시예 11-(1)에서 조제한 여과액(한천분해 올리고당 용액)을 20배로 희석하고 산미료, 감미료, 향미료를 첨가하여 아가로비오스 2.25mM의 청량음료를 제조하였다.
그 배합표를 표 8 및 표 9에 나타낸다. 즉, 표 8은 그레이프후르츠맛 청량음료의 배합표이고, 표 9는 퍼릴라향(perilla flavor) 청량음료의 배합표이다.
각각의 표에 나타내는 원료를 물에 첨가하고 용해시켜 청량음료를 조제하여 200㎖ 빈 캔에 분주하였다. 표 8에 나타내는 배합의 청량음료는 탄산가스로 포화시켜 O.8㎏/㎠ (2O℃)의 가스압이 되는 탄산음료로 하였다.
각각의 음료의 분석치를 표 8, 표 9의 하란에 나타낸다.
한천분해 올리고당 용액 1/7 그레이프후르츠 비타민 C 시트르산 말토스 그레이프후르츠 향 탈염수 50㎖ 20g 0.2g 0.2g 1.25g 1g 잔여
계 pH 산도* 브릭스도 1000㎖ 3.2 0.23 2.2
산도* : 0.1N NaOH ㎖/10㎖(이하 동일)

한천분해 올리고당 용액 퍼릴라(perilla) 엑기스 비타민 C 시트르산 퍼릴라향 탈염수 50㎖ 20g 0.2g 0.2g 0.5g 잔여
계 pH 산도* 브릭스도 1000㎖ 2.9 0.10 0.6

각각의 본 발명품의 탄산음료에 관해서 패널리스트 10명으로 5단계(5 우수, 1 열등)의 관능평가를 하였다. 대상은 한천분해 올리고당 용액 대신에 산도를 같이 한 시트르산액으로 치환한 것을 이용하였다.
그레이프후르츠맛의 관능평가의 평균치를 표 1O에 퍼릴라향의 관능평가의 평균치를 표 11에 나타낸다.
본 발명품 대조
미감(texture) 순함 부드러움 맛의 균형 식감의 종합 4.6 4.8 4.5 4.6 3.1 3.0 2.9 3.1

본 발명품 대조
미감(texture) 순함 부드러움 맛의 균형 식감의 종합 4.5 4.3 4.2 4.3 2.5 2.4 2.5 2.4

본 발명품은 각각 대조에 비해 음료의 맛의 균형이 잘 갖춰져 있고, 미감이 순하고 부드러운 느낌으로 마무리되어 있다는 평가로 신규한 미각의 음료가 되었다. 또한, 탄산가스로 포화시키기 전의 청량음료도, 각각 상기와 동일한 신규한 미각의 본 발명품의 음료이었다.
(3) 상기 표 8, 표 9 기재의 청량음료에 에틸 알코올 6% V/V, 또는 8% V/V가 되도록 에틸 알코올을 가하고 조제하여 200㎖ 빈 캔에 분주하였다. 이어서, 그 알코올 음료를 탄산가스로 포화시키고 0.8㎏/㎠ (2O℃)의 가스압이 되는 본 발명의 청량탄산 알코올 음료를 제조하였다.
본 발명의 청량탄산 알코올 음료는 한천분해 올리고당 용액을 함유하지 않은 대조에 비해 음료의 맛의 균형이 잘 갖춰져 있고, 미감이 순하고 부드러운 느낌으로 마무리되어 있다는 평가로 신규한 미각의 청량탄산 알코올 음료가 되었다.
실시예 12
(1) 한천의 시트르산 분해물을 함유하는 음료를 하기와 같이 조제하였다. 그 배합표를 표 12에 나타낸다. 즉, 표 12의 본 발명품 1은 실시예 11-(1)로 조제한 여과액(한천 올리고당액)을 O.1% W/V 및 한천(울트라한천 AX-30: 이나식품공업사 제조) 0.25% W/V, 시트르산 0.07% W/V를 이용하였다. 본 발명품 2는 한천 올리고당액은 첨가하지 않고, 한천 0.25% W/V, 시트르산 0.08% W/V를 이용하였다. 본 발명품 1 및 2는 각각 한천을 온수로 용해시킨 후, 다른 재료를 혼합하여 산성하에서 93℃, 10초간, 93℃ 미만∼80℃에서 20분간, 또한 80℃ 미만∼75℃에서 15분간의 가열을 행하여 한천의 시트르산 분해물을 함유하는 음료를 제조하였다. 한편, 대조 는 본 발명품 2와 같은 배합이지만 93℃, 10초의 가열조건으로 행하였다.
각각 약간 걸죽한 한천 시트르산 분해물 함유음료(본 발명품 1 및 2)에 관해서 패널리스트 10명으로 5단계(5 우수, 1 열등)의 관능평가를 행하였다. 관능평가의 평균치를 표 13에 나타낸다.
본 발명품 1 본 발명품 2
한천(g) 한천 올리고당액(㎖) 1/7 그레이프후르츠 과즙(g) 과립당 (g) 시트르산(g) 시트르산 나트륨(g) 향료(g) 탈염수 2.5 1.0 1.5 66.0 0.7 0.5 2.0 잔여 2.5 0 1.5 66.0 0.8 0.5 2.0 잔여
계 pH 산도* 브릭스度 아가로비오스(mM)** 1000㎖ 3.68 1.53 7.5 0.06 1000㎖ 3.67 1.57 7.4 0.02
아가로비오스(mM)** : 실시예 10-(8) 기재의 방법으로 측정
본 발명품 1 본 발명품 2 대조
미감(texture) 순함 부드러움 맛의 균형 식감의 종합 4.4 4.5 4.4 4.5 4.1 4.3 4.2 4.3 3.6 3.8 3.6 3.7

본 발명품 1 및 2는 대조에 비해 음료의 맛의 균형이 잘 갖춰져 있고 걸죽함도 적당하며, 미감이 순하고 부드러운 느낌으로 마무리되어 있다는 평가로 신규한 미각의 음료가 되었다. 또한 첨가 시트르산 존재하의 가열처리에 의해, 본 발명품 1 및 2에 있어서 항산화용 올리고당, 아가로비오스의 생성이 확인되었고, 신규한 항산화용 올리고당 함유음료가 제공되었다.
또한, 80℃ 미만∼75℃에서 15분간의 가열조건을, 75℃에서 1일, 85℃에서 5분간, 103℃에서 5분간, 122℃에서 45초간에 각각 바꿔 놓아 아가로비오스의 생성량을 실시예 10-(8) 기재의 방법으로 측정한 바, 각각 0.03mM, 0.02mM, 0.04mM 및 0.05mM이었고, 가열처리에 의해 아가로비오스가 생성하는 것, 또한 가열조건이 강해질수록 아가로비오스 생성이 증가하는 것도 확인되었다.
