CN105745329B

CN105745329B - 3,6-脱水-l-半乳糖的制备方法及其用途

Info

Publication number: CN105745329B
Application number: CN201380007372.0A
Authority: CN
Inventors: 金京宪; 崔仁杰; 姜南朱; 尹银珠; 李世荣; 金智惠; 金荣阿; 金俌陪; 白恩知
Original assignee: Korea University Research and Business Foundation
Current assignee: Korea University Research and Business Foundation
Priority date: 2012-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2033-01-18
Also published as: JP2015505323A; KR101525298B1; KR101573651B1; US10071041B2; KR20130085017A; US20170360671A1; CN105745329A; US20150216778A1; KR20150039159A; CN111544437A; US20170071841A1; JP6022603B2; US10639261B2; US20180344607A1; JP2016188251A

Abstract

本发明涉及用于制备3,6‑脱水‑L‑半乳糖的方法及3,6‑脱水‑L‑半乳糖的用途。更具体地，通过化学和酶的方法制备高产量的作为组成琼脂的单糖的3,6‑脱水‑L‑半乳糖，而且展示出3,6‑脱水‑L‑半乳糖的生理活性，如美白、保湿、抗氧化、抗炎症活性等，从而使之应用于工业上。

Description

3,6-脱水-L-半乳糖的制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及通过化学和酶方法所制备的3,6-脱水-L-半乳糖、以及通过利用3,6-脱水-L-半乳糖的生理功效的工业用途。

背景技术

琼脂(或琼脂糖)为组成红藻类的主要的多糖，其为两种单糖，即3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖，通过α-1,3键与β-1,4键交叉相连而形成的聚合物。众所周知，通过使用化学催化剂如盐酸、硫酸和乙酸来非特异性地水解琼脂糖而生成的琼脂寡糖(Agarooligosaccharide)能够展示优异的生理活性，如抗氧化、抗炎、抗癌、增白和抗过敏的活性。基于这些多种生理活性，琼脂寡糖和作为双糖的新琼脂二糖(Neoagarobiose)已被广泛地用作食品和美容产业中的功能性物质。

作为组成所述琼脂寡糖的单糖之一的3,6-脱水-L-半乳糖存在以下问题：由于3,6-脱水-L-半乳糖具有不稳定的还原端，并且在存在高浓度强酸的高温反应条件下易被转化成羟甲基糠醛，通过常用的化学处理方法所生成的作为单糖的3,6-脱水-L-半乳糖的产率极低，而且容易被过度降解(Jol et al(1999)Anal Biochem.268,213-222,Kim et al(2010)Bull Korean Soc.31(2)511-514)。此外，虽然使用化学处理的水解具有以下优点，如由于生产成本低且处理条件简单，可容易应用于商业化，然而还存在以下问题，即由于所述化学处理会非特异性地切断连接键，当特异性连接键被切断而获得产品时所生成的期望产品的产率极低(Chen et al(2005)Food Technol Biotechnol.43(1)29-36)。进一步，近年来有报道过通过特异性地切断3,6-脱水-L-半乳糖中的键合来生成单糖的酶，然而尚未出现从反应产物中仅分离、提纯及定量3,6-脱水-L-半乳糖的研究。

发明内容

技术问题

因此，本发明在于，提供能够最大程度降低由化学处理引起的过度降解效果并通过酶降解制备高产率的3,6-脱水-L-半乳糖的方法。

此外，本发明在于，通过查明3,6-脱水-L-半乳糖的生理活性并使之应用于工业上。

技术方案

根据本发明的一方面，本发明提供用于制备3,6-脱水-L-半乳糖的方法，该方法包括：通过使琼脂糖与弱酸在浓度为0.5-60％(w/v)、温度为40-150℃、旋转速度为100-200rpm的条件下反应30分钟～6个小时来制备琼脂寡糖；以及，使该琼脂寡糖与琼脂糖降解酶和新琼脂二糖水解酶在温度为20-40℃、旋转速度为0-200rpm的条件下反应30分钟～7天。

此时，所述琼脂糖降解酶可以为一种能够切断琼脂糖的D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖之间的β-1,4-糖苷键的酶。更具体地，所述琼脂糖降解酶可由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列表示。

所述新琼脂二糖水解酶可由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列表示。

根据一个示例性实施例，所述琼脂糖降解酶和新琼脂二糖水解酶可源自降解糖噬糖菌(Saccharophagus degradans，S.degradans)2-40。

根据一个示例性实施例的用于制备3,6-脱水-L-半乳糖的方法可进一步包括：通过对所述3,6-脱水-L-半乳糖依次进行吸附层析和凝胶渗透层析来分离及提纯所述3,6-脱水-L-半乳糖。

根据本发明的另一方面，本发明提供包含3,6-脱水-L-半乳糖的用于皮肤美白或保湿的化妆品组合物。

根据本发明的又一方面，本发明提供3,6-脱水-L-半乳糖在皮肤美白或保湿中的美容用途。

根据本发明的又一方面，本发明提供包含3,6-脱水-L-半乳糖的用于预防或治疗皮肤色素沉着症的药物组合物。

根据本发明的又一方面，本发明提供3,6-脱水-L-半乳糖在制备用于预防或治疗皮肤色素沉着症的药物组合物中的用途。

根据本发明的又一方面，本发明提供用于美白或保湿有需要皮肤美白或保湿的哺乳动物的，优选地有需要皮肤美白或保湿的人的美容或医疗方法。其中，所述美容或医疗方法包括：将有效量的3,6-脱水-L-半乳糖，优选地将有效量的包含3,6-脱水-L-半乳糖的药物或化妆品组合物进行给药。

根据本发明的又一方面，本发明提供用于治疗与色素沉着的调节相关的皮肤的病态、疾病和/或病变的美容或医疗方法。其中，所述方法包括：将包含3,6-脱水-L-半乳糖的药物或化妆品组合物涂敷于皮肤上，而且所述病态、疾病和/或病变可以是由于黑色素合成的增加而局部发生的，且其可以为选自黄褐斑、雀斑、雀斑样痣、母斑、由药物引起的色素沉着、炎症后色素沉着、发生于皮炎上的过度色素沉着中的至少一种。