(2) 실시예 12-(1) 기재의 본 발명품 1, 본 발명품 2 및 대조의 음료에 에틸 알코올 2% V/V, 또는 4% V/V가 되도록 에틸 알코올을 가하여 그 만큼 잔여 탈염수를 감소시켜 알코올 음료를 조제하였다.
본 발명품 1, 본 발명품 2에 각각 해당하는 알코올 음료는 대조의 알코올 음료에 비해 음료의 맛의 균형이 잘 갖춰져 있고 걸죽함도 적당하며, 미감이 순하고 부드러운 느낌으로 마무리되어 있다는 평가로 신규한 미각의 음료가 되었다.
또한, 상기 본 발명의 알코올 음료의 동결물은 샤베트상의 양호한 식감을 나타내었다.
실시예 13
(1) 시판의 한천(아가 노블)을 1% 농도가 되도록 0.1N 염산에 현탁하여 37℃에서 5시간, 16시간 또는 48시간 처리하였다. 이 처리액을 증류수로 10배 희석하여 실시예 9 기재의 박층 크로마토그라피로 분석한 바, 5시간 처리로 아가로올리고당의 생성이 약간 확인되었고, 16시간 처리에서는 5시간 처리보다도 증가하였고, 48시간 처리에서는 더욱 증가하였다.
(2) 시판의 한천(아가 노블)을 1% 농도가 되도록 인산 완충식염수 또는 증류수에 현탁하여 121℃에서 4시간 가열하였다. 이 가열 처리물을 증류수로 10배 희석하여 실시예 9 기재의 박층 크로마토그라피로 분석한 바, 인산 완충식염수중에서 가열 처리한 시료에는 흔적량의, 증류수중에서 가열 처리한 시료에는 그것보다도 분명하게 다량의 아가로올리고당의 생성이 확인되었다. 또, 전자의 가열 처리한 후의 pH는 약 7, 후자의 그것은 약 5이었고, 실온까지 냉각시키면 전자는 겔화하였지만, 후자는 겔화하지 않았다.
실시예 14
(1) 한천(아가 노블)을 10% 농도가 되도록 0.1N HCl에 현탁하여 100℃에서 19분간 가열하였다. 물로 평형화한 토요펄(TOYOPEARL) HW40C(토소사 제조) 컬럼(4.4㎝×85㎝)에 상기 시료 10㎖를 어플라이하고, 매분 1.4㎖의 유속으로 물을 이동상으로서 겔 여과 크로마토그라피를 행하였다. 용출하는 물질은 시차 굴절계로 검출하여 7㎖씩 분취하였다.
용출 시간 406분, 435분, 471분 및 524분에 피크가 확인되었고, 실시예 9 기재의 박층 크로마토그라피로 각 피크에 해당하는 분획을 분석한 바, 이들은 순차로 아가로옥타오스, 아가로헥사오스아가로테트라오스 및 아가로비오스인 것이 분명해졌다. 이것들의 분획을 동결건조시키고 30㎎의 아가로옥타오스, 100㎎의 아가로헥사오스, 150㎎의 아가로테트라오스 및 140㎎의 아라로비오스를 얻었다.
(2) 실시예 14-(1)에서 얻은 아가로비오스, 아가로테트라오스의 각 100mM 수용액 25㎕에 100㎖의 L-시스테인 수용액 50㎕을 가하고 인산 완충식염수 925㎕을 가하여 37℃에서 1시간 또는 16시간 반응시켰다. 동일한 반응을 L-시스테인 수용액 대신에 같은 농도의 L-리진 수용액에 있어서도 행하였다.
각 반응시료 1㎕를 실리카 겔 시트 6OF254에 스포트하고 1-부탄올:에탄올:물=5:5:1에서 전개하여 오르시놀 황산법으로 검출하였다.
이 결과, L-시스테인의 1시간 반응시료에 있어서, 아가로비오스, 아가로테트라오스의 스포트가 소실하였다. 또한, L-시스테인, L-리진의 16시간 반응시료에 있어서는, 모든 시료에서 아가로비오스, 아가로테트라오스의 스포트가 소실하였다.
실시예 8-(2)과 동일한 순상 HPLC로 각 시료를 분석한 바, 박층 크로마토그라피와 동일한 결과가 얻어졌다.
(3) 실시예 14-(2)에서 조제한 각 반응시료 10㎕을 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 넣고, 실시예 2-(1) 기재의 방법으로 HL-60에 대한 암세포증식 억제활성을 측정하였다.
그 결과, 아가로비오스, 아가로테트라오스의 스포트가 소실한 시료에 있어서 활성의 소실이 보였다. 즉, 아가로비오스, 아가로테트라오스와 L-시스테인의 1시간 반응시료 및 아가로비오스, 아가로테트라오스와 L-시스테인, L-리진의 16시간 반응시료에 있어서, 같은 농도의 아가로비오스, 아가로테트라오스에 비해 세포증식 억제활성이 약 1/10이 되었다.
실시예 15
(1) κ-카라기난(시그마사 제, C-1263) 2.5g을 50㎖의 0.1N HCl에 현탁하고 100℃에서 16분간 가열하여 용해시켰다. 실온까지 냉각하여 NaOH로 pH 중성 부근까지 중화시킨 후, 코스모나이스 필터로 여과하여 이하의 순상 HPLC로 분리하였다.
컬럼 : PALPAK 타이프 S (4.6×250㎜, 타카라슈조사 제조, CA8300)
용매 A : 90% 아세토니트릴 수용액
용매 B : 50% 아세토니트릴 수용액
유속 : 1㎖/분
용출 : 용매 A (10분간)→용매 A로부터 용매 B의 직선농도 구배(40분간)→용매 B(10분간)
검출 : 215㎚에 있어서의 흡광도
컬럼온도 : 40℃
시료 어플라이량 : 50㎕
순상 HPLC의 분리도를 도 27에 나타낸다. 즉, 도 27은 κ-카라기난산 분해물의 순상 HPLC 크로마토그라피를 나타내는 도면이고, 횡축은 유지시간(분), 종축은 215㎚에 있어서의 흡광도를 나타낸다.
각 용출 피크를 분취하여 감염하에 건조시킨 후, 100㎕의 물에 용해시켰다. 각 분획을 여과 멸균하여 실시예 2-(1) 기재의 방법으로 HL-60 세포에 대한 세포증식 저해활성을 측정하였다. 그 결과, 27.797분, 33.905∼34.784분, 36.226∼36.654분의 각 피크 유래의 분획을 첨가한 구분에 있어서, 아포토시스 소체가 관찰되었고, 대조의 수첨가 구분에 비해 590㎚에 있어서의 흡광도가 낮아 세포증식이 저해되었다.
용출 시간 27.797분의 피크 유래의 분획을 상기 HPLC의 조건으로 12회 분리하여 모아서 감염하에 건조시켜 아포토시스 유발성 및 항암성 물질을 얻었다.
(2) 실시예 15-(1) 기재의 아포토시스 유발성 및 항암성 물질의 질량분석을 DK302 질량 분석계(닛폰 덴시사 제조)를 이용하여 행하였다. 글리세롤을 매트릭스로서 이용하여 네거티브 이온 모드로 측정하였다.
FAB-MS
m/z 403 [M-H]-
495 [M+글리세롤-H]-
그 결과를 도 28에 나타낸다. 즉, 도 28은 아포토시스 유발성 및 항암성 물질의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이고, 횡축은 m/z치, 종축은 상대 강도를 나타낸다.
실시예 15-(1)에서 얻은 아포토시스 유발성 및 항암성 물질의 핵자기공명 스펙트럼을 측정하였다. 핵자기공명 장치는 JNM-A500(닛폰덴시사 제조)를 이용하였다.
도 29에 아포토시스 유발성 및 항암성 물질의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 29에 있어서, 횡축은 화학 쉬프트치(ppm)를, 종축은 시그널의 강도를 나타낸다.
이것들의 질량분석, 1H-NMR의 해석결과로부터 실시예 15-(1) 기재의 아포토시스 유발성 및 항암성 물질은 카라비오스[β-D-갈락토피라노실-4-설페이트(1→4)- 3,6-안히드로-D-갈락토스]로 동정되었다.
이상으로부터 실시예 15-(1)에서 얻은 아포토시스 유발성 및 항암성 물질은 κ-카라비오스인 것이 분명해졌다.
(3) 실시예 15-(1)에서 얻은 κ-카라비오스를 1.56mM이 되도록 물에 용해시켜 10㎖를 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 넣고, 실시예 2-(1) 기재의 방법으로 아포토시스 유발활성과 암세포증식 억제활성을 측정하였다. 그 결과, 광학현미경 관찰에 있어서 아포토시스 소체가 보였고, 대조의 수첨가 구분에 비해 κ-카라비오스 첨가 구분에서는 세포증식이 약 70% 억제되어 있었다. 따라서, κ-카라비오스는 156μM에서 HL-60 세포에 아포토시스를 유발시켜 세포증식을 억제하였다.
실시예 16
(1) 시판의 한천 분말(와코쥰야쿠사 제조) 4.5g을 0.1N의 염산 150㎖에 현탁하여 전자레인지로 가열 용해하고 용해액을 비등탕 욕상에서 1O분간 유지하였다. 이 가열 처리한 후, 실온이 될 때까지 가열 처리 한천 용액을 방냉하여 원심분리에 의해 불용물을 제거하였다. 다음에, 원심상청을 회수하고 1N의 수산화 나트륨으로 pH 6.8로 조정하였다. 이 원심상청 150㎖에 대하여 같은 양의 초산에틸을 첨가한 후, 강하게 교반하여 초산에틸상과 수상에 분배하였다. 분배된 수상을 증발건조기로 건조시켜 재차 150㎖의 물에 용해시켰다, 용해시의 불용물을 원심분리에 의해 제거하여 상청을 얻었다. 또한 초산 에틸상은 증발건조기로 건조시켜고 100㎖의 이온교환수에 용해시켜 1N의 수산화 나트륨으로 pH를 6.5로 조정하였다.
초산에틸상, 수상을 포어 사이즈(pore size) 0.2㎛의 필터(코닝사 제조)로 여과 멸균한 후, 물로 10, 20, 30배로 희석하여 실시예 2-(1)과 같은 방법에 의해 HL-60 세포에 대한 증식억제 활성을 측정하였다. 그 결과, 수상에는 증식억제 활성이 확인되었지만, 초산 에틸상에는 증식억제 활성이 확인되지 않았다.
조제한 수상용액 50㎖를 셀룰로파인 GCL-25 컬럼(41×905㎜)에 의해 겔 여과하였다. 용출액으로서는 10% 에탄올 함유의 0.2M NaCl. 도 30에 용출도를 나타낸다. 즉, 도 30은 셀룰로파인 GCL-25에 의한 겔 여과의 결과를 나타내는 도면이고, 도면중에 종축은 페놀 황산법에 의해 측정한 용출액중의 당 함량(흡광도 490㎚: 검은 동그라미 표시), 횡축은 분획번호(1분획 1O㎖)를 나타낸다.
각 용출 분획을 실리카 겔 시트 6OF254 (머크사 제조)에 각 1㎕를 스포트하여 1-부탄올:아세트산:물=4:1:2로 전개한 후, 오르시놀 시약[400㎎의 오르신 일수화물(와코쥰야큐사 제조)을 22.8㎖의 황산에 용해시켜 물을 가하여 200㎖로 한 것]을 분무하여 150℃로 가열한 핫 플레이트상에서 가열하여 스포트를 관찰하였다.
상기의 TLC 분석에 의해 스포트가 확인된 분획번호 40에서 120을, 각각 5개씩 정리한 후, 멸균 여과하여 HL-60세포에 대한 증식억제 활성을 측정하였다. 그 결과, 분획번호 86에서 90에 가장 강한 증식억제 활성이 확인되었다.
(2) 분획번호 86에서 88를 회수하여 증발건조기로 건조시켜 0.94g의 분체를 얻었다. 얻어진 분체를 30㎖의 90% 에탄올에 용해시켜 5C 필터(ADVANTEC사 제조)로 백색 침전물을 제거하고 세파덱스(Sephadex) LH-20 컬럼(35×650㎜)에 의해 겔 여과하였다. 용출액으로서는 90% 에탄올을 이용하였다. 도 31에 용출도를 나타낸다. 즉, 도 31은 세파덱스 LH-20 컬럼에 의한 겔 여과의 결과를 나타내는 도면이고, 도면중에 종축은 페놀 황산법에 의해 측정한 용출액중의 당 함량(흡광도 490㎚: 검은 동그라미 표시), 횡축은 분획번호(1분획 10㎖)를 나타낸다. 각 용출 분획을 상기와 동일한 실리카 겔 시트를 이용하여 분석하였다.
TLC 분석의 결과, 검출된 성분은 분획번호 30에서 35, 36에서40, 41에서 44, 45에서 48, 49에서 53의 5 그룹으로 대별된다. 각 분획번호에 대해 125㎕을 상기의 그룹에 정리하여 증발건조기로 건조시키고 500㎕의 이온교환수에 용해시켜 HL-60 세포에 대한 증식억제 활성을 측정하였다.