根据本发明的又一方面，本发明提供包含3,6-脱水-L-半乳糖的用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物。

根据本发明的又一方面，本发明提供用于治疗动物的炎症性疾病的方法。其中，该方法包括：将包含药学有效量的3,6-脱水-L-半乳糖的用于预防或治疗炎症性疾病的组合物向受试者进行给药。

根据本发明的又一方面，本发明提供3,6-脱水-L-半乳糖在制备用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物中的用途。

有益效果

根据本发明的实施例，通过在最大程度降低根据化学处理的过度降解效果的温和化学处理条件下制备低聚糖并使之经过酶处理生成高产率的作为单糖的3,6-脱水-L-半乳糖。

此外，根据本发明，3,6-脱水-L-半乳糖的生理活性，如美白、保湿、抗氧化及抗炎症的活性，首次得到验证，从而使之用于包括食品、化妆品、药品等各种领域中。因此，在生产红藻源性生物能源时被认可为副产物或发酵抑制物质的3,6-脱水-L-半乳糖可应用于生产生物能源领域中具有高附加值的物质。

附图说明

图1为说明根据本发明一个实施例的从琼脂糖中制备3,6-脱水-L-半乳糖的过程的图表。在图1中，DP表示多糖的聚合度。

图2展示了从琼脂糖中制备并提纯3,6-脱水-L-半乳糖的过程中获得的薄层层析(TLC)。在该处理步骤中，道1表示琼脂糖，道2表示醋酸水解物，道3表示Aga50D反应产物，道4表示sdNABH反应产物，道5表示通过硅胶层析法分离出的3,6-脱水-L-半乳糖，道6表示通过生物凝胶P2层析法提纯的3,6-脱水-L-半乳糖，Y轴的AHG表示3,6-脱水-半乳糖，以及NAB表示新琼脂二糖。

图3展示了作为提纯3,6-脱水-L-半乳糖过程中的第一步的硅胶层析-TLC的结果。在图3中，AHG表示3,6-脱水-半乳糖。

图4展示了(a)D型3,6-脱水-半乳糖的标准物质和(b)根据本发明的一个示例性实施例所提纯的3,6-脱水-L-半乳糖的GC/MS总离子色谱图。

图5展示了根据本发明的一个示例性实施例所分离并提纯的3,6-脱水-L-半乳糖的氢核磁共振波谱(¹H NMR)分析结果。

图6展示了根据本发明的一个示例性实施例所分离并提纯的3,6-脱水-L-半乳糖的2D-HSQC NMR分析结果。

图7展示了3,6-脱水-L-半乳糖、新琼脂二糖、D-半乳糖和3,6-脱水-D-半乳糖的美白活性。在图7中，α-MSH表示α-促黑素细胞激素，NAB表示新琼脂二糖，以及D-AHG和L-AHG则分别表示D型和L型的3,6-脱水-半乳糖。

图8展示了3,6-脱水-L-半乳糖、新琼脂二糖、D-半乳糖和3,6-脱水-D-半乳糖的抗氧化活性。

图9展示了在HEMs中L-AHG对由α-MSH诱导的酪氨酸酶表达的影响。其中，图9A展示了根据L-AHG浓度进行处理后被暴露于α-MSH的细胞中的酪氨酸酶表达的结果，以及图9B展示了将图9A的结果图示为对β-肌动蛋白的酪氨酸酶相对强度的示意图。

图10展示了在HEMs中L-AHG对由α-MSH诱导的TRP-1表达的影响。其中，图10A展示了根据L-AHG浓度进行处理后被暴露于α-MSH的细胞中的TRP-1表达的结果，以及图10B展示了将图10A的结果图示为对β-肌动蛋白的TRP-1相对强度的示意图。

图11展示了L-AHG对体外酪氨酸酶活性的影响。

图12展示了在人角质细胞中L-AHG对HAS2表达的影响。其中，图12A展示了根据经过的时间用100μg/mL的L-AHG处理后的HAS2表达水平，以及图12B展示了根据L-AHG浓度进行处理后的HAS2表达水平。

图13展示了在人角质细胞中L-AHG对ERK磷酸化的影响。其中，图13A展示了根据经过的时间用100μg/mL的L-AHG处理后的ERK磷酸化结果，以及图13B展示了根据L-AHG浓度进行处理后的ERK磷酸化结果。

图14展示了在人角质细胞中L-AHG对AKT磷酸化的影响。其中，图14A展示了根据经过的时间用100μg/mL的L-AHG处理后的AKT磷酸化结果，以及图14B展示了根据L-AHG浓度进行处理后的AKT磷酸化结果。

具体实施方式

下面，进一步详细地说明本发明的示例性实施例。

本发明涉及用于制备3,6-脱水-L-半乳糖的方法，该方法包括：通过使琼脂糖与弱酸在浓度为0.5-60％(w/v)、温度为40-150℃、旋转速度为100-200rpm的条件下反应30分钟～6个小时来制备琼脂寡糖；以及，使该琼脂寡糖与琼脂糖降解酶和新琼脂二糖水解酶在温度为20-40℃、旋转速度为0-200rpm的条件下反应30分钟～7天。

本发明的一个示例性实施例的用于制备3,6-脱水-L-半乳糖的方法，其特征在于，在使用弱酸的温和条件下水解琼脂糖，使从酸水解中分离出的琼脂寡糖与能够生成双糖的外切型(exo-type)琼脂糖降解酶进行反应而生成新琼脂二糖，然后与新琼脂二糖水解酶进行加成反应生成作为单糖的半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖。

所述3,6-脱水-L-半乳糖可具有由下列化学式所表示的化学式1：

【化学式1】

如图1所示，通过参考制备3,6-脱水-L-半乳糖的过程，进一步详细地说明本发明的方法。

第一步，通过使琼脂糖与弱酸反应来制备琼脂寡糖。

所述弱酸可以为选自乙酸、甲酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸和草酸中的至少一种弱酸，而且其可以单独使用或混合使用。

根据考虑生产单价及经弱酸中和后所生成的盐的分离，所述弱酸可用0.5-60％(w/v)浓度。更具体地，所述弱酸可用20-40％(w/v)浓度。

所述弱酸与琼脂糖的反应是在温度为40-150℃、旋转速度为100-200rpm的条件下进行30分钟～6个小时。在此范围内，可最大程度降低由所述弱酸引起的琼脂糖的过度降解产物的形成。

在所述反应后所得的反应产物为琼脂寡糖，通过清洗可去除所述过度降解产物及剩余弱酸，然后进行干燥，而获得粉末状琼脂寡糖。

作为所述清洗溶剂，可使用C1-6低级醇，但本发明不限于此。

第二步，通过所述琼脂寡糖的酶降解制备3,6-脱水-L-半乳糖。其中，所述酶降解过程如下：通过用外切型琼脂糖降解酶处理所述琼脂寡糖来生成作为双糖的新琼脂二糖，然后通过用新琼脂二糖水解酶处理所述新琼脂二糖，使所述新琼脂二糖降解为D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖。

所述酶促反应可以在温度为20-40℃、旋转速度为0-200rpm的条件下进行30分钟～7天。

下面，将进一步说明所述酶促反应。

首先，能够切断琼脂糖的D-半乳糖与3,6-脱水-L-半乳糖之间的β-1,4-糖苷键的酶(以下统称为“Aga50D”)可用作所述琼脂糖降解酶，所述琼脂糖降解酶是通过降解琼脂寡糖来生产所述作为双糖的新琼脂二糖的。

所述琼脂糖降解酶可包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，并包含与所述如SEQID NO:1所示的氨基酸序列具有80％或以上、85％或以上、90％或以上，93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上及99％或以上的序列同源性的氨基酸序列。

在本发明中，多肽与另一序列具有特定百分比(如80％、85％、90％、95％或99％)的序列同源性是指，将所述序列相互对准时，根据序列的对比，两个序列具有任一百分比相同的氨基酸残基。对准和百分比同源性或同一性可以使用相关领域中已知的任何合适的软件程序确定，例如，可通过在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel,etal.,(eds)1987Supplement 30section 7.7.18)中所述的内容来确定。优选的程序包括GCGPileup程序，如FASTA(Pearson,et al.,1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-2448)和BLAST(BLAST Manual,Altschul et al.,Natl.Cent.Biotechnol.Inf.,Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH),Bethesda,MD.,and Altschul et al.,1997NAR25:3389-3402)。另一优选的对准程序有ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,PA)，其会优选使用基本参数。这里可使用的又一优选序列软件程序有TFASTA数据搜索程序(TFASTA DataSearching program)，能在Sequence Software Package Version 6.0(GeneticsComputer Group,University of Wisconsin,Madison WI)上运行。

在本说明书中，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。在本说明书中，对氨基酸残基使用通常的单字母或三字母密码。

所述酶可源自降解糖噬糖菌(S.degradans)2-40，但本发明不限于此。

所述酶可通过编码基因被转录并翻译，所述编码基因为与生成包含该酶编码区的区域上游和下游及单个编码片段之间的间插序列(intervening sequence)的多肽相关的DNA片段。例如，所述酶可具有如SEQ ID NO:2所示的序列，但本发明不限于此。

本发明一个示例性实施例的琼脂糖降解酶可以从所述降解糖噬糖菌培养肉汤的上清液中得到分离并提纯的，而且可以通过利用基因重组技术，在没有降解糖噬糖菌的菌株中生产并分离所述琼脂糖降解酶，或者可以通过利用人工化学合成方法，生产并分离所述琼脂糖降解酶。

当利用所述重组技术时，可使用用来促进常用重组蛋白的表达的因素，如抗生素耐药基因和能用于亲和柱层析的报告蛋白或肽。这种技术落入本发明所属的技术领域的技术人员可容易实施的范围内。此外，可用所述降解糖噬糖菌培养肉汤的上清液来代替本发明一个示例性实施例的琼脂糖降解酶，或者可用食用菌株培养液的上清液，如通过转化酵母菌株而获得的经转化的酵母菌株，来代替所述琼脂糖降解酶。

在本发明中，相关细胞、核酸、蛋白质或载体(vector)时用到的术语“重组”是指，所述细胞、核酸、蛋白质或载体(vector)是通过导入异构核酸或蛋白质，或改变固有的核酸或蛋白质而被改变的，亦或所述细胞源自这种经变形的细胞。亦即，所述重组细胞，例如可表达在原始非重组形式的细胞中未被发现的基因，或可表达在表达时异常表达或完全没有表达的原始基因。

在本发明中，术语“核酸”包括单链或双链的DNA、RNA及其化学变异体的所有种类。这里，所述术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用。由于所述遗传密码被简并，一个或以上的密码子可用于编码一个特定的氨基酸，而本发明包含能够编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。

将核酸序列插入细胞时所用的术语“导入”是指“转染”、“转化”或“转导”，并且包括关于核酸序列向真核或原核细胞内的整合。此时，所述核酸序列整合到细胞的基因组(如染色体、质粒、色素细胞或线粒体DNA)中，而转化成能够独立复制的复制子，或进行暂时表达。

所述琼脂寡糖与琼脂糖降解酶的反应可在温度为20-40℃、旋转速度为0-200rpm的条件下进行30分钟～7天。更具体地，此反应可在温度为25-35℃、旋转速度为100-150rpm的条件下进行1～4天。