HL-60 세포에 대해서 가장 강한 증식억제 활성이 있던 분획번호 36에서 40을 증발건조기로 건조시켜 5㎖의 1-부탄올:아세트산:물=4:1:2로 용해시키고, 이것을 1-부탄올:아세트산:물=4:1:2로 세정한 실리카 겔 60F254를 충전한 컬럼(20×71O㎜)에 어플라이하였다. 용출액에서는 1-부탄올:아세트산:물=4:1:2를 이용하였다(1분획=3㎖).
각 용출 분획을 상기와 동일하게 실리카 겔 시트를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 검출된 성분은, 분획번호 46에서 52(그룹 1), 60에서 70 (그룹 2), 72에서 84(그룹 3), 86에서 94(그룹 4), 96에서 120(그룹 5)로 대별되었다.
각 그룹을 증발건조기로 건조시켜 각각 5㎖의 이온교환수에 용해시켜 포어 사이즈 0.45㎛의 필터(IWAKI사 제조)로 여과하였다. 얻어진 각 용액의 HL-60에 대한 증식억제 활성을 측정하였다. 그 결과, 그룹 3, 4, 5에 증식억제 활성이 확인되었다.
그룹 4, 5의 구조에 관해서는 TLC 분석 및 질량분석에 의해 아가로비오스인 것을 확인하였다.
그룹 3의 구조에 관해서는 질량분석 및 NMR 분석에 의해서 β-D-갈락토비라노실(1→4)-3,6-안히드로-2-0-메틸-L-갈락토스인 것이 확인되었다.
도 32는 β-D-갈락토피라노실(1→4)-3,6-안히드로-2-0-메틸-L-갈락토스의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이고, 횡축은 m/z치, 종축은 상대강도(%)를 나타낸다. 또한, 도 33은 β-D-갈락토피라노실(1→4)-3,6-안히드로-2-0-메틸-L-갈락토스의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이고, 횡축은 화학 쉬프트치(ppm), 종축은 시그널의 강도를 나타낸다.
β-D-갈락토피라노실(1→4)-3,6-안히드로-2-0-메틸-L-갈락토스는 아가로비오스와 동일하게 HL-60세포에 대하여 강한 세포증식 억제활성을 갖는 것이 판명되었다.
실시예 17
(1) 실시예 3에서 얻은 한천 유래 당류의 과산화 지질 라디칼 생성 억제활성을 아래와 같이 하여 측정하였다.
스타필로코커스·아우레우스(Staphylococcus aureus) 3A (National Collection of Type Culture, NCTC 8319)를 5㎖의 브레인 허트 인퓨젼(brain heart infusion) 배지(디프코사 제조, 0037-17-8)에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양하였 다. 원심에 의해 균체를 모아 인산 완충식염수로 3회 세정한 후, 1×1O7 콜로니 형성단위/㎖가 되도록 인산 완충식염수에 현탁하였다. 100㎕의 상기 균현탁액, 100㎕의 시료 수용액, 100㎕의 1㎎/㎖ 메트헤모글로빈(시그마사 제조, M9250) 수용액 및 600㎕의 인산 완충식염수 및 100㎕의 50mM tert-부틸히드로페르옥시드(카타야마화학사 제조, 03-4990) 수용액을 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 1㎖의 2×NMP 배지[8g의 영양 배지 (디프코사 제조, 0003-01-6), 5g의 트립톤(디프코사 제조, 0123-17-3), 5g의 NaCl, 10g의 만니톨(나칼라이 테스크사 제조, 213-03), 0.035g의 페놀 레드(나칼라이 테스크사 제조, 268-07)를 증류수에 용해시켜 500㎖로 하고, NaOH로 pH 7.4로 조정한 후, 여과멸균한 것]을 가하여 반응을 정지하고, NMP 배지(2×NMP 배지를 멸균수로 2배 희석한 것)로 3배씩 12단계 희석한 것 각 160㎕을 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 넣어 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배지의 빛깔을 육안으로 관찰하고 균이 생육하여 배지가 적색에서 노란색에 변화한 웰이 보인 시료를 과산화지질 라디칼 생성 억제활성을 갖는 것으로 하였다.
그 결과를 표 14에 나타낸다. 표 14에 있어서, + 는 균의 생육한 웰이 보인 시료를, - 는 균의 생육한 웰이 보이지 않는 시료를 나타낸다. 또한, 표의 최상열에 나타낸 농도는 tert-부틸히드로퍼옥시드 및 균체를 37℃에서 30분간 반응시킨 반응액중의 시료의 농도이다.
0.1mM 1mM
아가로비오스 아가로테트라오스 갈락토스 + - - + + -

이상의 결과, 아가로비오스와 아가로테트라오스에 강한 과산화지질 라디칼 생성 억제활성이 보였다. 카라비오스 및 3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스에도 같은 활성을 확인하였다.
(2) 시판의 한천(이나한천 타이프 S-7, 이나식품공업사 제조) 5g을 50mM 시트르산 45㎖에 현탁하고 93℃에서 155분 가열하여 NaOH로 pH 6으로 조제한 샘플(시트르산 처리물)과, 100mM 염산 45㎖에 현탁하고 95℃에서 13분 가열하여 NaOH로 pH 6으로 조제한 샘플(염산 처리물)을 물로 1, 2, 4, 8, 10, 100배 희석하고, 과산화지질 라디칼 생성 억제활성을 실시예 17-(1)과 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 시트르산 처리물, 염산 처리물 모두에서 10배 희석까지 활성이 확인되었고, 모두 동등한 과산화지질 라디칼 생성 억제활성이 확인되었다.
실시예 18
콘카나발린A (ConA)에 의한 림프구 유약화 반응에 대한 아가로비오스의 억제작용
ddY 마우스(일본 SLC; 수컷, 7주령)로부터 비장을 적출하여 잘게 분쇄하여 10% 소태아혈청(하이클론)을 포함한 RPMI-1640 배지(기브코)에 현탁하여 단세포액을 얻었다. 세포 부유액을 플라스틱 샤레에 파종하여 탄산가스 배양기로 37℃, 2시간 배양하여 접착성세포를 샤레에 접착시켜서 제외하고 비접착성 세포를 비장 림프구로서 이용하였다. 세포농도를 2×106 세포/㎖로 조정하고 96웰 마이크로타이터 플 레이트에 200㎕/웰로 파종하여 대조군 이외의 각 웰에 각 농도의 아가로비오스를 첨가하였다. 또한, 모든 웰에 5㎍의 ConA (나칼라이 테스크)를 첨가하고 탄산가스 배양기로 37℃, 1일간 배양하였다. 배양후 1μCi의 3H-티미딘을 각 웰에 가하고 다시 1일간 배양하여 세포에의 포함량을 액체 섬광 계수기(scintillation counter)로 측정하였다.
그 결과를 도 34에 나타낸다. 즉, 도 34는 ConA에 의한 림프구 유약화반응에 있어서 아가로비오스 농도와, 3H-티미딘 포함량과의 관계를 나타내는 도면이고, 횡축은 아가로비오스 농도, 종축은 3H-티미딘 포함량(cpm)을 나타낸다. 흰 막대 그래프는 자극이 없는 경우의, 사선 막대 그래프는 ConA에 의해 자극한 경우의 3H-티미딘 포함량을 나타낸다. 도 34으로 부터 분명한 바와 같이, 마이토겐 자극의 마우스 림프구의 증식에 대하여 아가로비오스는 용량 의존적인 억제작용을 나타내었고, 100㎍/㎖로 거의 완전하게 억제되었으며, 림프구의 활성화에 대한 억제작용이 확인되었다. 또한, 3,6-안히드로갈락토피라노스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, 카라비오스 및 3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스에도 같은 활성을 확인하였다.
실시예 19
혼합 림프구 반응에 대한 아가로비오스의 억제작용
BALB/c 마우스(일본 SLC; 수컷, 6주령) 및 C57BL/6 마우스(일본 SLC; 수컷, 6주령)으로부터 비장을 적출하고, 상기의 방법에 의해 비장 림프구를 얻었다. 각 세포 부유액의 농도를 2×1O6 세포/㎖로 조정하고 100㎕씩을 혼합하여 96웰 마이크로타이터 플레이트에 파종하였다. 대조군 이외의 각 웰에 각 농도의 아가로비오스를 첨가하여 탄산가스 배양기로 37℃, 4일간 배양하였다. 배양후 1μCi의 3H-티미딘을 각 웰에 가하고 다시 1일간 배양하여 세포에의 포함량을 액체 섬광 계수기로 측정하였다.
그 결과를 도 35에 나타낸다. 즉, 도 35는 혼합 림프구 반응에 있어서 아가로비오스 농도와, 3H-티미딘 포함량과의 관계를 나타내는 도면이고, 횡축은 아가로비오스 농도, 종축은 3H-티미딘 포함량(cpm)을 나타낸다. 흰 막 그래프는 어느 것인가의 계통 유래의 세포를 단독적으로 이용한 경우의, 사선 막대 그래프는 양계통 유래의 세포를 혼합한 경우의 3H-티미딘 포함량을 나타낸다. 도 35로부터 분명한 바와 같이, 동종이계 항원자극에 의해 활성화된 림프구에 대하여 아가로비오스는 용량 의존적인 억제작용을 나타내었고, 1O㎍/㎖로 거의 완전하게 억제되었으며, 림프구의 활성화에 대한 억제작용이 확인되었다. 또한, 3,6-안히드로갈락토피라노스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, 카라비오스 및 3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스에도 같은 활성을 확인하였다.
실시예 20
(1) 10% 소태아혈청(기브코사 제조) 함유, 페놀 레드 비함유, 2mM L-글루타 민(라이프 테크놀로지 오리엔탈사 제조, 25030-149) 함유 둘베코(Dulbecco's)개량 이글 배지(바이오 휘텍커사 제조, 12-917F)에 RAW264.7 세포(ATCC TIB 71)를 3×105 세포/㎖가 되도록 현탁하고 48웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 500㎖씩 가하여 5% 탄산가스 존재하, 37℃에서 12시간 배양하였다. 각 웰에 10㎖의 25㎍/㎖ 리포폴리삭카라이드(LPS, 시그마사 제조, L-2012)와 10㎕의 500O, 1500, 500, 150 또는 50μM 아가로비오스 또는 네오아가로비오스(시그마사 제조, G4410) 수용액을 첨가하고, 재차 12시간 배양한 후, NO가 배지중에서 산화됨으로써 발생되는 NO2 -농도의 측정을 행하였다. 또, 대조로서 LPS를 가하지 않은 구분 및 아가로비오스 또는 네오아가로비오스를 가하지 않은 구분을 설정하였다.
상기배양후, 100㎕의 배지에 100㎕의 4% 그리스 시약(시그마사 제조, G4410)을 가하여 실온에서 15분간 방치한 후, 490㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 상기 배지에 용해시킨 기지의 농도의 NaNO2로 제작한 검량선으로부터 배지중의 NO2 -농도를 계산하였다. 측정은 전부 3번 연달아 행하였다.
이 결과, 아가로비오스는 농도 의존적으로 LPS에 의한 NO 생성 유도를 억제하였고, 네오아가로비오스는 억제하지 않았다. 그 결과를 도 36과 도 37에 나타낸다. 즉, 도 36은 아가로비오스를 첨가하여 각 배양조건으로 배양하였을 때의 배지중의 NO2 -농도를 나타내는 도면이다. 도 37은 네오아가로비오스를 첨가하여 각 배양 조건으로 배양하였을 때의 배지중의 NO2 -농도를 나타내는 도면이다. 도 36, 도 37에 있어서 횡축은 배양조건을, 종축은 NO2 - 농도(μM)를 나타낸다.
아가로비오스 대신에, 3,6-안히드로갈락토피라노스, 카라비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스 및 3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토오스를 이용하여도 같은 결과가 얻어졌다.
(2) 시판의 한천(이나한천 타이프 S-7, 이나식품공업사 제조) 5g을 45㎖의 0.1N HCl에 현탁하여 95℃에서 13분간 처리하였다. 실온까지 냉각시킨 후, NaOH로 중화시키고 0.22㎛의 MILLEX-GP 필터(밀리포아사 제조, SLGPR25LS)로 여과하였다. 이 시료(한천 염산분해 용액)와 실시예 11-(1)에서 얻은 한천 분해 올리고당 용액(한천 시트르산 분해 용액)에 대해서, 실시예 20-(1) 기재의 방법으로 NO 억제활성을 측정하였다. 즉, 미리 48웰 마이크로타이터 플레이트에서 배양한 RAW264.7 세포에 대하여 각 웰에 10㎕의 25㎍/㎖의 LPS와 10㎕의 상기 시료의 20배 희석액을 가하여 측정을 행하였다. 또, 대조로서 LPS를 가하지 않은 구분, 상기 시료를 가하지 않은 구분 및 2.5mM 시트르산을 가한 구분을 설정하였다. 또한, 측정은 전부 2번 연달아 행하였다.