当所述琼脂寡糖处于粉末状时，所述琼脂寡糖可溶解于常用的缓冲液中，但本发明不限于此。

其次，所述新琼脂二糖水解酶可以为具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的蛋白质以及在所述酶中具有至少一个取代、缺失、易位和添加的突变蛋白质，该新琼脂二糖水解酶能够使通过酶促反应所生成的新琼脂二糖降解为D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖。具有所述新琼脂二糖水解酶活性的蛋白质也被包含在本发明一个示例性实施例的酶的范围内，优选地，所述蛋白质所具有的氨基酸序列与如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有序列同源性80％或以上、85％或以上、90％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上和99％或以上(以下统称为“sdNABH”)。

所述酶可选自降解糖噬糖菌2-40，但本发明不限于此。

所述酶可通过编码基因被转录并翻译，所述编码基因为与生成包含该酶编码区的区域上游和下游、以及单个编码片段之间的间插序列的多肽相关的DNA片段。例如，所述酶可具有如SEQ ID NO:4所示的序列，但本发明不限于此。

所述新琼脂二糖水解酶可从所述降解糖噬糖菌培养肉汤的上清液中得到分离及提纯，而且可以通过利用基因重组技术，在没有降解糖噬糖菌的菌株中生产并分离所述新琼脂二糖水解酶，或者可以通过利用人工化学合成方法，生产并分离所述新琼脂二糖水解酶。

当利用所述重组技术时，可使用用来促进常用的重组蛋白的表达的因素，如抗生素耐药基因和可用于亲和柱层析的报告蛋白或肽。这种技术落入本发明所属的技术领域的技术人员可容易实施的范围内。此外，可用所述降解糖噬糖菌培养肉汤的上清液代替本发明一个示例性实施例的新琼脂二糖水解酶，或者可用食用菌株培养肉汤的上清液，如通过转化酵母菌株而获得的经转化的酵母菌株，代替所述新琼脂二糖水解酶。

所述新琼脂二糖与新琼脂二糖水解酶的反应可在温度为20-40℃、旋转速度为0-200rpm的条件下进行30分钟～7天。更具体地，此反应可在温度为25-35℃、旋转速度为100-150rpm的条件下进行1～4天。

此外，本发明一个示例性实施例的用于制备3,6-脱水-L-半乳糖的方法，可进一步包括：从新琼脂二糖的降解产物中仅分离及提纯3,6-脱水-L-半乳糖。

通过依次进行作为吸附层析的硅胶层析和作为凝胶渗透层析的生物凝胶P2层析，可分离及提纯约96％的高纯度3,6-脱水-L-半乳糖。

对所述提纯产物进行¹H-NMR和2D-HSQC NMR分析，然后通过比较之前报道过的3,6-脱水-L-半乳糖的¹H ppm和¹³C ppm，鉴定所述经提纯产物的结构。

在本发明一个示例性实施例的制备方法中，通过化学水解，从100g琼脂糖中可产生出76g所述琼脂寡糖，而且通过使用所述Aga50D和sdNABH酶可分别产生37.55g所述新琼脂二糖和15.21g所述3,6-脱水-L-半乳糖。此外，通过利用两种层析法的提纯过程，可提纯3.98g的纯3,6-脱水-L-半乳糖。

本发明还涉及包含3,6-脱水-L-半乳糖的用于皮肤美白或保湿的化妆品组合物。

进一步，本发明在于提供3,6-脱水-L-半乳糖在皮肤美白或保湿中的美容用途。

所述3,6-脱水-L-半乳糖与广泛所知的用作常用美白物质的熊果苷相比具有更高的美白活性，而且具有以浓度依赖性方式抑制与促进黑色素合成相关的酪氨酸酶、TRP-1等的表达的效果。

根据本发明一个示例性实施例，经体外酪氨酸酶活性测试显示，所述3,6-脱水-L-半乳糖是通过抑制所述酶的表达来展示美白效果的，而不是通过抑制所述酪氨酸酶活性来展示美白效果。

此外，所述3,6-脱水-L-半乳糖具有促进HAS2蛋白的表达的效果，而HAS2为与透明质酸合成相关的保湿标记。

根据本发明一个示例性实施例，通过各种炎症信号转导通路如ERK和AKT，可调节所述HAS2蛋白的表达。其中，所述3,6-脱水-L-半乳糖可提高ERK和AKT的磷酸化，而高度磷酸化的ERK和AKT可提高所述HAS2蛋白的表达。

只要所述3,6-脱水-L-半乳糖是通过利用本发明一个示例性实施例的用于制备3,6-脱水-L-半乳糖的方法来合成或制备的，就能不受限地使用所述3,6-脱水-L-半乳糖。

基于有效量，可提供一种化妆品制剂或化妆品，该化妆品制剂或化妆品包含所述3,6-脱水-L-半乳糖本身或通过混合美容学上可接受的载体和所述3,6-脱水-L-半乳糖而获得的混合物的化妆品制剂或化妆品。此时，所述化妆品制剂或化妆品可被制成典型的乳化和增容性剂型。在所述乳化剂型中，所述化妆品包括乳液、霜、精华液等，而在所述增容性剂型中，所述化妆品可以为调理液(toner)。所述化妆品的适当的剂型可有，如溶液、凝胶、固体或糊状无水产物、通过在水相中分散油而所获的乳剂、悬浮剂、微乳剂、微胶囊剂、微粒剂或离子(脂质体)型或非离子型的囊泡分散剂，或者还可有霜剂、调理液、乳液、粉剂、软膏剂、喷雾剂或遮瑕棒。

此外，所述化妆品的剂型可被制成泡沫剂、或进一步包含经压缩的推进剂的气溶胶组合物。

此时，用于制备上述形式的化妆品的方法和所述载体对本领域的技术人员来说是显而易见的，从而为了简明在此省略了对用于制备化妆品的方法的具体说明。

除了本发明一个示例性实施例的3,6-脱水-L-半乳糖，所述化妆品可包含在美容学领域中常用的辅助剂，如脂肪物质、有机溶剂、溶解剂、浓缩剂、胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、助悬剂、稳定剂、起泡剂、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、金属离子螯合剂和螯合剂、防腐剂、维生素、阻滞剂、保湿剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲脂性活性剂、脂质囊泡或其他在化妆品中常用的成分。