이 결과, 한천 염산분해 용액, 한천 시트르산 분해 용액 모두 LPS에 의한 NO 생성 유도를 억제하였다. 그 결과를 도 38에 나타낸다. 즉, 도 38은 한천 염산분해 용액, 한천 시트르산 분해 용액을 첨가하여 배양하였을 때의 배지중의 NO2 - 농도를 나타내는 도면이다. 도 38에 있어서 횡축은 배양조건을, 종축은 NO2 - 농도(μM)를 나타낸다.
(3) 실시예 20-(2)과 동일한 방법으로, 100mM 갈락토스(나칼라이 테스크사 제조, 코드 165-11), 100mM 3,6-안히드로-D-갈락토스(후나코시사 제조, 코드 G0002) 수용액을 이용하여 NO 생성 억제활성의 평가를 행하였다.
그 결과, 3,6-안히드로-D-갈락토스는 NO 생성을 억제하였지만, 갈락토스는 억제하지 않았다. 그 결과를 도 39에 나타낸다. 즉, 도 39는 3,6-안히드로-D-갈락토스, 갈락토스를 첨가하여 배양하였을 때의 배지중의 NO2 - 농도를 나타내는 도면이다. 도 39에 있어서 횡축은 배양조건을, 종축은 NO2 - 농도(μM)를 나타낸다.
(4) 실시예20-(1) 기재의 둘베코 개량 이글 배지에 RAW264.7 세포를 3×105 세포/㎖가 되도록 현탁하고 48웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 500㎕씩 가하여 5% 탄산가스 존재하, 37℃에서 10시간 배양하였다. 이어서, 10㎕의 5,000μM 아가로비오스 수용액을 첨가하여 각각 1, 2, 4, 6시간 배양하였다. 그 후, 배양 상청을 제거하고 각 웰에 새롭게 상기 둘베코 개량 이글 배지를 500㎕씩 가하고 10㎕의 2.5㎍/㎖의 LPS, 800U/㎖의 인터페론-γ(IFN-γ, 코스모바이오사 판매, GZM-MG-IFN) 수용액을 첨가하여 1시간 배양하였다. 그 후, 배양상청을 제거하고 각 웰에 새롭게 상기 둘베코 개량 이글 배지를 500㎕ 씩 가하여 재차 16시간 배양한 후, NO 가 배지중에서 산화됨으로써 발생되는 NO2 - 농도의 측정을 실시예 20-(1) 기재의 방법으로 행하였다. 또, 대조로서 LPS, IFN-γ 수용액을 가하지 않은 구분 및 아가로비오스를 가하지 않은 구분을 설정하였다. 또한, 측정은 전부 2번 연달아 행하였다.
이 결과, 아가로비오스는 미리 세포에 첨가되어 있는 시간이 길수록 NO의 생성을 억제하였다. 즉, 아가로비오스를 미리 세포배양 배지에 첨가하여 놓는 것으로 LPS, IFN-γ로 유도되는 NO의 생성을 억제, 예방할 수 있었다. 그 결과를 도 40에 나타낸다. 도 40은 각 배양조건으로 배양하였을 때의 배지중의 NO2 - 농도를 나타내는 도면이다. 도 40에 있어서 횡축은 배양조건을 나타내고, 종축은 NO2 - 농도를 나타낸다. 또한 3,6-안히드로갈락토피라노스로 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로오그타오스, 카라비오스 및 3, 6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스에 동일한 활성을 확인하였다.
실시예 21
(1) 한천 분말(와코쥰야큐사 제조)를 최종농도 3%가 되도록 50mM 시트르산 용액에 넣고 95℃, 160분의 가열처리를 행하여 항암 시험용의 올리고당 용액을 조제하였다.
일본챨스리버사(Nippon Charles River)로부터 4주령, 수컷의 누드 마우스(SPF/VAFBalb/cAnNCrj-nu)를 구입하여 1주간 예비 사육하였다. 이 마우스에 게 인간 대장암 세포주 HCT116 (ATCC CCL-247)을 1.5×1O6 세포/마우스가 되도록 피하 이식하였다.
대장암 세포주 이식 2주째부터, 상기 항암 시험용 올리고당 용액을 사용 직전에 pH 6.5로 조정한 것을 주에 5일, 음료수로서 자유롭게 섭취시켰다. 마우스 1마리당, 1일 평균 3.5㎖ 섭취하고 있었다. 또한, 사육용 먹이로서 오리엔탈 효모사(Oriental Yeast) 제조의 MF를 자유롭게 섭취시켰다.
올리고당 투여 개시후 4주째에 올리고당 투여군의 각 마우스의 고형암을 적출하고 그 중량을 통상의 음료수를 섭취시킨 대조군의 고형암 중량과 비교하였다. 또 본 시험은 각 군 10마리로 행하였다.
그 결과, 항암 시험용 시료의 경구 투여군에 있어서 유의한 암 증식억제가 확인되었고, 한천 유래의 올리고당은 경구투여에 있어서 강한 항암 작용을 나타내었다.
그 결과를 도 41에 나타낸다. 즉, 도 41은 본 발명의 올리고당의 항암 활성을 나타내는 도면이고, 종축은 고형암 중량(g), 횡축은 대조군, 올리고당 투여군을 나타낸다.
또, 항암 시험용 시료 중화물의 경구 투여군에 있어서, 완전히 암이 소실한 개체의 일례가 있었다.
(2) 실시예11-(1) 기재의 한천 올리고당 용액을 이용하여 에르리히(Ehrlich's) 복수암에 대한 항암 시험을 행하였다.
5주령의 암컷 ddY계 마우스(체중 약 25g)을 이용하여 에르리히 암세포를 복강내 투여(1.2×1O6 세포/마우스)하고 생존수보다 평균 생존일수 및 연명률을 산정하였다.
마우스는 1군 8마리로 대조군, 실시예 11-(1) 기재의 한천 분해 올리고당 용액의 3.3배 희석액 섭취군 및 16.7배 희석액 섭취군의 3군을 설정하였다. 즉, 실시예 11-(1)에서 조제한 한천 분해 올리고당 용액의 각각의 수희석액을 조제하고 암세포 투여의 3일전부터 자유롭게 음수 섭취시켰다. 한천 분해 올리고당 용액의 3.3배 희석액 섭취군의 1일당, 그 희석액 섭취량은 5㎖/일/마우스이었다. 한천 분해 올리고당 용액의 16.7배 희석액 섭취군의 1일당, 그 희석액 섭취량는 6㎖/일/마우스이었다. 또, 대조군은 1일당, 7㎖/마우스의 물섭취이었다.
그 결과, 대조군에서는 평균 생존일수가 11.8일인데 대하여 한천 분해 올리고당 용액의 3.3배 희석액 섭취군, 및 한천 분해 올리고당 용액의 16.7배 희석액 섭취군의 평균 생존일수는, 각각 19.8일 및 14.4일이었고, 연명률은 각각 168% 및 122%로 유의한 연명효과가 확인되었다.
실시예 22
위스타계 래트(수컷, 5주령, 체중약 150g; 일본 SLC)의 복강내에 100㎍의 난백 알부민(OA; 시그마사) 및 1㎖의 명반(alum)[상품명 임젝트 앨럼(Imject Alum); 피아스사]를 주사하고 감작시켜 14일 후에 복대동맥으로부터 말소혈을 채취하고 그 혈청을 항 OA 항체로 하였다.
위스타계 래트(수컷, 7주령, 체중 약 200g; 일본 SLC)의 털을 깍은 배부에 항 OA 항체 100㎕를 피하 투여하여 수동 감작시켰다. 감작 48시간 후에 실시예 11-(1) 기재의 한천 분해 올리고당 용액 또는 그 10배 수희석액 2㎖을 각 군 4마리의 래트의 복강내에 투여하였다. 대조군의 래트에는 2㎖의 물을 복강내에 투여하였다.
투여 30분 후에 0.1% OA, 0.5% 에반스 블루(Evan's blue)(나칼라이 테스크)를 포함한 생리식염수 1㎖을 꼬리정맥으로부터 주사하여 PCA를 야기시켰다. 항원 유발 30분 후에 래트를 단두, 방혈치사시켜 배부의 색소가 누출한 부위를 절제하여 회수하였다.
회수한 피부는 1㎖의 1N KCl (나칼라이 테스크)에 담가 하룻밤 방치한 후, 0.6N H3PO4 (머크사)를 포함한 아세톤액(나칼라이 테스크) 9㎖를 가하여 색소를 추출하고 엘리사 리더(ELISA reader)로 620㎚의 흡광도를 측정하였다. 피부의 누출 색소량은 에반스 블루의 검량선으로부터 구하였다.
결과를 도 42에 나타낸다. 즉, 도 42는 본 발명의 올리고당의 PCA 억제를 나타내는 도면이고, 도면중에 종축은 색소 누출량(㎍/부위), 횡축은 사용한 한천 분해 올리고당 용액을 나타낸다.
도면에 나타내는 바와 같이, 한천 분해 올리고당 용액의 투여에 의해, PCA에 의한 색소누출은 반 이하까지 억제되었고, 대조에 비해 유의한 차이(p<0.05)를 나타내었다.
또한, 3,6-안히드로갈락토피라노스, 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가 로헥사오스, 아가로옥타오스, 카라비오스 및 3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토오스에 동일한 효과를 확인하였다.
실시예 23
6웰 플레이트에 5×104 세포/웰/2㎖ 배지가 되도록 10% FBS 함유 RPMI-1640에 현탁한 마우스 멜라노마세포 B16BL6를 분주하고 37℃에서 인큐베이트하였다. 2일째에 100㎕의 아가로비오스 용액(2㎎/㎖∼0.2㎎/㎖)을 첨가하여 7일째에 배지를 교환하고, 동시에 100㎕의 아가로비오스 용액(2㎎/㎖∼0.2㎎/㎖)을 첨가하였다. 8일째에 세포를 회수하여 DNA, RNA, 단백질을 분해 처리한 후, 400㎚의 흡광도를 측정하고, 멜라닌 생성 억제작용을 행하였다.
즉, 배지를 흡인 제거한 후, 20mM EDTA 용액에 용해한 0.25% 트립신을 1웰 당, 0.3㎖ 첨가하여 37℃에서 10분 인큐베이트하였다. 이어서, 2㎖의 새로운 배지을 첨가하고 세포를 현탁하여 시험관에 회수하였다. 이어서, 배지를 원심 제거한 후, 2㎖의 PBS에서 세포를 현탁하거, 재차 원심 분리하였다. 상청을 제거한 후, 세포에 30㎕의 5mM 염화망간을 포함하는 50mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.0)와 1㎕의 70,000U/㎖의 DNaseI(타카라슈조사 제조)를 가하여 잘 혼합한 후, 37℃에서 2시간 인큐베트하고, DNA를 분해하였다. 그리고 10㎎/㎖의 리보뉴클레아제A(시그마사 제조)를 1㎕ 가하고 50℃에서 1시간 인큐베이트하여 RNA를 분해하였다. 마지막으로 100㎍/㎖의 프로테이네스K(시그마사 제조), 0.1% 트리톤X 및 10mM EDTA를 포함하는 100mM 트리스염산 완충액(pH 7.8)를 세포수 2×106에 대하여 액의 총량이 200㎕가 되도록 가하고, 37℃에서 16시간 인큐베이트한 후, 400㎚의 흡광도를 측정하였다.
결과를 표 15에 나타낸다. 표 15에 나타내는 바와 같이, 아가로비오스 50, 100㎍/㎖의 농도에 있어서 멜라닌 생성 저해 활성이 확인되었고, 아가로비스의 미백효과가 확인되었다. 또한, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, 카라비오스 및 3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스에 동일한 효과를 확인하였다.
아가로비오스 ㎍/㎖ 400㎚ 흡광도
평균 ± SD
100 50 10 대조 0.383 0.392 0.521 0.487 ± ± ± ± 0.007 0.172 0.256 0.038
주) 측정은 3번 연달아 행하였고 대조는 배지 100㎕을 첨가하였다.
이상의 기재한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 아포토시스 유발제, 항암제, 활성 산소 생성 억제제, 과산화지질 라디칼 생성 억제제, NO 생성 억제제 등의 항산화제, 면역조절제의 유효 성분으로서 유용하다, 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그 알데히드체 및 그것들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물, 예를 들어 해당 화합물 함유물의 pH 7 미만의 산성하에서의 산 분해 및/또는 효소 분해에 의해 생성하는 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, 카라비오스, 3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스 등의 기능성 물질이 제공된다.
이것들의 물질은 아포토시스 유발용 의약, 항암용 의약, 활성 산소 생성 억 제용 의약, NO 생성 억제용 의약 등의 항산화용 의약, 면역 조절용 의약, 항 알레르기용 의약의 유효 성분으로서 유용하고, 또한 이것들의 당 화합물로부터 선택되는 당 화합물을 함유, 첨가 및/또는 희석하여 이루어지는 식품 또는 음료는 아포토시스 유발작용, 항암작용, 활성 산소 생성 억제작용, NO 생성 억제작용 등의 항산화 작용, 면역 조절작용, 항 알레르기 작용을 갖는 기능성 식품 또는 음료로서 유용하고, 암환자나 바이러스성 질환 환자의 병변 세포에 아포토시스를 유발시켜 이것들의 질환의 예방, 증상개선에 유효한 식품 또는 음료가 제공된다. 특히, 대장암, 위암 등 소화기계의 암의 경우, 본 발명의 상기 화합물을 식품, 음료로서 경구적으로 섭취함으로써 암세포에 아포토시스를 일으킬 수 있기 때문에, 본 발명의 식품 또는 음료는 소화기계 암의 예방, 증상 개선에 우수한 효과를 갖고 있다. 또한, 그 활성 산소 생성 억제작용 등의 항산화 작용에 의해 상기의 식품 또는 음료는 항산화 스트레스용 식품 또는 음료로서도 우수하다.