当所述3,6-脱水-L-半乳糖用于食品或用作食品添加剂时，可加入所述3,6-脱水-L-半乳糖本身或可与其他食品或食品成分一同使用。此时，通过常用方法，可适当地使用所述3,6-脱水-L-半乳糖。根据使用目的(预防、保健或治疗)，可确定所述混合活性成分的量。通常，在制备食品时，可加入占所述活性成分总重量的15wt％或以下、优选为10wt％或以下的本发明一个示例性实施例的组合物。然而，当为了保健和卫生或为了调理健康而长时间摄入所述3,6-脱水-L-半乳糖时，所述混合活性成分的量可低于或等于上述含量。由于所述混合活性成分不存在安全性隐患，所述活性成分还可使用上述范围内或以上的含量。

本发明还在于提供用于预防或治疗皮肤色素沉着症的药物组合物，该药物组合物包含3,6-脱水-L-半乳糖。

此外，本发明在于提供3,6-脱水-L-半乳糖在制备用于预防或治疗皮肤色素沉着症的药物组合物中的用途。

本发明一个示例性实施例的药物组合物可进一步包含适当的常用于制备药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂。

根据常用方法，本发明一个示例性实施例的药物组合物可制成外用制剂，如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳液、糖浆和气溶胶，以及可制成无菌可注射溶液。优选地，所述药物组合物可以霜、凝胶、贴剂、喷雾剂、软膏、石膏、乳液、搽剂、糊剂或巴布剂(cataplasma)。

在本发明一个示例性实施例的药物组合物中可包含的所述载体、赋形剂和稀释剂，可以包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、低聚糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶(acacia gum)、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。

当制成剂型时，可通过使用广泛用于本领域的稀释剂或赋形剂，如填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等，来制备所述药物组合物。

用于口服的固体制剂可包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊等。这种固体制剂可通过混合至少一种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶和上述组合物来进行制备。除了上述简单的赋形剂外，还可使用润滑剂，如硬脂酸镁和滑石粉。用于口服的液体制剂可包括悬浮剂、供内部使用的液体、乳剂、糖浆等。除了广泛使用的简单的赋形剂如水和液体石蜡外，所述液体制剂可包括各种赋形剂，如润湿剂、增甜剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外给药的制剂可包括灭菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂、栓剂等。作为所述非水溶剂和悬浮剂，可使用植物油，如丙二醇、聚乙二醇或橄榄油，或者可使用可注射酯类，如油酸乙酯。作为所述栓剂的基底物，可使用Witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。

本发明一个示例性实施例的药物组合物可以为能够涂抹于皮肤的皮肤外用制剂。此时，所述药物组合物可制备成外用液体形式，如霜剂、凝胶剂、贴剂、喷雾剂、软膏、石膏、洗剂、搽剂、糊剂或巴布剂，但本发明不限于此。

本发明一个示例性实施例的药物组合物的期望剂量可根据患者的状态和体重、疾病的严重程度、药物类型及给药途径和期间而有所不同，但可被本领域的技术人员适当选取。然而，为了展示所期望的药用功效，本发明一个示例性实施例的组合物的每日给药剂量可以为0.0001-100mg/kg，优选为0.001-10mg/kg。所述外用液体可一天给药一次或几次。所述剂量在任何方面都不受本发明范围的限制。

此外，本发明涉及用于有需求皮肤美白或保湿的哺乳动物的，优选为人的皮肤的美白或保湿的美容或医疗方法，该美容或医疗方法。其中，所述美容或医疗方法包括：将有效量的3,6-脱水-L-半乳糖，优选地将有效量的包含3,6-脱水-L-半乳糖的药物或化妆品组合物进行给药。

此外，本发明涉及用于治疗与色素沉着调节有关的皮肤的病态、疾病和/或病变的美容或医疗方法。其中，该方法包括：将包含3,6-脱水-L-半乳糖的药物或化妆品组合物涂敷于皮肤上，而且所述病态、疾病和/或病变可以因黑色素合成的增加而发生于局部上，且其可以为选自黄褐斑、雀斑、雀斑样痣、母斑、由药物引起的色素沉着、炎症后色素沉着、发生于皮炎上的过度色素沉着中的至少一种。

所述包含3,6-脱水-L-半乳糖的药物或化妆品组合物的涂敷频率可根据每个受试者的需要而不同。例如，建议所述涂敷频率可为一个月10次～一天10次，优选为一周4次～一天4次，更优选地一周3次～一天3次，又最优选地一天1次或2次。

此外，本发明涉及所述3,6-脱水-L-半乳糖在制备用于皮肤的治疗、护理和/或清洁的药物或化妆品组合物中的用途，所述皮肤优选为脸部、颈部、颈纹、手部、腋窝，腹股沟，肘部和/或膝部，更优选为脸部、颈部和/或手部的局部区域。

进一步，本发明涉及包含3,6-脱水-L-半乳糖的用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物。

此外，本发明涉及用于治疗动物的炎症性疾病的方法，该方法包括：将包含药学有效量的3,6-脱水-L-半乳糖的用于预防或治疗炎症性疾病的组合物进行给药。

更进一步，本发明涉及所述3,6-脱水-L-半乳糖在制备用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物中的用途。

所述3,6-脱水-L-半乳糖具有抗氧化活性而能抑制亚硝酸盐(NO₂)的产生，由于所述3,6-脱水-L-半乳糖与D型3,6-脱水-半乳糖以及另一种组成红藻的双糖和单糖，如新琼脂二糖和半乳糖相比时具有最高抗氧化活性，从而所述3,6-脱水-L-半乳糖可用于用来预防或治疗炎症性疾病的药物组合物上(见图8)。