또한 본 발명의 기능성 물질은, 활성 산소 생성 억제용의 항산화용 당으로서 유용하고, 본 발명의 항산화용 당을 함유, 희석 및/또는 첨가하여 이루어지는 식품 또는 음료는 활성 산소 등의 생체내 산화물질이 기인이 되는 질병의 증상 개선용 식품 또는 음료로서 유용하다. 또한, 본 발명의 식품 또는 음료는 그 유효 성분인 3,6-안히드로갈락토피라노스 또는 그 알데히드체 또는 그것들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및/또는 그 화합물을 함유하는 당 화합물의 작용에 의해, 변비개선 또는 예방에 효과를 갖는다.
본 발명에 의해 제공되는 항산화용 당은 식품 또는 음료에 활성 산소 생성 억제작용 등의 항산화성을 부여하는 신기능성 당 화합물로서 유용하다.
또한, 본 발명의 기능성 물질은 선도 유지효과를 갖고, 식품, 신선물의 맛이나 선도의 유지에 매우 유용하다.
또한, 본 발명의 당 화합물을 함유하는 화장료는 미백용, 보습용 화장료로서 유용하다.
본 발명에 의하면, 해당 기능성 물질을 함유, 희석 및/또는 첨가하여 이루어지는 산성식품 또는 산성음료도 제공되지만, 그 식품 또는 음료의 제조방법에 있어서는, 그 기능성 물질의 함량에 영향을 미치게 하는 인자가 실질적으로 제거되어 있어 매우 유용성이 높은 기능성 물질의 고함유 식품 또는 고함유 음료가 얻어진다. 또한, 유기산 존재하에서 제조되는 산미료도 정미(呈味)성, 기능성이 우수한 신규 산미료로서 유용하다.

Claims (30)

  1. 화학식 (1)로 표시되는 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그의 알데히드체, 그의 포수체 및 그들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 유효 성분으로서 포함하는, 알레르기성 질환, 홍반성 루푸스, 면역매개성 사구체 신장염, 다발성 경화증, 교원병, 자기면역 질환, 류마티즘, 염증성 질환, 당뇨병, 암, 동맥경화, 신경질환, 허혈재관류 장애, 독성 쇼크나 어느 종류의 사이토카인에 의한 치료 등에 의한 전신성 혈압 저하, 혈압 응답 저하, 관절염, 류마티스성 관절염, 염증성 장질환, 혈관기능부전, 병인성 혈관확장, 조직손상, 심장혈관계 허혈, 통감 과민증, 뇌허혈, 혈관신생을 수반하는 질병, 기관지천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 화분증, 담마진(hives), 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염의 치료 또는 예방용 의약조성물.
    <화학식 1>
    Figure 112005027479345-pct00007
  2. 제 1 항에 있어서, 당 화합물이 한천, 아가로스 및 카라기난으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 물질을 pH 7 미만의 산성 조건하에서의 산 분해, 효소 분해 또는 산 및 효소 분해시켜 얻은 것인 의약조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 당 화합물이 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 당 화합물인 의약조성물.
  5. 삭제
  6. 화학식 (1)로 표시되는 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그의 알데히드체, 그의 포수체 및 그들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 환원 말단에 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 함유, 첨가, 희석 또는 첨가 및 희석하여 이루어지는, 알레르기성 질환, 홍반성 루푸스, 면역매개성 사구체 신장염, 다발성 경화증, 교원병, 자기면역 질환, 류마티즘, 염증성 질환, 당뇨병, 암, 동맥경화, 신경질환, 허혈재관류 장애, 독성 쇼크나 어느 종류의 사이토카인에 의한 치료 등에 의한 전신성 혈압 저하, 혈압 응답 저하, 관절염, 류마티스성 관절염, 염증성 장질환, 혈관기능부전, 병인성 혈관확장, 조직손상, 심장혈관계 허혈, 통감 과민증, 뇌허혈, 혈관신생을 수반하는 질병, 기관지천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 화분증, 담마진(hives), 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염의 증상 개선용 또는 그 질환의 예방용 식품 또는 음료.
    <화학식 1>
    Figure 112005065239015-pct00051
  7. 제 6 항에 있어서, 당 화합물이 한천, 아가로스 및 카라기난으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 물질을 pH 7 미만의 산성 조건하에서의 산 분해, 효소 분해 또는 산 및 효소 분해시켜 얻은 것인 식품 또는 음료.
  8. 삭제
  9. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 당 화합물이 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 당 화합물인 식품 또는 음료.
  10. 삭제
  11. 화학식 (1)로 표시되는 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그의 알데히드체, 그의 포수체 및 그들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화제.
    <화학식 1>
    Figure 112005065239015-pct00052
  12. 제 11 항에 있어서, 당 화합물이 한천, 아가로스 및 카라기난으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 물질을 pH 7 미만의 산성 조건하에서의 산 분해, 효소 분해 또는 산 및 효소 분해시켜 얻은 것인 항산화제.
  13. 삭제
  14. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 당 화합물이 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 당 화합물인 항산화제.
  15. 삭제
  16. 제 11 항 또는 제 12 항에 따른 항산화제를 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 음료.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 화학식 (1)로 표시되는 3,6-안히드로갈락토피라노스, 그의 알데히드체, 그의 포수체 및 그들의 2-O-메틸화체로부터 선택되는 화합물 및 그 화합물을 함유하는 가용성의 당 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 변색, 부패, 산화 방지에 있어서의 선도 유지제.
    <화학식 1>
    Figure 112005065239015-pct00053
  21. 제 20 항에 있어서, 당 화합물이 한천, 아가로스 및 카라기난으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 물질을 pH 7 미만의 산성 조건하에서의 산 분해, 효소 분해 또는 산 및 효소 분해시켜 얻은 것인 선도 유지제.
  22. 삭제
  23. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 당 화합물이 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 당 화합물인 선도 유지제.
  24. 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 당 화합물을 유효 성분으로 포함하는 미백용 화장료.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스, κ-카라비오스 및 β-D-갈락토피라노실-3,6-안히드로-2-O-메틸-L-갈락토스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 당 화합물을 유효 성분으로 포함하는 항산화용 화장료.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
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