由于所述用于治疗炎症性疾病的方法中的药物组合物及其给药方法已在上面叙述，在此省略对于所述药物组合物和给药方法的重复说明。此外，用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物的给药对象可包括所有种类的动物。例如，所述对象可以为除人以外的动物，其包括狗、猫、鼠等。

在所述药物组合物中活性成分的有效量是指，治疗疾病所需的量。因此，所述活性成分的有效量可根据各种因素，如疾病种类、疾病的严重程度、所述活性成分的种类和含量以及包含于组合物中的其他成分、剂型种类、年龄、体重、一般的身体状况、性别、和患者的饮食、给药的时间和途径，所述组合物的分泌速率、治疗的持续时间、和同时使用的药物，可进行调节。

此外，术语“治疗”是指缓解症状，暂时或永久地去除症状的起因，或者减轻或预防所述病症、障碍或疾病的发病和进展，但本发明不限于此。

实施例

下面，结合以下优选实施例，将进一步详细说明本发明。然而，可知以下实施例仅用于说明本发明为目的，而不会限制本发明的范围。

<实施例1>通过使用乙酸的琼脂糖的水解

用乙酸水解作为组成红藻的代表性多糖的琼脂糖。在80℃下，5％(w/v)与3M乙酸反应70分钟，然后干燥并去除乙酸。此外，去除通过用乙醇的清洗过程并干燥后残留下的乙酸和水解时能够产生的过度降解产物，而生产纯粉末状琼脂寡糖(图2)。

<实施例2>通过使用Aga50D和sdNABH的3,6-脱水-半乳糖的生产为了将实施例1中产生的酸水解物降解为作为单糖的D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖，将所述酸水解物与作为外切型双糖产生酶的Aga50D(见韩国专利公布号2010-0040438)进行反应，而生产作为反应产物的新琼脂二糖。

当与Aga50D的反应完毕后，将所述Aga50D反应产物与sdNABH酶(见韩国专利公布号2010-0108241)进行反应，以从所述新琼脂二糖生产作为单糖的D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖。所述酶促反应的条件如下：在100mL的50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)中溶解5％(w/v)琼脂寡糖，然后在30℃和150rpm反应三天。所述酶促反应中所用的酶的量分别为，Aga50D为10mg及sdNABH为2.5mg(图2)。

<实施例3>用硅胶层析和生物凝胶P2层析的分离和提纯

为了从实施例1和2中生产的反应产物中仅分离并提纯3,6-脱水-半乳糖，进行层析法。使所述反应产物吸附在硅藻土上而形成粉末状样品，然后进行作为吸附层析的硅胶层析。将通过以78:20:2(v/v/v)比例混合氯仿、甲醇和水而获得的溶剂作为流动相，所述作为流动相的溶剂的总容量为3L。每馏分的容量为20mL，通过TLC分析由共150馏分组成的样品。其中，收集含有3,6-脱水-半乳糖的馏分。由于接下来要进行的生物凝胶P2层析是根据分子量对物质进行分离的，在含有3,6-脱水-L-半乳糖的馏分中与3,6-脱水-半乳糖具有相似分子量的含有D-半乳糖的馏分要排除(图3)。

通过生物凝胶P2层析，从所述双糖和具有低聚合度的琼脂寡糖中只能提纯高纯度的3,6-脱水-L-半乳糖。这里使用的流动相为水，每馏分的容量为2mL。在相应的馏分中，仅收集能够在TLC上显示3,6-脱水-L-半乳糖斑点的馏分，以获得高纯度3,6-脱水-L-半乳糖(图2).

如图2所示，在实施例1-3中，从100g琼脂糖中，通过化学水解生产76g所述琼脂寡糖，而通过使用Aga50D和sdNABH酶分别生产37.55g的新琼脂二糖和15.21g的3,6-脱水-L-半乳糖。此外，通过两种层析提纯3.98g纯3,6-脱水-L-半乳糖。

此外，如图3所示，洗脱体积(L)的0.25-0.67L馏分中未观察到任何糖类，在0.77-1.77L馏分中观察到除3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖之外的糖(经浓缩后进行生物凝胶P2层析的样品)，并在1.87-2.67L馏分中观察到半乳糖和其他糖。

<实施例4>通过利用GC/MS分析的3,6-脱水-L-半乳糖的定性和定量通过GC/MS分析，对实施例3中产生的高纯度3,6-脱水-L-半乳糖进行定量。用于GC/MS分析的衍生化过程为如下。在真空离心干燥仪(Speed Vac)中，对所述高纯度样品进行干燥，并加入到50μl2％(w/v)的溶解在吡啶中的O-甲基羟胺盐酸盐中，然后在75℃下反应30分钟。而后，加入80μl的N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，在40℃和150rpm下反应30分钟。用于GC/MS分析的装置条件为如下。用来分析的色谱柱为DB5-MS毛细管柱。GC色谱柱温度条件为，首先在温度100℃下使样品维持3.5分钟，升温至160℃，而后维持20分钟。此后，使所述样品升温至200℃，维持15分钟，最后升温至280℃，然后维持5分钟。在分流比9.6下，分析1μl的所述样品(图4)。

<实施例5>通过¹H-NMR和2D HSQC NMR分析的3,6-脱水-L-半乳糖结构的鉴定为了鉴定在实施例1-3中所生产的高纯度3,6-脱水-L-半乳糖的化学结构，进行NMR分析。在D₂O中溶解2mg的3,6-脱水-L-半乳糖样品，然后为了计算化学位移，加入作为内部标准的3-(三甲基硅基)-丙-2,2,3,3-d4酸(3-(trimethylsilyl)-propionic-2,2,3,3-d4 acid)。可确定的是，通过¹H-NMR和2D HSQC NMR中的化学位移与先前所报道的文件中的最终结果(Sugano et al(1994)J Bacteriol.176(22)6812-6818,Miller et al(1982)Aust JChem.35(4)853-856)之间的对比，鉴定所述化学结构(图5和6)。

<实施例6>对经分离及提纯的3,6-脱水-L-半乳糖的美白和抗氧化活性的检测为了检测在实施例1-3中生产的高纯度3,6-脱水-L-半乳糖的美白活性，培养黑色素瘤细胞B16F10。用能够促进黑色素生成的激素，即α-促黑素细胞激素，进行处理前，分别用1μg/mL最广泛用作美白制剂的熊果苷、10μg/mL组成红藻的糖类(新琼脂二糖、D-半乳糖和3,6-脱水-D-半乳糖)以及100μg/mL的3,6-脱水-L-半乳糖处理所述黑色素瘤细胞，然后使所获反应混合物与所述α-促黑素细胞激素进行反应。待所述黑色素瘤细胞一同培养4天后，在475nm下测定所述黑色素瘤细胞的吸光度，而检测黑色素的含量。

结果显示，与其他经处理的组相比，所述3,6-脱水-L-半乳糖展示了非常优异的美白活性，而且实际上，与已知作为能够展示美白活性的功能性物质的熊果苷相比，所述3,6-脱水-L-半乳糖展示了更高的美白活性(图7)。

<实施例7>经分离及提纯的3,6-脱水-L-半乳糖的抗氧化活性

为了检测在实施例1-3中生产的高纯度3,6-脱水-L-半乳糖的抗氧化活性，通过使用Griess反应的方法，测定在RAW264.7细胞培养肉汤中的亚硝酸盐(NO₂)浓度。在用浓度为2μg/mL的脂多糖处理所述RAW264.7细胞的同时，分别用浓度为50、100和200μg/mL的新琼脂二糖、半乳糖、3,6-脱水-D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖进行处理。此后，一同处理所述RAW264.7细胞来检测抗氧化活性。待所述RAW264.7细胞一同培养24小时后，在540nm下测量所述RAW264.7细胞的吸光度，而检测抗氧化活性。

结果显示，与其他经处理的组相比，所述3,6-脱水-L-半乳糖展示了非常优异的抗氧化活性，而且实际上，与先前被报道的3,6-脱水-D-半乳糖相比，所述3,6-脱水-L-半乳糖展示了更高的抗氧化活性(图8)。

<实施例8>3,6-脱水-L-半乳糖在人表皮黑素细胞中的美白效果的实验黑色素是决定皮肤和头发的颜色的天然色素。黑色素的已知主要功能是由照射吸收和散射的紫外线造成的DNA损伤中保护皮肤。然而，过量黑色素的形成或异常分布会导致不规则的皮肤色素沉着，如黄褐斑、雀斑、老年性雀斑等。之前的研究表明，紫外线照射能够增加α-促黑素细胞激素(α-MSH)和促肾上腺皮质激素(ACTH)、及其相关受体，即黑素皮质素受体1(MC1R)的水平，从而促进包含酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白(的TRP)的黑色素生物合成酶的表达。作为含铜的糖蛋白的酪氨酸酶是，在特定细胞器官中，即仅在黑素细胞中产生的黑素小体中对黑色素的合成重要的限速酶。因此，认为酪氨酸酶表达的降低是用于抑制皮肤色素沉着的良好策略。

此外，TRP-1与酪氨酸酶在结构上有关联，具有约40％的氨基酸序列同源性，而且如同酪氨酸酶，存在于黑素小体中。据先前研究的报道，TRP-1的突变导致了皮肤或发色的苍白，这是在特定的眼皮肤白化病中观察到的。此外，有人提出，由于TRP-1表达的抑制与色素沉着不足有关，TRP-1在黑色素生物合成中能够发挥作用。

因此，检查了L-AHG对由α-MSH诱导的酪氨酸酶和TRP-1表达的影响，以评估L-AHG是否具有对皮肤示出美白活性的可能性。为此目的，使用经适当着色的源自新生儿表皮的人表皮黑素细胞(HEMs，Cascade Biologics(俄勒冈州，美国))。在37℃、含5％CO₂的保湿环境下，培养所述细胞。用于HEMS的培养基为添加有HMGS的培养基254(Cascade Biologics(俄勒冈州，美国))。

在6-cm培养皿中培养HEMs(1×10⁵)24小时。将HEMs数天暴露于100nM的α-MSH(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，MO，美国)之前，分别用浓度为0、25、50和100μg/mL的3,6-脱水-L-半乳糖(L-AHG)处理所述细胞1小时。然后，在溶解缓冲液[20mM的Tris-HCl(pH7.5)、150mM氯化钠、1mM的Na₂EDTA、1mM的EGTA、1％Triton X-100、2.5mM磷酸钠、1mM的β-甘油磷酸、1mM的Na₃VO₄、1g/mL亮肽素、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂混合物片剂(protease inhibitor cocktail tablet)]中溶解所述细胞。根据制造商的说明书，通过使用染料结合蛋白检测试剂盒来测定所述蛋白质的浓度(Bio-Rad LaboratoriesInc.Hercules,CA,美国)。对所述经溶解的蛋白质(20-40μg)进行10％SDS-PAGE，所述经溶解的蛋白质通过电泳转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore Corp.,Bedford,MA,美国)。待进行印迹法后，用5％脱脂乳(MB细胞，洛杉矶，CA，美国)隔离所述膜2小时，而后在4℃下与一抗(primary antibody，山羊抗小鼠IgG-HRP)孵化一夜。此后，使所述膜与二抗(山羊抗兔IgG HRP交联二抗)进行孵化，然后通过用化学荧光检测试剂盒(AmershamPharmacia Biotech，皮斯卡塔韦，新泽西州)来检测所述抗体结合蛋白质。作为对照组，测量β-肌动蛋白的表达水平。该数据表示从重复两次的独立实验中获得的值。

采用对已报道的方法(Ishihara Y et al.,The journal of antibiotics(Tokyo)1991；44:25-32；An SM,Koh JS,Boo YC,Phytotherapy Research 2010；24:1175-1180)进行轻微改变，进行体外酪氨酸酶分析。简言之，将250μl的0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.8)置入24孔板中，并在每孔中加入25μl源自蘑菇的酪氨酸酶(2,000单位/mL)、25μl样品和225μl蒸馏水。然后，将板置于25℃下孵化10分钟，而后在475nm下通过使用酶标仪(Sunrise-Basic Tecan，奥地利)来测定每孔的光密度。各测量值是用相对于对照组的变化率(％)来表示的。L-酪氨酸用作底物，而熊果苷用作阳性对照组。其结果用相对于未处理对照组的相对酪氨酸酶活性来进行表示。

如图9所示，表明与由α-MSH诱导的酪氨酸酶表达相比，用100μg/mL的L-AHG处理所述HEMs时，在所述HEMs中的由α-MSH诱导的酪氨酸酶表达有显著降低。

此外，可确定的是，与经L-AHG处理后的酪氨酸酶表达的降低类似(图9A)，在所述HEMs中的TRP-1表达会以L-AHG浓度依赖性方式降低(图10)。

其次，通过利用无细胞分析系统来检测L-AHG对酪氨酸酶的效果。众多报告公开了，由于源自蘑菇的酪氨酸酶能够以片剂形式进行使用，从而起初被用作模型。作为L-酪氨酸的竞争性抑制剂的熊果苷被用作阳性对照组，抑制了蘑菇中的酪氨酸酶活性(图11)。其结果用相对于无处理对照组的相对酪氨酸酶活性来进行表示。该数据表示从重复三次的独立实验中获得的平均值±S.D.，为了单一统计比较而使用了学生t试验。作为统计学意义的标准，使用了显着性值p<0.05。星号表示相对于未处理对照组的显著差异(p<0.05)。

如图11所示，表明L-AHG没有诱导在蘑菇中的酪氨酸酶活性的明显降低，然而熊果苷在浓度200μM下能够诱导酪氨酸酶活性下降至40％。

总而言之，其结果提示L-AHG为能够抑制酪氨酸酶和TRP-1的表达的新型色素减退制。

<实施例9>人角质细胞中3,6-脱水-L-半乳糖的保湿效果的实验透明质酸(HA)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺组成的糖胺聚糖。由于其贮存大量水分的能力，HA在调节水分和渗透压中起重要作用。HA是在细胞膜中由HAS1、HAS2和HAS3合成的。尤其，在正常人组织中发现了HAS2。据现有研究显示，HAS2的遗传缺陷引发小鼠模型中胎儿期的致死率，而且在成年人人皮肤的表皮和真皮中表达水平降低的HAS2基因。因此，提高HAS2表达是用于维持皮肤平衡的良好策略。为了测量对HAS2表达的诱导时间和L-AHG浓度，进行免疫印迹法。用于该目的的细胞为HaCaT细胞，而且在37℃、5％CO₂下的添加有10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM培养基(

Invitrogen,Auckland,NZ)内进行孵化。

在6-cm培养皿中将所述细胞(1×10⁵)孵化24小时，然后在无血清培养基中禁食下再孵化24小时，以消除FBS对激酶的激活的影响。此后，用一定浓度的3,6-脱水-L-半乳糖(L-AHG)处理所述细胞一定时间。然后，将所述细胞溶解于溶解缓冲液[20mM的Tris-HCl(pH7.5)、150mM氯化钠、1mM的Na₂EDTA、1mM的EGTA、1％Triton X-100、2.5mM磷酸钠、1mM的β-甘油磷酸、1mM的Na₃VO₄、1g/mL亮肽素、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂混合物片剂(protease inhibitor cocktail tablet)]中。根据制造商的说明书，通过使用染料结合蛋白检测试剂盒来测定所述蛋白质的浓度(Bio-Rad Laboratories Inc.Hercules,CA,美国)。对所述经溶解的蛋白质(20-40μg)进行10％SDS-PAGE，所述经溶解的蛋白质通过电泳转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore Corp.,Bedford,MA,美国)。待进行印迹法后，用5％脱脂乳隔离所述膜2小时，而后在4℃下与一抗(山羊抗小鼠IgG-HRP)孵化一夜。此后，使所述膜与二抗(山羊抗兔IgG HRP交联二抗)进行孵化，然后通过用化学荧光检测试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，皮斯卡塔韦，新泽西州)来检测所述抗体结合蛋白质。该数据表示从重复两次的独立实验中获得的值。

如图12所示，表明经处理3小时后，L-AHG提高了所述HAS2表达。此外，可确定的是，L-AHG是以浓度依赖方式提高所述HAS2表达的。

据报道，通过各种炎症信号转导通路，如MAPKs和AKT，可调节HAS2表达。因此，测定了在各种炎症信号转导通路中的L-AHG的效果。

如图13所示，表明经处理3小时后100μg/mL的L-AHG显著地提高了ERK的磷酸化。为了测量L-AHG对ERK磷酸化的浓度依赖性效果，用25、50和100μg/mL的L-AHG处理所述细胞。与由L-AHG诱导的HAS2表达类似(图13B)，表明ERK磷酸化是以L-AHG浓度依赖性方式得到提高的。

如图14A所示，表明经处理3小时后100μg/mL的L-AHG显著地提高了AKT的磷酸化。为了测量L-AHG对AKT磷酸化的浓度依赖性效果，用25、50和100μg/mL的L-AHG处理所述细胞。而且，表明L-AHG是以浓度依赖性方式提高AKT磷酸化的(图14B)。

综述，其结果显示，由L-AHG诱导的ERK和AKT的磷酸化能够提高通过L-AHG的HAS2表达。

工业应用性

根据本发明的示例性实施例，3,6-脱水-L-半乳糖可用作美白制剂、保湿制剂、抗氧化剂、色素减退制剂或抗炎症制剂。